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1、 第六章 细菌实验诊断技术与质量控制一、 教学大纲要求1、 掌握临床常见标本的细菌学检验程序和方法2、 掌握细菌学检验验的形态学检检查方法3、 掌握细菌的分离离培养技术和和方法4、 掌握细菌代谢产产物检测与鉴鉴定技术5、 掌握细菌检验的的质量控制6、 了解细菌感染的的分子生物学学检测技术、细菌感染免疫学检测、细菌毒素的检测、细菌自动化检测技术。二、 教材内容精要（一）标本采集集、处理与检检测标本采集的基本本原则：尽早早采集、根据据可疑的病原原体，选择不不同采集时机机和标本种类类、在抗生素素应用前采集集、遵守无菌菌操作、正确确保存和运送送。容器应密密封不易碎，标标本不得污染染容器的口和和外壁。1
2、.血液标本 正常人的的血液是无菌菌的。当细菌菌侵入时可引引起严重的菌菌血症或败血血症。 一般情况下在在患者发热初初期或发热高高峰时采集；持续性菌血血症可随时采采集；间歇性性菌血症，应应预测其体温温上升期进行行采血。一般般在使用抗生生素前采集223次；多多部位采集，如如两侧肘静脉脉或动、静脉脉同时采取；对于已使用用抗生素而无无法停止的患患者，也应在在下次用药前前采取。在感感染局部的附附近血管中采采血，可提高高阳性率。采采血量成人一一般5100ml，婴幼儿儿12mll。采集的血液标本本注入培养瓶瓶中先进行增增菌培养，培培养基和血液液标本量的比比例应100：1，将血血液中的各类类杀（抑）菌菌物质充分
3、稀稀释。需氧菌菌常用培养基基有胰酪蛋白白大豆胨肉汤汤和葡萄糖酚酚红肉汤等，常常加入对氨基基苯甲酸（PPABA）550g/ml中中和磺胺类，青青霉素酶2单单位/ml破破坏青霉素类类，硫酸镁中中和链霉素、四四环素、土霉霉素、金霉素素、新霉素及及多粘菌素等等抗生素。加加入0.0330.055%的聚茴香香磺酸钠（ssodiumm polyyanethhol suulfonaate, SSPS）可抑抑制血清中的的抗菌物质，并并对氨基糖苷苷类和多肽类类抗生素有灭灭活效果。并并加入、因子等生长因因子。培养瓶每天观察察一次。如发发现培养瓶内液液体浑浊；血球层上面面出现颗粒状状的生长物，并并且有自下而而上的溶血
4、；有明显的凝凝块；液体表面有有菌膜，培养养液清晰或浑浑浊等，表明明有细菌生长长。直接进行行涂片染色初初步报告。同同时分别接种种血平板、巧巧克力（色）平平板，普通培培养和5%CCO2 35培养。也可可直接进行体体外药敏试验验。无细菌生生长迹象的培培养瓶孵育至至第7d，接种血平平板、巧克力力（色）平板板，分别进行行普通培养和和5%CO22环境35孵育24h。为了提高高检出的速度度，在培养的的第23d时应移种一一次。有厌氧菌感染时时，同时注入入需氧瓶和厌厌氧瓶，厌氧氧培养基通常常用硫乙醇酸酸盐培养基、牛牛心脑浸液肉肉汤等；培养养液中有刃天天青，无氧时时无色，有氧氧时呈红色。需需氧瓶和厌氧氧瓶同时浑浊
5、浊，或需氧瓶瓶无生长而厌厌氧瓶液体浑浑浊，提示厌厌氧菌生长。分分别接种血平平板和厌氧血血平板，置需需氧和厌氧环环境中，如果果都只生长11种细菌，则则为兼性厌氧氧菌；如果仅仅在厌氧环境境中生长，可可以直接报告告“有厌氧菌检检出”。若长期应用抗细细胞壁类抗生生素，应考虑虑细菌L型存存在，将血液液接种高渗培培养基中，分分别进行需氧氧、厌氧和55%CO2环境培养。每每周移种23次于高渗渗固体培养基基上，观察有有无细菌L型型菌落生长。2.呼吸道标本本正常上呼吸道有有正常菌群。下下呼吸道正常常情况下无细细菌或仅有少少量细菌侵入入咽拭子直接涂片片检查 怀怀疑白喉的标标本，应立即即进行涂片革革兰染色和异异染颗
6、粒染色色。如发现有有呈Y、V、TT等排列的棒棒状杆菌，有有异染颗粒时时可报告“找到有异染染颗粒的革兰兰阳性杆菌”。也可用特特异性的荧光光染色法检查查A群溶血性性链球菌和百百日咳鲍特菌菌。培养检查 接种种血平板，观观察细菌的生生长情况。有有无特别的菌菌落生长，如如为上呼吸道道的正常菌群群，比例大致致正常，则报报告“未检出致病病菌”；如果某一一种菌群明显显占多数或接接近纯培养，应应考虑该菌与与疾病有关，鉴鉴定后报告。呼吸道标本特殊殊菌的培养 百日咳鲍鲍特菌接种在在鲍-金（BBorderr-Genggou）平板板；白喉棒状状杆菌接种吕吕氏血清斜面面或鸡蛋培养养基，同时接接种亚碲酸钾钾血平板；脑脑膜炎
