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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基因工程重点-基因工程大纲高国辉老师部分名解：1、 第一代基因工程（重组DNA）：是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则是涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。2、 第二代基因工程（蛋白质工程）：研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质;或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天
2、然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。3、 第三代基因工程（途径工程）：是多基因的基因工程。通过基因工程的手段来改变分叉代谢途径的流向或阻断有害代谢产物的合成等原理，来改变微生物代谢的流向，增加某些产物的产量，也可通过引入外源基因来延伸原来的代谢途径，产生新的末端代谢产物，或者利用新底物作为生物合成的原料，也可以通过构建新的代谢途径合成具有新化学结构的代谢产物。4、 质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。5、 考斯质粒（cosmid）：是一类人工构建的含有-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。6、 克隆质粒：常用
3、于克隆和扩增外源基因。它们或者含有氯霉素可扩增的松弛型复制子的结构，或者复制子经过人工诱变，解除对质粒拷贝数的负控制作用，使得质粒在每个细胞中可达数千个复制拷贝。7、 穿梭质粒：这类质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，可以在两种不同种属的受体细胞中复制并检测。8、 表达质粒：这类质粒在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点（SD序列）以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效的表达。9、 限制性核酸内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断
4、的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。10、 Klenow酶：用枯草芽孢杆菌蛋白酶处理切掉大肠杆菌DNA聚合酶N端的53外切酶活性部分。11、 T4DNA连接酶：由T4噬菌体基因编码，相对分子质量为60KD。可以用来修复DNA双链上的单链缺口，连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口，也可以用来连接完全断开的两个平头双链DNA分子。12、 动物的转基因技术：利用转基因的重组子构建技术，重组分子导入动物体内的转化技术，转基因在受体细胞染色体上的稳定整合及可控制性表达技术统称为转基因技术。13、 转基因动物：指
5、以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。11、 共抑制效应：当受体细胞染色体上含有转基因的同源伙伴时，转基因与内源性同源基因的表达将同时受到抑制。12、 基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。13、 Ti的共整合转化：T-DNA在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合
6、到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。14、 Ti质粒的二元整合转化系统:即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。（与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。）问答、填空、选择：一、 基因工程绪论（过程、原理、三大要素有一个大题）1、基因工程的三大要素：供体、受体、载体。2、基因工程的基本过程：切，接，转，增，检。（1）基因的剪刀
7、（切）限制性内切酶：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。（2） 连DNA连接酶：连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。（3） 转运载体：运载体必须同时满足三个要求：能与目的基因结合；能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达；比较容易得到。（4） 增转化细胞：扩增重组分子或整合重组分子到受体细胞的基因组：细菌培养、昆虫细胞培养、植物组织培养、高等动物细胞培养
8、。（5） 检筛选鉴定转化细胞：PCR鉴定目的基因、抗生素筛选标记、报告基因显色筛选等。二、 基因工程的基本原理：基因的表达调控（熟悉了解，也许会来选择题）1、 基因表达(geneexpression)是指基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。基因表达可分为组成性表达和受调控表达两种形式。组成性表达：对细胞生命活动必不可少的基因处于持续表达状态，称管家基因。2、 基因的表达方式诱导和阻遏：诱导：特定条件下基因表达增强的过程。如DNA损伤诱导损伤修复相关基因表达。阻遏：基因表达受到抑制的过程。如色氨酸阻遏其合成代谢相关基因表达。3、 基因表达调控及其方式：在基因表达的各个水
