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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基因操作原理-基因操作原理课程教学大纲课程编码：13019课程名称：基因操作原理课程英文名称：PrinceplesofGeneManipulation先修课程：生物化学、遗传学、分子生物学等适用专业：生物技术生物科学总学时：56讲课学时56实验学时0实习学时0总学分：3.5一、课程性质、地位和任务“基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的
2、方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术；PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术；DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。”分子克隆技术”是与本课程配套的实验课程。二、课程基本要求能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线，要求学生随着科学研究和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。本课程涉及到生物学的一
3、些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。如果能做到理论与实验并至，将能巩固所学知识。重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。三、教学内容及安排绪论：基因操作的理论基础（2学时）本章重点与难点:掌握与基因操作有关的基本概念0.1基因的概念0.1.1什么是基因0.1.2基因与其产物的共线性及非共线性0.1.3基因的重叠与可变性0.2基因的结构组成0.2.1启动子0.2.2SD序列0.2.3转录终止区0.2.4其它0.3基因克隆的通用策略0.3.1基本步骤0.3.2亚克隆第1章 基因操作工具酶(10学时)本章重点与难点:要
4、求掌握和了解限制酶与常用工具酶的种类活性和用途,让学生知道“基因操作原理”是靠什么“工具”来完成的。1.1限制酶1.1.1限制酶的发现及其命名1.1.1.1现象1.1.1.2限制酶的发现及其命名1.1.1.3限制与修饰系统的种类1.1.2限制酶识别的序列1.1.2.1长度1.1.2.2结构1.1.2.3切割位置1.1.2.4特殊系列1.1.3限制酶产生的末端1.1.3.1粘性末端1.1.3.2平端1.1.3.3非对称突出端1.1.3.4同裂酶1.1.3.5同尾酶1.1.4末端长度对切割的影响1.1.5位点偏爱1.1.5.1现象1.1.5.2原因1.1.6酶切反应条件1.1.6.1缓冲液1.1.
5、6.2反应温度/时间1.1.6.3反应终止1.1.7星星活性1.1.8单链DNA的切割1.1.9酶切位点的引入(酶切水平)1.1.9.1方式1.1.9.2沉默突变1.1.10影响活性的因素1.1.11酶切位点在基因组中分布不均一性1.2甲基化酶1.2.1甲基化酶的种类1.2.1.1dam/dcm甲基化酶1.2.1.2EcoRI甲基化酶1.2.1.3SssI甲基化酶1.2.1.4其它甲基化酶1.2.2依赖于甲基化的限制系统1.2.3甲基化对限制酶的酶切影响1.2.3.1修饰酶切位点1.2.3.2产生新的酶切位点1.2.3.3甲基化位点的分布及对基因组作图的影响1.3DNA聚合酶1.3.1大肠杆菌
6、DNA聚合酶1.3.2Klenow酶1.3.3T4噬菌体DNA聚合酶1.3.4T7噬菌体DNA聚合酶1.3.5耐热DNA聚合酶(第7章中详细介绍)1.3.6反转录酶1.3.7末端转移酶1.4其它工具酶1.4.1RNA聚合酶1.4.2连接酶1.4.2.1T4DNA连接酶1.4.2.1大肠杆菌连接酶1.4.2.3 TaqDNA连接酶1.4.2.4 T4RNA连接酶1.4.3T4多核苷酸酶1.4.4碱性磷酸酶1.4.5核酸酶1.4.5.1DNA酶1.4.5.2RNA酶1.4.6RNA酶抑制剂1.4.7琼脂糖酶1.4.8DNA单链结合蛋白1.4.9其它第2章 分子克隆载体(14学时)本章重点与难点:重
7、点掌握质粒、噬菌体、粘粒和M13噬菌体的组成结构和用作基因克隆的工作原理，了解其它克隆载体，表达载体和其它功能性载体的种类及其工作的基本原理。2.1.质粒载体2.1.1质粒的基本特性2.1.1.1概念2.1.1.2质粒的复制和不相容性2.1.1.3转移性2.1.2标记基因2.1.2.1选择标记2.1.2.2-互补2.1.3质粒载体的种类2.1.3.1克隆载体及其类群2.1.3.2其它载体2.2噬菌体载体2.2.1噬菌体的分子生物学2.2.1.1发育调节2.2.1.2可置换区2.2.2噬菌体载体的选择标记2.2.3代表性噬菌体载体2.2.3.1插入型载体2.2.3.2置换型载体2.3粘粒载体2.