7、奈瑟菌菌带菌者的鼻鼻咽拭子355保温运送，尽尽快接种在335预温的卵黄双双抗平板上，置置35%CCO2环境中355孵育24h。流感嗜血血杆菌用巧克克力平板或选选择性平板。化化脓性A群链链球菌的接种种血平板，在在接种原始区区贴一张0.04U的杆菌肽纸纸片作为A群群链球菌存在在的指示。痰液标本，采集集晨痰为好。观观察标本的性性状，选取脓脓血性的部分分，如发现有有颗粒、菌块块及干酪样物物，可能是放放线菌或真菌菌感染。有异异常恶臭，与与厌氧菌有关关。直接涂片染色检检查发现，以以柱状上皮细细胞为主，有有中性白细胞胞及细菌，则则可根据形态态和染色性直直接报告，并并且作为分离离细菌时选择择培养基的依依据。如
8、果以以鳞状上皮细细胞为主，很很少发现白细细胞，则为不不合格标本。如如有颗粒、菌菌块及干酪样样物也应进行行涂片检查，发发现具有典型型的真菌或放放线菌样的菌菌落特点，可可直接报告“找到真菌（放放线菌）”。痰液标本在分离离接种前一般般进行前处理理，方法有均均质化和洗净净法。痰液标标本至少同时时接种血平板板、巧克力平平板和EMBB（或Macc Conkkey平板）。3.尿液标本正常人的尿液是是无菌的，女女性月经期间间容易污染，不不宜采集。尿液的采集方法法有：中段尿尿采集法、肾肾盂尿采集法法、膀胱穿刺刺法，膀胱穿穿刺法一般用用于厌氧菌培培养的标本采采集或不能正正确留取中段段尿而需确定定诊断的儿童童。尿液
9、标本检验 采用定量量培养的方法法进行尿液菌菌落计数区别别污染和病原原菌。一般认认为尿液中的的菌落数1105/ml为病病原菌，1104/ml为污染染菌，104/ml为可可疑需重新复复查，重新复复查后仍为同同样结果，则则应视为病原原菌。会受到到尿量、尿液液在膀胱中停停留的时间长长短及使用利利尿剂等影响响。计数的方方法有：平板板涂布法、倾倾注培养法和和标准接种环环法。一般接种血平板板和EMB（或或Mac CConkeyy平板），或或CLED平平板。尿液细细菌L型较为为常见，可同同时接种L型型平板。尿液标本的快速速检验 用用于尿液快速速细菌检验的的方法有硝酸酸盐还原法、氯氯化三苯四氮氮唑（TTCC）还
10、原法、尿尿中抗体包被被细菌法和产产色培养基法法等。4.脑脊液标本本正常人的脑脊液液是无菌的。脑脊液标本的采采集 以无无菌手续通过过腰椎穿刺采采集脑脊液335ml，应应立即送检或或床边接种。应应在35保温运送。直接涂片检查 由细菌引引起的化脓性性脑膜炎一般般呈现混浊，在在抗生素治疗疗后亦可不混混浊。此外结结核性脑膜炎炎、无菌性脑脑膜炎等也不不混浊。可直接涂片革兰兰染色检查，不不混浊的可33000r/min离心心1015min后取沉沉淀涂片染色色检查。如发发现革兰阴性性、凹面相对对的双球菌，位位于中性白细细胞内外，则则可报告“找到革兰阴阴性双球菌，位位于细胞内（外外），疑似脑脑膜炎奈瑟菌菌”；有革
11、兰阳阳性矛头状的的双球菌，菌菌体周围有明明显的荚膜，可可报告“找到革兰阳阳性双球菌，疑疑似肺炎链球球菌”。用肺炎链链球菌全价抗抗血清进行荚荚膜肿胀试验验，阳性者可可报告“荚膜肿胀试试验检出肺炎炎链球菌”；发现其他他形态的细菌菌，可根据形形态和染色性性进行报告。涂涂片阳性的标标本最好进行行标本的直接接药敏试验。应立即接种在335预保温的血血平板和巧克克力平板上,置510%COO2环境35培养1824h。脑脊液标标本一般经33d培养仍未见见细菌生长，可可报告“经3天培养养无细菌生长长”。脑脊液标本特殊殊病原菌的检检验结核分枝杆菌 将脑脊液液4000rr/min离离心30miin，取沉淀淀抗酸染色；
12、或将脑脊液液在室温下静静置1824h，待形成纤纤维网后，倾倾倒在洁净玻玻片上抗酸染染色。或用金金胺“O”进行荧光染染色观察。取取沉淀接种罗罗-琼培养基基进行结核分分枝杆菌的培培养。新型隐球菌 将脑脊液离离心沉淀后，进进行墨汁负染染，可在黑色色背景中观察察到折光性很很强的菌体和和周围似晕轮轮样的透明荚荚膜，有时可可见到生芽的的新型隐球菌菌。5.粪便标本的的采集 粪粪便标本于急急性腹泻期及及未使用抗生生素之前采取取自然排出的的粪便，挑选选粘液、脓血血部分，置无无菌容器、保保存液或增菌菌培养基中。可可用肛门拭子子。不能立即即送检的标本本应放入Caary-Bllair运送送培养基中。（1）直接涂片片检