9、平均可进行调控，但转录调控是主要的调控方式。（1）转录调控的基本要素：顺式作用元件：具有调控基因表达作用的特殊DNA序列。如启动子序列：基本序列。特殊调控序列：如操纵序列。反式作用因子：具有调节基因表达作用的蛋白因子。RNA聚合酶。特异性转录调节因子：激活蛋白或阻遏蛋白等。（2） 影响转录的因素：启动子起始部位：+1、结合部位：-10、识别部位：-35；启动子决定转录方向及模板链；启动子序列决定启动效率，不同的启动子序列对RNA聚合酶亲和力不同，因此具有不同的起始频率；因子与启动子序列特异性识别：原核生物只有一种RNA聚合酶，但具有多种因子，不同的起始因子选择性识别不同的启动子。阻遏蛋白在转录
10、水平对基因表达产生抑制作用的蛋白质：负调控。由调控基因(i基因)编码，阻遏蛋白是DNA结合蛋白，特异性识别并结合操纵子，阻止转录。信号分子阻遏蛋白变构结合DNA（或去结合），从而诱导阻遏和诱导去阻遏。正调控蛋白结合于特异DNA序列后能促进基因转录：正调控。CAP蛋白：分解代谢物基因活化蛋白又称cAMP受体蛋白CRP。ntrC蛋白的调控。倒位蛋白位点特异性重组酶。RNA聚合酶抑制物细菌处于氨基酸饥饿状态时RNA聚合酶活性下降，rRNA和tRNA合成减少或停止的现象称为严谨反应。衰减子位于操纵子第一个结构基因之前，能够减弱转录作用的序列。（3） 基因表达调控的特点：基因表达调控具有时空两重性：按功
11、能需要，某一特定基因表达的先后次序及相对强弱严格受时间的控制，称为基因表达的时间特异性；某种基因产物在个体生长过程中按不同组织、细胞乃至细胞器的空间顺序出现，称为基因表达的空间特异性。基因表达调控的模式复杂性：基因表达调控环节众多，其中转录调控是关键.真核生物与原核生物相比的基因表达调控范围要大。基因表达调控元件可分为核酸和蛋白质两大类。基因表达调控实质是两者之间的相互作用，包括核酸分子内或分子间的相互作用、核酸和蛋白质之间的相互作用、蛋白分子内或分子间的相互作用。基因表达调控的生物学意义：适应环境，维持生长和增殖、维持个体发育与分化、调控程序上的缺陷或紊乱将导致严重后果；（4） 启动子的调控
12、模型：启动子的一般特性：RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。有序列特异性、方向特异性、位置特异性、种属特异性。真核生物的启动子：根据所对应的基因编码产物分为：型启动子（rRNA基因）：核心启动子：紧邻转录起始位点，足以使转录起始。上游控制元件（UCE）：-180至-107处能大幅增强转录效率型启动子（mRNA基因）、型启动子（tRAN基因）；三、 DNA重组克隆的单元操作（重点章节）1、 DNA重组克隆所需的基本条件：（1） 用于基因克隆的载体（这个载体真的很重要的，打十颗星，最后一道综述性问答题就是有关载体的）1）载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或者整
13、合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件；2）载体应具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有较高的外源DNA的载装能力。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。具有合适的筛选标记。质粒：1）基本特性：质粒常见于原核细菌和真菌中；绝大多数的质粒是DNA型的；绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构；质粒DNA的分子量范围：1-300kb；质粒具自主复制性：根据在每个细胞中分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为严谨型复制控制的质粒（1-5个拷贝）和松弛型复制控制的质粒（30-60个拷贝）。质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的
14、不同质粒，不能同时存在于一个细胞中。质粒的可转移性：革兰氏阴性细菌根据能否在天然条件下自发的从一个细胞转移到另一个细胞而分为接合型质粒和非接合型质粒。携带特殊的遗传标记：2）质粒的构建：野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由pSC101、ColE1和pSF2124构建。删除非必需区域DNA。灭活某些质粒的编码基因。加入标记基因。添加MCS，删除重复酶切位点。加上一些调控序列。3） 基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。质粒的分离纯化：噬菌体：噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖
15、，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。1） 大肠杆菌的噬菌体噬菌体是温和型的噬菌体，有外壳包装蛋白和-DNA（全长48.5kb，至少含有61个基因）组成。其包装范围为原DNA的75%-105%即36-51kb。溶原状态：噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态。-DNA载体的构建：缩短长度：野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗
16、粒。根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：插入型载体和取代型载体。删除重复的酶切位点：野生型的-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。加装选择标记野生型-DNA上缺少合适的选择标记。-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记和颜色反应类标记。imm434基因：编码一种阻止-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，-重组分子便进入溶菌循环，形成