8、3.1粘粒的结构特征2.3.1.1概念2.3.1.2组成与大小2.3.2用作基因克隆的原理性步骤2.3.3用途2.3.4粘粒克隆载体2.3.4.1单-cos位点粘粒载体2.3.4.2双cos位点的粘粒载体2.3.4.3charomid卡隆粒9载体系列3.1.1 克隆中常见的问题2.4单链丝状噬菌体载体2.4.1M13噬菌体的生物学2.4.1.1结构组成2.4.1.2增殖过程和方式2.4.2M13噬菌体载体2.4.2.1 插入区域2.4.2.2 M13mp载体2.4.2.3 宿主菌2.4.2.4 用途2.4.2.5 克隆中常见的问题2.4.3噬菌粒2.4.4M13KO72.5高通量克隆载体2.5
9、.1酵母生物学简介2.5.2酵母人工染色体2.5.2.1复制的必需成份2.5.2.2选择标记2.5.2.3筛选模型2.5.2.4工作原理2.5.3细菌人工染色体2.5.3.1F质粒生物学2.5.3.2载体的必需成分2.5.3.3工作原理2.5.3.4用pBeloBAC11构建苏云金芽胞杆菌YBT1520全基因组文库2.5.4PAC载体2.5.4.1P1噬菌体2.5.4.2P1载体和PAC载体2.6大肠杆菌表达载体2.6.1非融合蛋白表达载体2.6.1.1Lac启动子系列2.6.1.2Trp/tac启动子系列2.6.1.3启动子2.6.2融合蛋白表达载体2.6.2.1GST基因融合蛋白载体2.6
10、.2.2蛋白A融合蛋白载体2.6.2.3His融合蛋白载体2.7其它功能性载体2.7.1穿梭载体2.7.1.1E.coli/gram+2.7.1.2E.coli/yeast2.7.1.3E.coli/plantcell2.7.1.4E.coli/Mammalian2.7.2启动子克隆载体2.7.3复制子克隆载体2.7.4整合载体2.7.4.1无复制子整合载体2.7.4.2温度敏感复制子整合载体2.7.4.3转座子载体2.7.5解离载体第3章 基因操作中的分离与分析技术(6学时)本章重点与难点:重点掌握大肠杆菌质粒DNA分离纯化,琼脂糖凝胶电泳和DNA片段回收的方法性原理以及RNA分离纯化的注意
11、事项和分离及电泳方法。要求掌握印迹分析的种类、原理和方法，特别要求掌握这些方法的运用对象，达到能灵活运用这些方法的目的。3.1DNA的分离3.1.1质粒DNA的分离纯化3.1.1.1小质粒的分离3.1.1.2大质粒的分离3.1.2单链DNA的分离纯化3.1.3凝胶电泳分离DNA3.1.3.1琼脂糖凝胶电泳3.1.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳3.1.3.3脉冲电场电泳3.1.4DNA的回收3.1.4.1低熔点琼脂糖3.1.4.2透析袋3.1.4.3Glassmilk3.1.4.4Qiagen柱3.1.4.5其它3.2RNA的分离3.2.1RNA的分离纯化3.2.1.1注意事项3.2.2.2分离方法3
12、.3染色体DNA的分离3.4探针制备3.5印迹分析（杂交）3.5.1Southern杂交3.5.1.1目标DNA的转移3.5.1.2杂交和检测3.5.2Northern杂交3.5.2.1RNA的提取和电泳3.5.2.2目标RNA的转移3.5.2.3杂交和检测3.5.3Western“杂交”3.5.3.1SDS-PAGE3.5.3.2蛋白质转移至固相支持体3.5.3.3靶蛋白的检测3.6基因芯片3.6.1基因芯片3.6.1.1基因芯片的定义3.6.1.2基因芯片分析流程3.6.1.3基因芯片技术的发展史3.6.1.4基因芯片技术的特点3.6.2基因芯片的分类3.6.2.1Array3.6.2.2
13、Microarray3.6.2.3DNAchip3.6.2.4Labonachip3.6.3基因芯片技术的理论基础3.6.3.1DNA分子在刚性表面的固定3.6.3.2探针的标记3.6.3.3杂交3.6.4基因芯片的制作3.6.4.1基因的分析与选择3.6.4.2点样3.6.4.3固定3.6.5DNA芯片的应用3.6.5.1RNA表达分析3.6.5.2比较基因组分析3.6.5.3单核苷酸多态性（SNP）分析3.6.5.4临床检验第4章 PCR技术及应用(6学时)本章重点与难点:要求重点掌握PCR技术的基本原理、基本操作程序以及引物设计方法，了解利用PCR技术原理所衍生出来的技术方法的种类和工作
14、原理，达到能够自觉合理地利用PCR技术为研究和应用服务。4.1PCR的基本原理4.1.1PCR运行的基本原理4.1.2热稳定DNA聚合酶的种类和用途4.1.2.1TaqDNA聚合酶4.1.2.2保真热稳定DNA聚合酶4.1.2.3其它热稳定DNA聚合酶4.1.3引物的设计4.1.3.1长短4.1.3.2Tm值4.1.3.3其它4.1.4运行程序4.1.4.1温度4.1.4.2时间4.1.4.3平台效应4.2PCR技术的应用4.2.1PCR克隆4.2.1.1AT克隆4.2.1.2平末端克隆4.2.1.3反向PCR4.2.2反转录相关PCR4.2.2.1反转录PCR4.2.2.25RACE4.2.