13、查 临临床怀疑是霍霍乱弧菌、结结核分枝杆菌菌感染或菌群群失调需要大大致估计菌群群比例、二重重感染（伪膜膜性肠炎、真真菌性或葡萄萄球菌性肠炎炎）时进行直直接涂片染色色检查。霍乱弧菌的涂片片检查 取取“米泔水”样粪便或肛肛门拭子涂片片2张，干燥燥后用乙醇或或甲醇固定，分分别进行革兰兰染色和1：10稀释石石炭酸复红染染色，用油镜镜观察有无革革兰阴性、鱼鱼群样排列的的弧菌。另外外也可进行悬悬滴法动力试试验和制动试试验。菌群失调及菌交交替症 取取粪便标本直直接涂片，进进行革兰染色色油镜观察，根根据菌群的形形态和染色特特征可大致描描述菌群的情情况。疑为伪伪膜性肠炎的的患者标本中中如发现大量量革兰阳性呈呈葡
14、萄状排列列的球菌，则则可报告“找到革兰阳阳性呈葡萄状状排列的球菌菌”；如发现革革兰阳性粗大大杆菌、无荚荚膜，通常有有位于菌体一一端的卵圆形形芽胞者，可可报告“找到革兰阳阳性芽胞杆菌菌，疑似艰难难梭菌”。结核分枝杆菌 取半个指指甲大小粪便便块，与饱和和盐水1015ml搅搅和，静置，112h后取最上层层液体作涂片片，进行抗酸酸染色检查。（2）分离培养养沙门菌属和志贺贺菌属 直接接种种肠道强选择择性培养基（SSS琼脂、木木糖赖氨酸去去氧胆酸钠琼琼脂）和弱选选择性培养基基（如Macc Conkkey、EMMB、中国蓝蓝琼脂）各11个；携带者者的检查，可可将粪便标本本接种于GNN增菌液（适适用于沙门菌菌
15、属和志贺菌菌属）和亚硒硒酸盐或四硫硫磺酸盐增菌菌液（适用于于沙门菌属）增增菌后转种于于肠道强和弱弱选择性培养养基上观察菌菌落特征。霍乱弧菌 可疑疑标本接种于于碱性蛋白胨胨水中进行335增菌，同时时接种含糖双双洗平板、庆庆大霉素琼脂脂平板或TCCBS琼脂平平板。增菌培培养6h后，取增菌菌液表层菌膜膜移种于上述述平板中进行行分离培养，同同时取增菌液液作革兰涂片片染色和悬滴滴法动力试验验和制动试验验。副溶血性弧菌 取可疑粪粪便（或可疑疑食物）接种种于副溶血性性弧菌增菌液液中，同时划划线接种于副副溶血性弧菌菌选择性平板板和SS平板板上。肠致病性大肠埃埃希菌 取取可疑粪便标标本接种在中中国蓝平板（或或M
16、ac CConkeyy平板或EMMB平板）。小肠结肠炎耶尔尔森菌 将将可疑标本接接种于新耶尔尔森菌选择培培养基（NYYE）、Maac Connkey及SSS琼脂平板板。带菌者可可将标本接种种于1/155mol/LpH7.47.8的PBSS中，在4进行冷增菌菌。空肠弯曲菌 取可疑粪便便或在Carry-Bair运送送培养基中的的粪便标本接接种于Cammp-BAPP血琼脂或Skkirroww血琼脂，或接种于CCEM增菌液液在微需氧环环境下培养11824小时后后接种上述平平板，在微需需氧环境下培培养4248h。菌群失调及菌交交替症 要要对粪便中的的所有菌群进进行观察，将将粪便定量接接种在肠道选选择性培
17、养基基、需氧和厌厌氧血平板，甘甘露醇盐琼脂脂，沙保弱培培养基等，观观察各菌群的的生长情况，进进行鉴定后报报告各菌群比比例。怀疑艰艰难梭菌的菌菌交替症时，如如为黄色、夹夹有伪膜的粪粪便应立即接接种CCFAA平板，进行行厌氧培养。如如为绿色、海海水样粪便，应应怀疑为金黄黄色葡萄球菌菌感染，接种种甘露醇盐琼琼脂，有黄色色菌落按葡萄萄球菌鉴定。如如为真菌性腹腹泻，常发生生在抗生素使使用之后，将将标本接种在在沙保弱培养养基及血平板板上，进行鉴鉴定。6.生殖道标本本男性尿道、生殖殖器分泌物 用无菌棉棉签将脓液采采集在无菌试试管中。由临临床医师从肛肛门进行前列列腺按摩，收收集前列腺液液。女性生殖道标本本 直
18、视采采集阴道后穹穹隆分泌物。盆盆腔脓肿的患患者应消毒阴阴道后从后穹穹隆穿刺抽取取脓液。子宫宫分泌物的采采集采用双套套管的方式插插入子宫腔吸吸取分泌物。外阴分泌物 对外阴部位位的硬下疳,从其溃疡底底部挤出少许许组织液，以以洁净玻片直直接沾取，加加盖玻片后送送检。涂片检查 对对一般细菌和和淋球菌的检检查用革兰染染色；梅毒螺螺旋体用暗视视野显微镜或或镀银染色法法检查；结核核分枝杆菌进进行抗酸染色色。培养检查 一一般细菌培养养用血平板和和Mac CConkeyy平板各一个个；培养淋病病奈瑟菌需要要巧克力平板板或卵黄双抗抗平板.7.脓液、胸腹腹水及分泌物物等其它标本本封闭性脓肿直接接穿刺；疑为为厌氧菌感