17、透明斑。lacZ基因：编码-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体-DNA则产生蓝色透明斑。构建琥珀密码子的突变体琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。-DNA重组分子的体外包装：在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。-DNA作为载体的优点：-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒。-DNA载体的装载能力为25kb，远远
18、大于质粒的装载量。重组-DNA分子的筛选较为方便。重组-DNA分子的提取较为简便。2） 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13单链噬菌体外型呈丝状、由外壳包装蛋白和正链DNA组成。不能裂解宿主细胞，但抑制其生长。M13DNA全长6407个核苷酸，其上有10个基因。M13DNA载体的特点：M13-DNA操作简便且具有选择性。似类于质粒操作或l-DNA操作。M13重组分子筛选简便。感染的细胞生长缓慢，形成混浊斑。可直接产生单链DNA。但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb。考斯质粒与噬菌粒（两者之间的比较）：考斯质粒和噬菌粒载体的构建是为了提高噬菌体DNA的装载量。将噬菌体DNA
19、与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。1）考斯质粒：1.8kb-DNA片段+pBR322片段，装载范围为31-45kb。考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。能像质粒那样在受体细胞中自主复制。重组操作简便，筛选容易。装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围。不能体内包装，不裂解受体细胞。2）噬菌粒：是一类人工构建的含有丝状噬菌体间隔区（IG）以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。pUC118：pUC18+M13间隔区I
20、G；pUC119：pUC19+M13间隔区IG。噬菌粒载体的特点：能像M13-DNA那样转染受体细胞。能像质粒那样在受体细胞中自主复制。装载量比常规的M13mp系列要大很多。通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA。重组操作简便，筛选容易。人造染色体载体：将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体包括：细菌人造染色体（BAC）和酵母人造染色体（YAC）.1）BAC：细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因
21、子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间。（2）用于核酸操作的工具酶限制性内切核酸酶（填空题、选择题）II型限制性核酸内切酶的基本特征：识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构II型限制性核酸内切酶的切割方式：绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。同位酶：识别相同的序列的II型酶；同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的II型酶；同尾酶：识别位点不同，但能切出相同粘性末端的II型酶；根据被切开的DNA末端性质的不同，所有的II型酶又可以分为5突
22、出末端酶、3突出末端酶以及平末端酶。除平末端，其余两种末端均可以在足够低的温度下退火互补，称为粘性末端。（3） 用于基因转移的受体菌或细胞1）受体细胞的选择及改造：限制缺陷型：打破细菌转化的种属特异性，即对外源DNA的限制修饰系统，在大肠杆菌中可以采用hsdR-缺陷的遗传表型。提高外源DNA的可转化性。重组整合缺陷型：野生型的细菌在转化过程中接纳的外源DNA分子能与染色体DNA发生体内同源重组反应，在大肠杆菌中可以选用相应基因型recA-、recB-或recC-同时灭火。具有较高的转化效率：用于基因工程的受体细胞必须对DNA重组分子具有较高的可转化性，这种特性主要表现在细胞壁和细胞膜的结构上。
23、具有与载体选择标记互补的表型：受体细胞必须具有与载体所携带的选择标记互补的遗传特性，方能使转化筛选成为可能。感染寄生缺陷型：从安全角度上考虑，受体细胞不能具有感染寄生性。2）转化的步骤，方法以及原理：（选择题）细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌游离的DNA片段，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得相应的遗传性状，其中来自供体菌的游离DNA片段称为转化子。细菌转化的五个步骤：感受态的形成；转化因子的结合：只有双链的DNA分子才可以。转化因子的吸收：一条链被降解，而另一条链则被吸收进受体菌中。整合复合物前体的形成：进入受体菌的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，将其引导