15、2.33RACE4.2.3PCR鉴定和多态性4.2.3.1PCR鉴定4.2.3.2RAPD4.2.3.3AFLP4.2.4实时定量PCR4.2.4.1实时荧光定量PCR原理4.2.4.2检测模式4.2.5其它PCR方式（略）4.2.5.1PCR介导的诱变(详见后文)第5章 4.2.5.2PCR介导的DNA序列测定(详见后文)DNA序列分析(4学时)本章重点与难点:要求掌握DNA序列分析的基本原理和基本步骤,能够做到自行设计和按排测序工作；同时要求能对所测得的序列进行常规分析,了解如何利用因特网进行数据处理和分析。5.1Maxam-Gilbert化学降解法5.1.1基本原理5.1.2优缺点5.2
16、Sanger双脱氧终止法5.2.1测序策略5.2.1.1亚克隆5.2.1.2嵌套缺失克隆5.2.1.3“引物步进”5.2.2基本原理和步骤5.2.2.1原理5.2.2.2步骤5.2.2.3双链模板5.2.3PCR自动测序5.2.3.1PCR反应5.2.3.2自动测序和分析5.3DNA序列的数据分析5.3.1目标序列的特征分析5.3.1.1酶切位点5.3.1.2ORF查找/ORF的特征5.3.1.3其它(二级结构,启动子,SD序列等)5.3.2目标序列的网络分析5.3.2.1同源性分析5.3.2.2注册登记5.3.2.3已知基因序列的获得5.3.2.4两个或多个序列的同源性比较(5.3将采用多媒
17、体网络化演示教学)第6章 DNA文库的构建（5学时）本章重点与难点：要求结合前面所学的内容，重点掌握基因文库构建的基本原理和步骤，并由此掌握基因文库构建的方法和类型，可自行设计和选择构建基因文库的步骤和方法。6.1基因文库6.1.1概念6.1.2重组子数6.1.3注意的问题6.2cDNA文库6.2.1cDNA克隆的策略6.2.2cDNA第一链的合成6.2.3cDNA第二链的合成6.2.3.1自引导法6.2.3.2第二链的置换合成法6.3.3.3第二链的引导合成6.2.4双链cDNA的分子克隆6.2.4.1同聚物加尾6.2.4.2合成的DNA接头和衔接头6.2.4.3其它克隆cDNA的方法6.2
18、.5DNA克隆的噬菌体载体6.2.5.1gt10和gt116.2.5.2其它6.3基因组文库6.3.1鸟枪克隆6.3.1.1靶DNA的处理6.3.1.2载体的选择6.3.2定向克隆6.3.2.1Southern分析6.3.2.2文库构建6.3.3其它克隆方法6.3.3.1精简基因组文库6.3.3.2精简cDNA文库6.4基因文库的筛选6.4.1菌落(噬斑)杂交6.4.2筛选的策略6.4.3文库的保存第7章 DNA定点诱变(4学时)本章重点与难点:要求学生掌握对DNA进行定点诱变所使用的方法和种类及其用途,重点掌握利用寡核苷酸进行定点诱变的方法和原理。7.1缺失与插入的形式7.1.1简单的缺失或
19、插入7.1.2系统缺失和插入7.1.2.1插入接头的诱变7.1.2.2若干套嵌套的缺失突变体的产生7.1.2.3接头分区诱变7.2寡核苷酸介导的诱变7.2.1诱变寡核苷酸的设计和挑选7.2.2诱变方法7.2.2.1双引物诱变法7.2.2.2Kunke法7.2.2.3PCR法7.2.3通过诱变研究蛋白质7.2.3.1在编码区插入六聚体接头7.2.3.2在特定区域上产生许多突变第8章重组DNA导入宿主细胞的方式（2学时）本章重点与难点:掌握大肠杆菌的转化方法以及电转化的原理及应用对象,了解DNA导入宿主细胞的方式。8.1.大肠杆菌的转化8.1.1常规转化方法(CaCl2法)8.1.2电转化法8.1
20、.3其它方法8.2芽胞杆菌的转化8.2.1原生质体融合8.2.2电转化法8.2.3接合转移8.2.4转导8.2.5转染8.3真核生物细胞的转化8.3.1酵母8.3.2植物细胞8.3.3哺乳动物细胞课程综合报告（2学时）报告目的：通过对科学研究实例的分析，细化学生对概念的认识，深化学生对理论的理解。让学生在这种实战模拟中逐步锻炼自己的科研思维，形成自己的实践观念。四、教学方式及课程考核办法教学方式：多媒体演示讲述课程考核办法：检查课后思考题，闭卷笔试五、主要参考资料1、“MolecularCloning”（3rdedition2001年）2、“PrinceplesofGeneManipulation”(6thedition,2002)3、最新版的分子生物学试剂产品目录和Internet最新信息撰稿人：孙明审稿人：-