19、染染者，应立即即将注射器内内的空气排空空，将针头插插入橡皮塞中中隔绝空气；开放性脓肿肿或瘘管从深深部采取标本本。标本直接接涂片革兰染染色发现细菌菌可以直接报报告，然后用用血平板接种种培养。胸、腹腹水通过胸腔腔或腹腔穿刺刺获得，注入入无菌试管中中送检。（二）细菌形态态检查显微镜是观察细细菌形态的必必备仪器。分分为光学显微微镜和电子显显微镜。光学学显微镜有普普通光学显微微镜、暗视野野显微镜、相相差显微镜、荧荧光显微镜等等。1.不染色可以以观察细菌的的动力及运动动等活体状况况，由于细菌菌的折光性不不强，不能清清楚的看到细细菌的形态特特征和结构。标本的制作悬滴滴法、压滴法法和毛细管法法，后者主要要用于
20、厌氧菌菌的动力观察察。用普通光光学显微镜、暗暗视野显微镜镜或位相差显显微镜观察。2.染色标本的的形态检查细菌的染色可能能是由于毛细细管现象和染染料的渗透作作用、染料的的溶解和吸收收作用使染料料进入细胞内内，或由于电电荷的吸附和和结合使细菌菌着色。也可可能与细菌细细胞内的化学学成分有关。此此外细菌的染染色性与细菌菌细胞膜的通通透性、细胞胞结构的完整整性，以及培培养基的种类类、菌龄，染染色液的离子子强度、pHH，染色温度度等密切相关关。医学检验中常用用的染料：酸性染料 细细菌一般情况况下都带负电电荷，故酸性性染料一般不不着色。如刚刚果红、伊红红等。碱性染料 细细菌一般情况况下都带负电电荷，因此能能
21、与细菌结合合，细菌学检检查中常用此此类染料。如如美蓝、结晶晶紫和碱性复复红等。复合染料 如如姬姆萨染料料，是碱性和和酸性染料的的复合物。单纯染料 如如苏丹类染料料，溶于脂肪肪溶剂中，不不溶于水，化化学亲和力低低。3.染色方法应先制作细菌涂涂片。方法有有单染色法和和复合染色法法。（1）革兰染色色法 染液液由革兰结晶晶紫染液、革革兰碘液、995%酒精和和稀释石炭酸酸复红（沙黄黄）组成。革革兰阳性菌为为紫色，革兰兰阴性菌呈红红色。影响因素：涂片片过厚将使脱脱色不完全，酒酒精脱色时间间过长将导致致过度脱色；染液储存过过久由于蒸发发而影响浓度度，特别是碘碘液久存或见见光而形成碘碘酸，失去媒媒染作用；99
22、5%酒精如如果密封不佳佳易挥发，失失去脱色作用用；细菌形态态学检查以对对数生长期的的细菌形态最最为典型，菌菌龄过长易致致阴性。（2）抗酸染色色法 染液液由石炭酸复复红、3%盐盐酸酒精和美美蓝组成。抗抗酸菌呈红色色，非抗酸菌菌和细胞呈蓝蓝色。本法主要用于结结核分枝杆菌菌和麻风分枝枝杆菌的检查查，每张载玻玻片上只能涂涂1份标本，最最好使用新玻玻片，否则必必须彻底清洗洗干净。染色色使不得使用用染色缸，吸吸水纸1片11张不得重复复使用。脱色色时间不得过过短。为了防防止实验室感感染可将标本本先进行高压压蒸气灭菌，然然后进行抗酸酸染色。三、细菌的接种种与分离培养养（一） 培养基培养基是供细菌菌生长用的，由
23、由人工方法将将多种营养物物质根据各种种细菌的需要要而组合成的的混合营养基基质。培养基的基本成成分有营养物物质、凝固物物质、抑制剂剂和指示剂。常常用的营养物物质有：蛋白白胨、肉浸液液、牛肉膏、各各种糖类、血血液、无机盐盐、鸡蛋和动动物血清、生生长因子等。最最常用凝固物物质为琼脂1100ml培养基中中加入222.5g琼脂可制成成固体培养基基；100mml培养基中中加入0.330.5gg琼脂可制成成半固体培养养基。有时也也使用明胶、卵卵白蛋白、血血清等作为赋赋形剂。常用用的抑制剂有有胆盐、煌绿绿、玫瑰红酸酸、亚硫酸钠钠、亚硒酸钠钠、一些染料料和某些抗生生素。培养基基中加入的指指示剂有酚红红、中性红、
24、甲甲基红、酸性性复红、溴甲甲酚紫、溴麝麝香草酚蓝等等酸碱指示剂剂和美蓝作为为氧气指示剂剂。根据其形状分为为固体、液体体和半固体培培养基；按用用途可分为基基础培养基、增增菌培养基、选选择培养基、厌厌氧培养基、鉴鉴别培养基等等；按成分可可分为合成培培养基和天然然培养基。（二）细菌的培培养方法普通培养法 普通培养法法是指需氧菌菌或兼性厌氧氧菌等在普通通大气条件下下的培养方法法，又称需氧氧培养法。若若用明胶培养养基培养细菌菌，应22培养。二氧化碳培养法法 某些细细菌，如脑膜膜炎奈瑟菌、布布鲁菌等在初初分离时，需需在510二氧化碳碳环境中才能能良好生长。二氧化碳培养方法有以下几种：二氧化碳培养箱、烛缸法