24、至受体菌染色体处。转化因子单链DNA的整合：通过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。方法和原理：Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化：Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。细菌原生质体的转化：革兰氏阳性细菌接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体转化的方法转移质粒或重组DNA分子。酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化。细菌原生质体的制备：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌
25、细胞壁对溶菌酶的敏感性）。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。细菌原生质体的转化：取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20mlDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀。转化后的悬液涂在再生平板上让原生质体再生。噬菌体DNA的转染：感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟。转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培
26、养液澄清度增加，然后涂板筛选。电穿孔转化：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。接合转化：指通过细菌细胞之间直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。这个过程是由接合型质粒完成的。整个过程涉及到受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及有待转化重组质粒的供体菌。3）转化率及其影响因素：（选择题）转化率：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。或每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数。影响因素：载体
27、及DNA重组分子方面：载体本身的性质、载体分子的空间构象（超螺旋结构转化率高，体外酶切后的载体低）、插入片段的大小（大于30Kb的重组质粒很难进行转化）。受体细胞方面：受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还应与所转化的载体DNA性质相匹配。转化的方法：受体细胞的预处理或感受态细胞的制备对转化率影响最大。2、DNA重组克隆的操作过程（1）重组率的概念以及影响因素：概念：重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。影响因素（提高重组率的方法）：提高外源DNA片段与载体的分
28、子比：5:1-10:1；载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团；加装同聚尾末端；3、 转化子的筛选和鉴定（检）载体遗传标记检测：（选择题，原理的对比）载体遗传标记的原理是利用载体DNA分子上锁携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子的。抗药性筛选法：前提条件是载体DNA上携带有受体细胞敏感的抗生素的抗性基因。抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。营养缺陷型筛选法：营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分，将转化细胞涂布在不含此营养组分的培养基上，长出的便是转化子。用
29、于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+。显色筛选法：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）。基本操作：将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落。四、 高等动物的基因工程1、动物转基因的表达特性：（1）转基因的时空特异性表达：相关基因的时序特异性和组织特异性；（2）转基因的可控性表达：根据受体细胞的性质和启动
30、子类型来摸索诱导被转基因的表达控制条件（3）转基因的共抑制效应；共抑制效应的特征：共抑制只发生在转基因与同源的内源性基因之间，对其他基因的表达不产生影响如果转基因与内源性发生体内重组，则共抑制效应随之消失，基因表达恢复正常共抑制现象的发生与结构基因编码区有关，但不依赖于启动子的来源和性质两个相同的转基因之间也能发生共抑制效应2、 转基因导入动物体内的方法：（1）转基因动物受体细胞系统：除了选择那些与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞系作为转基因的手提外，还应该建立动物细胞特异性选择标记，快速有效的筛选转化细胞。HAT选择法：选择TK+细胞的培养基中含有次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸苷，所以叫HAT选
