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1、常用的CTAB法抽提叶片DNA1. 称取适当重量的叶片组织于研钵中，加入适量石英砂和PVP, 在液氮中将之研磨成细粉。2.将粉末快速转移至2 ml EP管中，加入800l预热的2 % CTAB抽提缓冲液溶液，但总体积不应超过管容积的一半。3. 65水浴60-90min，每隔5-10分钟颠倒混匀一次。取出冷却至室温后， 加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，12000 g离心10min。4. 转移上清液至一个新的2 ml EP管中，记录其体积。加入1/10管体积的10的CTAB溶液，轻轻混匀。加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，12 000 g离心10min。5
2、. 用切掉尖端的枪头吸取上清，转移上清液至一个新的1.5 ml EP管中，记录其体积。加入等体积的预冷的异丙醇或加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，-20放置30min或过夜。6. 4，10000g离心5min，弃上清，70%乙醇洗涤两次，风干，溶于适量体积的TE缓冲液中。所需试剂：1M Tris-HCl（PH 8.0）取121.1g Tris碱溶于800ml蒸馏水，冷却后加入约42ml浓HCl调PH为 8.0，定容至1 L，高压灭菌。5M NaCl取292.2g NaCl溶于800ml蒸馏水，定容至1 L，高压灭菌。0.5 M EDTA（PH 8.0）取186.1g EDTA-Na2.2H
3、2O溶于800ml蒸馏水，加热搅拌溶解后加入约20gNaOH调PH为 8.0，定容至1 L，高压灭菌。2%CTAB (1L)CTAB 20g 2%1M Tris（PH 8.0） 100ml 100 mM0.5 M EDTA（PH 8.0） 40 ml 20 mM 5M NaCl 280ml或81.8g 1.4 M定容至1L，现用现加入0.1-2%-巯基乙醇10CTAB（500ml）CTAB 50g 10%5M NaCl 70ml 0.7M定容至500ml1xTE （100ml）1M Tris（PH 8.0） 1ml0.5 M EDTA 200l定容至100ml高多糖和多酚含量类群的DNA提取方
4、法I1. .称取0.1-0.2g重量的叶片组织于研钵中，剪成小段并在液氮中将之研磨成细粉。2.将粉末快速转移至2 ml EP管中， 加入500l预热的混匀缓冲液， 混匀后加入100l 的5%十二烷基肌胺酸钠， 100l 的10%PVP和100l 的20%CTAB,颠倒混匀。3. 65水浴60-90min， 每隔5-10分钟颠倒混匀一次。 取出冷却至室温后， 加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），轻轻混匀。4，3000 g离心10min。4. 转移上清液至一个新的2 ml EP管中， 记录其体积。 加入等体积的预冷的异丙醇后再加入100l 的6M NaCl，混匀后-20放置至少1h。5
5、. 将絮状沉淀钩出置于一个新的1.5 ml EP管中， 70%乙醇洗涤两次， 风干后溶于适量体积的TE缓冲液。所需试剂：混匀缓冲液(1L)CTAB 20g 2%Na2SO3 0.6g 0.06%1M Tris-HCl（PH 8.0） 200ml 200 mM0.5 M EDTA（PH 8.0） 100 ml 50 mM 5M NaCl 440ml或128.5g 2.2 M定容至1L酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）6M NaCl10% PVP5% 十二烷基肌胺酸钠(N-lauroyl-sarcosine)20% CTAB注：原文作者直接将剪成小段的叶片至于混匀缓冲液中，未经研磨；高多糖含量类群
6、的DNA提取方法II 1. .称取0.1g左右重量的新鲜叶片组织于研钵中，剪成小段并在液氮中将之研磨成细粉（干燥材料适量减为四分之一）。2.将粉末快速转移至2 ml EP管中，加入400l预热的缓冲液，颠倒混匀，室温，6800 g离心15min。将上清液至一个新的2 ml EP管中，记录其体积。加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀1min。室温，3200 g离心15min。3. 转移上清液至一个新的2 ml EP管中，记录其体积。加入二倍体积的预热2% CTAB提取液，65水浴60-90min（100rpm）。4.每隔5-10分钟颠倒混匀一次。取出冷却至室温后， 加入等体积的氯仿-异
7、戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，3200 g离心15min。5. 转移上清液至一个新的1.5 ml EP管中，记录其体积。加入1/30体积的3M的NaAC (PH5.2)和0.6倍体积的预冷的异丙醇，混匀，将絮状沉淀钩出置于一个新的1.5 ml EP管中或者室温，3200 g离心10min后弃上清。6. 80%乙醇洗涤两次，风干后溶于500l的1xTE缓冲液中。加入5l的RNase（10mg/ml）37孵浴30min。7. 加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻混匀。室温，3200 g离心10min。8. 转移上清液至一个新的1.5 ml EP管中，加入二倍体积的预冷无水乙醇混匀后，室温
8、，3200 g离心10min。弃上清， 80%乙醇洗涤两次，风干后溶于适量的超纯水中。所需试剂：缓冲液: 2%的十二烷基肌氨酸钠溶液和5M NaCl 2% CTAB提取液3M NaAC (PH5.2) 氯仿-异戊醇（24：1）注：材料在缓冲液中一定要混合均匀，是本实验的关键，因为高浓度的NaCl和肌氨酸钠溶液被用来沉降多糖。高多糖含量类群的DNA提取方法III 1-6.前同标准CTAB提取方法（略），溶于500l 的1xTE缓冲液后，加入5l 的RNase（10mg/ml）37孵浴45-60min。7. 加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），轻轻混匀。室温，5000 g离心15min
9、。转移上清液至一个新的2.0 ml EP管中，记录其体积。加入500l 的5M NaCl和1ml的水饱和醚加入NaCl和水饱和醚后成牛奶状，颠倒混匀至透明后，室温，5000 g离心10min。8.弃上层醚液，小心转移最底层液相至一个新的1.5 ml EP管中，吸取时，倾斜枪头以便形成狭缝便于吸取， 加入等体积的预冷异丙醇，混匀后-20放置30min。9. 将絮状沉淀钩出置于一个新的1.5 ml EP管中， 70%乙醇洗涤两至三次，风干后溶于TE缓冲液中。注意事项：1. 在核酸提取时，为增加细胞的裂解度和核蛋白复合体破碎度，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反
10、应时间越长越好。不确保核酸水解酶存在有无的前提下，可在溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA（因游离金属离子对酶有抑制）。蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到5060，并将反应时间缩短到1525min，但酶用量须提高1020倍。2. 对于富含酚的植物材料，细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，酚被氧化成有色的锟类物质，影响核酸的提取质量，可以在提取液中加入适量PVP和巯基乙醇以降低酚类的干扰（因PVP的“CO-N=”基团有很强的结合多酚化合物的能力，并随多酚化合物中芳环羟基数量增加而增加，但在PH8.0以上时结合能力会下降。巯基乙醇则可打断多酚氧化酶的二硫键使其失活另
11、外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用）。3. 在提取核酸时还会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法（1）CTAB及氯仿-异戊醇(24:1)多次抽提。（2）在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂时，NaCl用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此须用乙醇多次洗涤脱盐。4在核酸提取时，酚、氯仿和异戊醇均起到变性蛋白的作用。酚变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽提后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿或单一酚作变性剂，也可用酚/氯仿或氯仿/异戊醇混合变性，但用单一酚变性后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。5. 为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。吸取液相时避免震荡分界面。6风干时间不宜过长，以免DNA沉淀过干难于溶解。7RNA 污染，次生代谢物或者CTAB都会造成对DNA浓度的过高估计（大概3-5倍），估测浓度时应注意。