25、、化学法。厌氧培养法 常用方法有有厌氧罐法、气气袋法和厌氧氧手套箱等。大大多数厌氧菌菌的初代培养养生长较慢，故故厌氧培养在在37至少应培养养48h。如疑疑为放线菌则则应延长72296h。四、细菌代谢产产物检测与鉴鉴定（一）碳水化合合物的代谢试试验1.糖（醇、苷苷）类发酵试试验 兼性性厌氧菌和厌厌氧菌一般能能发酵糖类。各各种细菌含有有不同糖（醇醇、苷）类的发酵酵酶。不同细细菌分解糖类类后产生的代代谢产物因菌菌种而异。因因此测定细菌菌对糖类的分分解能力和产产生的代谢产产物可以鉴别别细菌。接种种入的细菌若若能分解培养养基中的糖类类产酸时，则则使指示剂呈呈酸性反应。若若产气可使液液体培养基中中的倒管（
26、DDurhamm管）内出现现气泡，或使使半固体培养养基内出现气气泡、裂开等等现象。若不不分解则无变变化。不同细细菌可发酵不不同的糖类，如如大肠埃希菌菌可发酵葡萄萄糖及乳糖。沙沙门菌属则只只发酵葡萄糖糖，不发酵乳乳糖；大肠埃埃希菌和志贺贺菌属均可发发酵葡萄糖，但但前者产酸、产产气，而后者者仅产酸。2.氧化一发酵酵试验（O-F试验）又称HughhLeifsson（HL）试验。细细菌在分解葡葡萄糖的过程程中，必须以以分子氧作为为电子受体的的，称为氧化化型。细菌在在分解葡萄糖糖的过程中，可可以进行无氧氧降解的，称称为发酵型，此此类细菌无论论在有氧或无无氧的环境中中都能分解葡葡萄糖，通常常为兼性厌氧氧菌
27、。不分解解葡萄糖的细细菌，称为产产硷型。挑取取少许纯种细细菌，同时穿穿刺接种两支支HughLeifsson培养基基，其中1支支在接种后，滴滴加高度不少少于1cm的无菌液液体石腊于培培养基上进行行封盖。于335C培养48h以上，观观察结果。培培养基变黄表表示细菌分解解葡萄糖而产产酸，颜色不不变为不分解解葡萄糖。若若两支培养基基均为黄色为为发酵型；均均不变为产硷硷型或不分解解糖型；仅不不加液体石腊腊的培养基管管内变黄为氧氧化型。用于于细菌种属间间的鉴别。肠肠杆菌科细菌菌为发酵型，非非发酵菌通常常为氧化型或或产硷型。此此外微球菌属属可氧化葡萄萄糖，而葡萄萄球菌属则能能发酵葡萄糖糖。3.-半乳糖糖苷酶
28、试验（OONPG试验验）细菌分解解乳糖必须有有半乳糖苷渗渗透酶（gaalact osideepermeease）和和-半乳糖苷苷酶的参加。前者可将乳糖通过细胞壁送到细胞内。后者存在于细菌的细胞内，将进入菌细胞的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。具有上述两种酶的细菌可迅速分解乳糖。迟缓分解乳糖的细菌只有-半乳糖苷酶，缺乏半乳糖苷渗透酶，或是其活性很弱，不能很快将乳糖运送到菌细胞内，所以通常需要几天时间乳糖才被分解。ONPG与乳糖的分子结构相似，且分子较小，不需半乳糖苷渗透酶的运送就可进入菌细胞内，由菌细胞内的-半乳糖苷酶将其分解为半乳糖和黄色的邻位-硝基酚。采用ONPG试验，可将迟缓分解乳糖的细菌迅速取
29、得阳性结果。无色的ONPG经-半乳糖苷酶水解后生成黄色的邻位-硝基酚。迅速及迟缓分解乳糖的细菌如埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属等阳性。而不发酵乳糖的细菌如沙门菌、变形杆菌等均为阴性。4.七叶苷水解解试验 某某些细菌能水水解七叶苷生生成七叶素与与培养基中枸枸橼酸铁的亚亚铁离子起反反应，生成黑黑色的化合物物。将被检菌菌接于七叶苷苷培养基上335孵育1824h。使培养基基变黑为阳性性。克雷伯菌菌属、肠杆菌菌属和沙雷菌菌属能水解七七叶苷，肠球球菌属和D群群链球菌也能能水解七叶苷苷，并耐受胆胆汁。5.淀粉水解试试验 细菌如产产生淀粉酶，可可将培养基中中的淀粉分解解为糖类，滴滴加碘液在培培养基上，在在
30、菌落周围透透明区。将被被检菌划线接接种（或点种种）淀粉血清清琼脂平板，335培养24h，在培养基基上滴加革兰兰碘液，观察察结果。培养养基呈蓝色，菌菌落周围有透透明圈为阳性性。白喉棒状状杆菌可产生生淀粉酶，分分解淀粉。6.甲基红（MMR）试验 细菌在代代谢过程中分分解葡萄糖产产生丙酮酸，某某些细菌可进进一步将丙酮酮酸分解为乳乳酸、乙酸、甲甲酸等，使培培养基的pHH下降至4.5以下，加加入甲基红指指示剂出现红红色（阳性）。有有些细菌分解解葡萄糖产酸酸量少，或产产生的酸进一一步转化为其其它物质如醇醇、酮、醛、气气体和水，则则培养基的酸酸碱度维持在在pH6.22以上，加入入甲基红指示示剂呈黄色（阴阴性