31、择法。基本原理：加氨基蝶呤APT,二氢叶酸还原酶被抑制,从而阻断dTTP,dATP,dGTP的重新合成途径；加次黄嘌呤,启动dATP,dGTP的补救合成途径；加胸苷,TK+细胞能通过胸苷激酶的作用合成dTTP,细胞继续存活;TK-细胞则死亡；所以,使用HAT培养基能够选择出由tk基因转化而来的TK+细胞。（2） 动物受体细胞的遗传标记：高等哺乳动物的基因转移：动物细胞物理转化法：主要优点是转基因不含任何病毒基因组片段，尤其适用基因治疗。但转基因进入细胞后，往往多拷贝随机整合在染色体上，导致受体细胞基因灭活或转基因不表达。哺乳动物病毒转染法：以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒
32、颗粒共转染特定的受体细胞。其优点就是定向性好，实验重复性佳，不过目前常用的载体宿主范围有限。高等哺乳动物的载体系统：人腺病毒DNA、猴空泡病毒DNA（SV40）、人乳头瘤病毒DNA（BKV）、人牛痘病毒（DNA）。动物病毒的特点：有能够被真核细胞识别的有效的启动子；在感染周期中能够持续地复制使基因达到相当高浓度，并实现有效的表达；病毒能具有效控制自己复制的顺式元件和反式作用因子，改造后可发展成为能够在细胞内长时间的保持高拷贝的外源基因的复制型质粒载体；能高效稳定地整合到染色体,可提高外源基因导入寄主细胞染色体的效率；病毒外壳蛋白能够识别细胞接受器，能够将外源蛋白高效地导入宿主细胞(假病毒粒子法
33、)。人腺病毒DNA：为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十四面体。常用来构建载体的是Ad2和Ad5。感染人细胞时称裂解型，不致癌，但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员是致癌的。其基因组DNA全长为36kb,包装上限为37.8kb。特点就是基因组重排率低、安全性能好、宿主范围广、使用效果好。猴多瘤病毒DNA（SV40）：SV40由VP1VP2VP3三种衣壳蛋白包装而成、基因组为5224bp的双链环状DNA。SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2，H3，H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。感染猴细胞呈裂解型，不致癌，但感染啮齿类动物后发生非同源整合而致癌。重组的SV
34、40DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了提高装载量，可以删除一些基因片段，让重组的SV40分子与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染能力的重组病毒颗粒。特点：基因表达好、基因重排高、宿主范围广、装载量较小。人乳头瘤病毒DNA（BKV）:其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自主复制，每个宿主细胞可高达500个拷贝。人牛痘病毒DNA：牛痘病毒是一个大型的DNA病毒，基因组全长是185kb，能在宿主细胞质中自主复制。由于其基因组大，故一般采用的是体内重组的方式。反转录病毒载体类型：反转录病毒：是一类含有单链RNA的动物病毒.
35、基因组含有2条相同的正链RNA分子,包装成二倍体病毒颗粒.此外,颗粒内还含有tRNA引物分子,反转录酶,RNaseH,整合酶等.优点：大多数情况下,反转录病毒的肿瘤基因都能在正常细胞中转录,利用之作为天然转导因子,改建成载体.寄主范围广,包括无脊椎和脊椎动物;具有强启动子,有效表达外源基因;不但感染率高,而且不会导致宿主细胞死亡,且形成感染性病毒颗粒。生命周期：第一时相：从病毒颗粒脱壳到整合到寄主基因染色体上,成为原病毒(provirus);第二时相：原病毒开始转录,合成并加工成mRNA,进而转译蛋白,组装颗粒,释放病毒。反转录病毒的类型：辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体；无需辅助病毒互
36、补的重组的反转录病毒质粒载体；广寄主范围的反转录病毒载体；反转录病毒表达载体；动物转基因的其他方法：工程胚胎干细胞法：将多效性胚胎干细胞接受外源基因。体细胞转基因克隆法：以动物的体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞。3、 利用动物转基因研究基因的表达与功能（选择题，见书本）4、 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理（选择题和问答题）基因扩增：是转基因在动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。如甲氨蝶呤（Mtx）是动物细胞中关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的抑制剂，细胞培养物经甲氨蝶呤的处理后，存活下来的抗性细胞中dhfr基因均得以扩增，与该基因邻近的染色体D
37、NA片段也同样得到扩增，正是通过相关基因的拷贝数，提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消了甲氨蝶呤的抑制作用。在表达载体上安装病毒或细胞来源的强启动子以及有效翻译起始信号也是外源基因高效表达一种手段。五、 高等植物的基因工程1、 高等植物基因的转移系统：植物转基因的方法：质粒整合、病毒感染、物理转移。Ti质粒介导的整合转化系统：几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti（Tumor-inducing）介导的。（1） Ti质粒的结构和功能：整个质粒160-240kb，其中T-DNA12
38、-24kb。制瘤机制：损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。（2） Ti质粒的改造：除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；安装大肠杆菌复制
39、子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。（3） 共整合转化系统：二元整合转化系统：将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内，重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒。以上述重组农杆菌感染植物细胞。植物病毒介导的转染程序：在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。（1）利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略：转染植物细胞原生质体以双链D
40、NA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。转染植物组织植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。（2）植物重组病毒的操作战略：基因的置换：用外源基因取代病毒的复制及感
41、染非必需的基因。基因插入：如果外源基因不置换病毒载体上的任何序列而直接插入，可以在一定程度上避免因基因置换所造成的缺陷。基因融合：将小分子外源肽与病毒蛋白融合表达。基因互补：将外源基因先插入到一个删除了大部分基因序列的缺陷型病毒载体上，再依靠另一种全功能的辅助病毒恢复其缺陷的包装及感染功能，最终将缺陷型重组病毒与辅助病毒共转染受体植株。植物细胞的直接转化程序：（选择题）枪击法：将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。电击法：将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质
42、体悬浮液中，混合物在200-600V/cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2周，再生出整株植物。融合法：将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。花粉管导入法：将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。花粉管导入法的特点是
43、直接、简便。它的受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。2、 高等植物的基因表达系统：看一下：外源基因的四环素诱导系统、外源基因的乙醇诱导系统以及外源基因的类固醇诱导系统。1、 第二代基因工程蛋白质工程蛋白质工程的研究内容：通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效；通过改变蛋白质的组成和空间结构，提高其在极端条件下的稳定性，如酸、碱、酶稳定性；通过改变蛋白质的遗传信息，提高其独立工作能力，不再需要辅助因子；通过改变蛋白质的特性，使其便于分
44、离纯化，如融合蛋白b-半乳糖苷酶（抗体）；通过改变蛋白质的调控位点，使其与抑制剂脱离，解除反馈抑制作用等。2、 方法：在蛋白质分子中引入二硫键以提高蛋白质的稳定性；减少半胱氨酸残基数目以避免错误折叠的可能性；置换天冬酰胺、谷氨酰胺或其他氨基酸，以修饰酶的催化特异性或增加酶的活性等。3、 基因的体外定向突变：（1） 基因定点突变：是指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程。（2）蛋白质设计：依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立，按照蛋白质构效关系的理论基础，设计出比天然蛋白质性能优越的新型蛋白质。在DNA水平上产生多肽编码顺序的特异性改变。利用这项技术一方面可以对某些天然蛋白质进行定位
45、改造，另一方面还可以确定多肽链中某个氨基酸残基在蛋白质结构及功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间结构及生物活性之间的对应关系，为设计新型突变蛋白提供理论依据。基因定向突变的策略：局部随机掺入法（图9-2）碱基定点转换法（图9-3）部分片段合成法（图9-4）引物定点印入法（图9-5，9-6）4、 基因的体外定向进化：又称实验分子进化,属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因,并定向选择出所需性质的突变酶。（1） 主要过程：通过随机突变或基因重组，创造一个靶基因或一群家族基因
46、的多样性文本，建立突变文库。突变文库在受体生物中转换成对应的蛋白变体库。高通量筛选，检出由氨基酸置换而引起的变体蛋白性状变化，从而确定该氨基酸在蛋白质分子中的作用。（2） 定向进化技术：人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。易错PCR：是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。连续易错PCR策略：即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。DNA改组和外显子改组：DNA改组又称有性PCR，策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会,导致更大的变异,最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组,不仅可加速积累有益突变,而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。外显子改组类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，与但与其不同，它是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制