31、）。将被被检菌接种于于葡萄糖蛋白白胨水培养基基内，于355培养24d，加入甲基基红指示剂22滴，立即观观察结果。红红色为阳性；桔红色为弱弱阳性；黄色色为阴性。主主要用于大肠肠埃希菌和产产气肠杆菌的的鉴别，前者者为阳性，后后者为阴性。此此外沙门菌属属、志贺菌属属、枸橼酸杆杆菌、变形杆杆菌等为阳性性，肠杆菌属属、克雷伯菌菌等为阴性。7.V-P试验验 细菌在葡葡萄糖的代谢谢过程中生成成丙酮酸，有有些细菌可将将丙酮酸进一一步脱羧产生生乙酰甲基甲甲醇。乙酰甲甲基甲醇在碱碱性溶液中被被空气中的氧氧氧化为二乙乙酰（丁二酮酮），进而与与培养基中的的精氨酸所含含的胍基发生生反应，生成成红色化合物物，即VP反反应
32、阳性。将将被检菌接种种于葡萄糖蛋蛋白胨水培养养基后，加入入5%-萘酚0.6ml，再再加入40%KOH0.2ml，振振摇后观察结结果。于数分分钟内呈红色色为阳性，如如无红色出现现，而且于335中4h仍无红色者者为阴性。本本试验常与甲甲基红试验一一起使用。前前者为阳性的的细菌，后者者为阴性，反反之亦如此。如如大肠埃希菌菌、沙门菌属属、志贺菌属属等甲基红呈呈阳性反应，VV-P反应则则阴性。相反反，如沙雷菌菌、阴沟肠杆杆菌等，VPP反应阳性，而而甲基红反应应阴性。8.葡萄糖酸氧氧化试验 某些细菌可可氧化葡萄糖糖酸钾，生成成2-酮基葡葡萄糖酸。22-酮基葡萄萄糖酸是一种种还原性物质质，可与班氏氏试剂起反
33、应应，出现棕色色或砖红色的的Cu2O沉淀。接接种细菌至改改良Haynnes培养基基中，48hh后取培养液液1ml，加加入班氏定性性试剂1mll，于水浴中中煮沸10mmin并迅速速冷却。观察察结果。出现现黄到砖红色色沉淀为阳性性。不变或仍仍为蓝色为阴阴性。主要用用于假单胞菌菌的鉴定。(二)、蛋白质质和氨基酸的的代谢试验1.苯丙氨酸脱脱氨酶试验 某些细菌菌可产生苯丙丙氨酸脱氨酶酶，使苯丙氨氨酸脱去氨基基，形成苯丙丙酮酸和游离离的氨，加入入三氯化铁试试剂与苯丙酮酮酸螯合后产产生绿色反应应。大量接种种被检菌于苯苯丙氨酸琼脂脂斜面上，335培养1824h，加入100%三氯化铁铁试剂出现绿绿色为阳性。主主
34、要用于鉴定定变形杆菌属属、摩根菌属属和普罗威登登菌属细菌，均均为强阳性，肠肠杆菌科中其其它细菌均为为阴性。2.氨基酸脱羧羧酶试验 细菌分解氨氨基酸使其脱脱羧基，生成成胺和CO22。各种细菌菌的产生的脱脱羧酶种类不不一样，但氨氨基酸经脱羧羧后所产生的的胺，均可使使培养基变碱碱。最常测定定的氨基酸有有三种：赖氨氨酸、鸟氨酸酸和精氨酸。挑挑取待测菌分分别接种三种种氨基酸培养养基及对照培培养基，于335培养14d，每天检查查一次结果。氨氨基酸测定管管由黄变为紫紫色，黄色为为阴性（仅发发酵葡萄糖）。对对照（无氨基基酸）为黄色色（发酵葡萄萄糖）。沙门门菌属中除伤伤寒和鸡沙门门菌之外，其其余沙门菌属属的鸟氨
35、酸和和赖氨酸脱羧羧酶均阳性。致致贺菌属中除除宋内和鲍氏氏志贺菌外，其其它志贺菌均均阴性。对链链球菌和弧菌菌科细菌的鉴鉴定也有重要要价值。3.精氨酸双水水解酶试验 精氨酸经经两次水解，先先生成瓜氨酸酸和氨，瓜氨氨酸又在瓜氨氨酸酶的作用用下，形成鸟鸟氨酸、氨及及二氧化碳。鸟鸟氨酸又在鸟鸟氨酸脱羧酶酶的作用下生生成腐胺及二二氧化碳。将将被检菌接种种于脱羧酶培培养基培养基基，肠杆菌科科应覆盖灭菌菌液体石蜡。假假单胞菌通常常采用Thoornleyy氏培养基,不加石蜡。指指示剂颜色转转为碱性为阳阳性，即溴甲甲酚紫转为紫紫色，酚红转转为红色。TThornlley氏培养养基通常阳性性在2448h后，最长可可观
36、察至7dd。4.尿素酶试验验 某些细菌菌能产生尿素素酶分解尿素素，产生大量量的氨使培养养基变碱。将将被检菌接种种于相应的尿尿素培养基，于于35培养1824h观察结果。阴阴性时应继续续观察4d。细菌分解解尿素后培养养基变碱，使使酚红指示剂剂变红为阳性性，不变为阴阴性。奇异变变形杆菌和普普通变形杆菌菌、雷极普罗罗威登菌和摩摩根摩根菌阳阳性，斯氏和和产碱普罗威威登菌阴性。5.吲哚试验 细菌分解解蛋白胨中的的色氨酸，生生成吲哚与试试剂中的对二二甲氨基苯甲甲醛作用，生生成玫瑰吲哚哚而呈红色。挑挑取纯培养物物接种蛋白胨胨水培养基，于于35培养12d，沿管壁徐徐徐加入Koovac氏试试剂或欧氏试试剂0.5m
37、ml，使成两两层，观察结结果。两者液液面接触处出出现红色为阳阳性，无色为为阴性。主要要用于肠杆菌菌科细菌的鉴鉴定。6.硫化氢试验验 某些细菌菌能分解培养养基中的含硫硫氨基酸（如如胱氨酸、半半胱氨酸）生生成硫化氢，遇遇铅或亚铁离离子生成黑色色硫化物。将将培养物接种种于醋酸铅或或克氏铁琼脂脂等培养基，经经35培养12d，观察结果果。醋酸铅培培养基变黑色色为阳性，不不变为阴性。克克氏铁琼脂等等培养基，还还原含硫化合合物而产生硫硫化氢，与二二价铁生成黑黑色的硫化亚亚铁，阴性不不产生黑色沉沉淀。肠杆菌菌科中沙门菌菌属、爱德华华菌属、枸橼橼酸杆菌属和和变形杆菌属属细菌，绝大大多数硫化氢氢阳性，其它它菌属阴
38、性。此此外，腐败假假单胞菌、口口腔类杆菌和和某些布鲁菌菌硫化氢也阳阳性。7.明胶液化试试验 明胶酶是是细菌产生的的一种胞外酶酶，能分解明明胶为氨基酸酸，从而失去去凝固力，使使半固体的明明胶培养基成成为流动的液液体。将被检检菌穿刺接种种于明胶培养养基，于200培养7d，逐日观察察结果。如室室温高培养基基自行溶化时时，可于冰箱箱内放置300min，不再再凝固为阳性性。沙雷菌、普普通变形杆菌菌、奇异变形形杆菌、阴沟沟肠杆菌等可可液化明胶，肠肠杆菌科其它它细菌很少液液化明胶。金金黄色葡萄球球菌、铜绿假假单胞菌、荧荧光假单胞菌菌、腐败假单单胞菌也能产产生明胶酶。有有些厌氧菌如如产气荚膜梭梭菌、脆弱类类杆
39、菌等也能能液化明胶。(三)、 碳源源和氮源利用用试验1.枸橼酸盐利利用试验 当细菌利用用铵盐作为唯唯一氮源，并并能利用枸橼橼酸盐作为唯唯一碳源时，可可在枸橼酸盐盐培养基上生生长分解枸橼橼酸钠，使培培养基变碱。在在枸橼酸盐琼琼脂斜面上浓浓密划线，大大量接种被检检菌，于355培养14d，逐日观察察结果。枸橼橼酸盐培养基基斜面上有细细菌生长，培培养基变蓝为为阳性；无细细菌生长、颜颜色不变（绿绿色）为阴性性。埃希菌属属、志贺菌属属、爱德华菌菌属和耶尔森森菌属均为阴阴性，沙门菌菌属、克雷伯伯菌属、粘质质和液化沙雷雷菌及某些变变形杆菌以及及枸橼酸杆菌菌阳性。此外外，铜绿假单单胞菌、洋葱葱假单胞菌和和嗜水气
40、单胞胞菌也能利用用枸橼酸盐。2.丙二酸盐利利用试验 细菌利用丙丙二酸盐作为为唯一碳源时时，丙二酸钠钠可被分解生生成碳酸钠，使使培养基变碱碱。将被检菌菌接种于丙二二酸盐培养基基，于35培养2448h后观察结果果.培养基由绿绿色变为蓝色色为阳性，颜颜色无变化为为阴性。3.醋酸盐利用用试验 细菌可利利用铵盐作为为唯一碳源，同同时利用醋酸酸盐作为唯一一碳源时，可可在醋酸盐培培养基上生长长，同时生成成碳酸钠，使使培养基变为为碱性。将被被检菌接种于于醋酸盐培养养基的斜面上上，于35培养7d，逐日观察察结果。斜面面上生长有菌菌落，培养基基变为蓝色为为阳性。肠杆杆菌科中埃希希菌属为阳性性，志贺菌属属为阴性。铜
41、铜绿假单胞菌菌、荧光假单单胞菌、洋葱葱假单胞菌等等也为阳性。4.马尿酸盐水水解试验 B群链球菌菌具有马尿酸酸水解酶，可可使马尿酸水水解为苯甲酸酸和甘氨酸。苯苯甲酸与三氯氯化铁试剂结结合，形成苯苯甲酸铁沉淀淀。甘氨酸在在茚三酮（强强氧化剂）的的作用下，经经氧化脱氨基基反应，生成成氨、二氧化化碳和相应的的醛，而茚三三酮则生成了了还原型茚三三酮。反应过过程中形成的的氨和还原型型茚三酮，与与残留的茚三三酮起反应，则则形成了紫色色化合物。(四)、呼吸酶酶类试验1.氧化酶试验验 氧化酶或或称细胞色素素氧化酶，是是细胞色素呼呼吸酶系统的的终末呼吸酶酶。作氧化酶酶试验时，此此酶首先使细细胞色素C氧氧化，然后氧
42、氧化型细胞色色素C再使对对苯二胺氧化化，产生颜色色反应。本试试验肠杆菌科科阴性，弧菌菌科、非发酵酵菌阳性（除除个别菌种外外）、奈瑟菌菌属均阳性。 2.过氧化氢酶酶试验 黄酶系统统的呼吸酶最最后把氢交给给分子氧而形形成过氧化氢氢，过氧化氢氢对活细胞有有毒，过氧化化氢酶的作用用是使过氧化化氢分解为分分子态氧。于于半分钟内大大量气泡产生生者为阳性，不不产生气泡者者为阴性。绝绝大多数细菌菌均可产生过过氧化氢酶。但但链球菌属的的触媒阴性，金金氏杆菌属细细菌的触媒也也阴性。3.硝酸盐还原原试验 硝酸盐还原原试验包括两个个过程：其一一是在合成代代谢过程中，硝硝酸盐还原为为亚硝酸盐和和氨，再由氨氨转化为氨基基
43、酸和细胞内内其它含氮化化合物；其次次是在分解代代谢过程中，硝硝酸盐或亚硝硝酸盐代替氧氧作为呼吸酶酶系统中的终终末受氢体。硝硝酸盐还原的的过程可因细细菌不同而异异，大肠埃希希菌等仅使硝硝酸盐还原为为亚硝酸盐；假单胞菌等等能使硝酸盐盐或亚硝酸盐盐还原为氮；有的细菌则则可使其还原原为亚硝酸盐盐和离子态的的铵。硝酸盐盐或亚硝酸盐盐如果还原生生成气体的终终末产物如氮氮或氧化氮，就就称为脱硝化化或脱氮化作作用。硝酸盐盐还原试验系系测定还原过过程中所产生生的亚硝酸.接种硝酸盐盐培养基后于于35培养14d，将硝酸盐盐还原试剂甲甲液和乙液的的等量混合液液（用时混合合）0.1mml加于试管管内，立即或或10min
44、n内观察结果果。（1）出出现红色为阳阳性。（2）如如欲检查有无无氮气产生，可可于培养基内内加1只小倒倒管（Durrham管），如如有气泡产生生，表示有氮氮气生成。（33）如加入硝硝酸盐还原试试剂不出现红红色，需检查查硝酸盐是否否被还原，可可于原试管内内再加入少许许锌粉，如出出现红色表示示硝酸盐仍然然存在。若仍仍不产生红色色，表示硝酸酸盐已被还原原为氨和氮。肠肠杆菌科细菌菌均能还原硝硝酸盐为亚硝硝酸盐，铜绿绿假单胞菌、嗜嗜麦芽假单胞胞菌等可产生生氮气。五、细菌感染免免疫学检测 细菌感感染后宿主体体内抗体的检检测方法有：辅助诊断肠肠热症的肥达达试验，辅助助诊断立克次次体病的外斐斐试验，诊断断钩端螺
45、旋体体感染的显微微镜凝集试验验等直接凝集集试验。酶联联免疫吸附试试验，胶乳凝凝集试验。细菌抗原的测定定方法有：凝凝集试验：玻玻片法凝集试试验、胶乳凝凝集法、协同同凝集试验、反反向间接血凝凝试验。免疫疫荧光技术：直接法、间间接法。荚膜膜肿胀试验。酶酶联免疫吸附附试验。非特异性凝集素素的测定有：与原发性非非典型性肺炎炎相关的冷凝凝集试验；用用于诊断传染染性单核细胞胞增多症的嗜嗜异性凝集试试验。六、细菌感染的的分子生物学学检测（一）常用的分分子生物学技技术1.核酸杂交 常用的杂杂交技术有：斑点杂交、ssoutheern印迹、原原位杂交、NNortheern印迹等等。探针的种种类有全染色色体DNA探探
46、针、染色体体克隆片段DDNA探针、质质粒DNA探探针、rRNNA基因探针针、寡核苷酸酸探针等。2.核酸扩增技技术 核酸酸扩增技术是是分子生物学学中最具有重重大意义的技技术之一。对对核酸进行扩扩增的方法很很多，如聚合合酶链反应（polymerase chain reaction ,PCR）、连接酶链反应、自保留序列扩增及Q-beta扩增等。以聚合酶链反应最为广泛应用。PCR技术在细细菌的快速检检测、细菌的的毒素基因检检测、细菌的的耐药性检测测及感染细菌菌的流行病学学调查中得到到日益广泛的的应用。生物芯片是新近近发展的一项项对基因、蛋蛋白质、细胞胞及其他生物物组分进行大大信息量分析析的检测技术术。
47、常用的有有基因芯片（gene chipss）和蛋白芯片片(prottein cchips)。目前正在在研制和评价价中。（二）鉴定感染染细菌种属的的方法1.细菌种属的的鉴定DNA碱基组成成的测定 G+C mol%含量量不同的细菌菌，为不同种种细菌；含量量相同的可能能为不同种的的细菌。细菌菌的G+C mol%相当当稳定，不受受培养条件、菌菌龄和其他外外界因素影响响。最常用的的方法是热变变性法。DNA-DNAA杂交 DNNA杂交可得得出DNA之间核核苷酸顺序的的互补程度，从从而推断不同同细菌基因组组间的同源性性。16S rRNNA同源性分分析 rRRNA-DNNA杂交、16S rRNA序列列测定、1
48、66S-23SS rRNAA序列测定 此外限制性内切切酶长度多态态性分析（RRFLP）、脉脉冲场凝胶电电泳（PFGGE）、随机机引物扩增法法（RAPDD）等技术常常用于菌株间间的差异比较较。2.细菌种属特特异基因某些基因为细菌菌种特有或属属共有，通过过对这些基因因的检测可以以鉴定细菌的的种或属。如如编码吸附和和侵袭上皮细细胞表面蛋白白的inv基因：invA、invB、invC、invD、invE等是是一组只存在在于致病性沙沙门菌中的独独特的保守基基因序列。鞭鞭毛蛋白dllh基因通常常只存在于伤伤寒沙门菌；IS61110、IS9986插入片片段为结核分分枝杆菌复合合群所拥有等等。3.细菌毒力基基因可以测定霍乱弧弧菌的霍乱毒毒素基因、产产肠毒素大肠肠埃希菌的耐耐热（ST）和和不耐热肠毒毒素（LT）以以及白喉棒状状杆菌的外毒毒素基因以示示相应的细菌菌存在。（三）细菌耐药药性的分子生生物学检测1.内酰胺类类抗生素的耐耐药