《分子生物学电子版修正版教案资料.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学电子版修正版教案资料.doc（38页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分子生物学电子版修正版-1.snRNA：小核RNA，只存在于细胞核或者核质核仁中的一类小分子量的RNA，具有独特功能并且独立存在的实体，约为70-300个核苷酸，可参与真核生物的RNA剪接。2.siRNA：即干扰RNA，一类小分子量的RNA，可以高效，特异地阻断体内同源基因的表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定的基因缺失。3.核酶：一类具有催化活性的核糖核酸，呈锤头状，参加RNA的剪切和降解。与RNA酶有显著区别，它是RNA，后者是蛋白质。4.反义RNA又称调节RNA，是指能与特定mRNA互补
2、结合的RNA片段，即碱基序列正好与有意义的mRNA互补的RNA分子。5三链DNA：是在DNA双螺旋结构基础上形成的，由多聚嘧啶核苷酸或者多聚嘌呤核苷酸与DNA双螺旋形成的。/由于双螺旋的一股轻微折叠后，该股中的碱基可与双螺旋的碱基以Hoogsteen氢键相连如TAT、CGC、TAA、CGG。6.RNAi：即RNAi干扰，siRNA高效特异地阻断体内同源基因表达，促使同源RNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型的现象。7.何谓反义RNA？其功能和医学意义如何？答：又称为调节RNA，是指能与特定mRNA互补结合的RNA片段，也即碱基序列与有意义的mRNA互补的RNA分子。功能：a阻断mRNA的
3、翻译，b抑制DNA复制和mRNA的转录，c选择性的关闭基因。意义：参与基因调控：可用于基因治疗（病毒、肿瘤）；8什么叫做核酶？如何发挥作用？有何应用价值？答：即一类具有催化活性的核糖核酸。主要催化RNA的剪接反应和剪切反应。应用意义：通过设计合成特异性切割病毒以及病毒的RNA的核酶，对病毒和肿瘤的基因治疗将发挥重要作用。9.何谓RNAi？其作用机理和应用前景如何？答：即RNAi干扰，siRNA高效特异地阻断体内同源基因表达，促使同源RNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型的现象。作用机理：分为起始阶段和效应阶段。起始阶段Dicer酶以依赖ATP的方式切割外源性的双链RNA为小分子干扰RNA
4、，清除病毒，阻断转座子表达；效应阶段小分子干扰RNA结合核酶复合物形成RNA诱导活化的复合物及RISC，然后RISC结合至mRNA转录本上并切割它，从而发挥作用。应用前景：大通量研究基因功能的工具；基因敲除中的应用；用于基因治疗；基因表达的调控。第二章1移动基因：又叫转位因子（transposableelements）,由于它可以在染色体基因组上移动，甚至可在不同染色体间跃迁，故又称跳跃基因（jumpinggene）。2断裂基因：真核细胞的结构基因，其核苷酸序列中含有与氨基酸编码无关的DNA间隔区段，从而被分割成不连续的若干区域。将这种编码序列不连续，有间隔区段的DNA片断称为断裂基因3RNA
5、剪接：将断裂基因的内含子删除和表达子连接并最终形成成熟mRNA的过程。4重叠基因：不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。5假基因：在珠蛋白基因簇各片段核苷酸序列分析时发现，除了有正常的功能基因之外，还有功能失活的特殊序列片段，它不能行使表达功能。该类核苷酸序列中存在的无表达功能的畸变核苷酸序列片段。6卫星DNA：又称随体DNA,不编码蛋白质和转录RNA的小片段高度重复一类小片段DNA序列，多富含GC碱基在DNA浮力密度实验中会在主峰旁形成些小峰，形似卫星分布而称之。一般5-10bp短序列，人类为171bp，保护和稳定染色体7基因组：表示某物种单倍体
6、的总DNA。对于二倍体高等生物其配子的DNA总和即为一组基因组不同生物基因组数目不同。8LTR：即长末端重复序列，为RNA基因组的两端含有的U3RU5两个完全相同的正向重复序列。具随机整和能力，可用作病毒载体问答：1什么叫做基因？何谓基因的新概念？基因的主要功能是什么?答：基因就是指编码有功能蛋白质多肽链或RNA分子所必须的全部核酸序列。所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。功能：编码蛋白质或者RNA分子基本遗传信息的基本遗传单位，是构成DNA的功能单位。2.何谓转位子和转位作用？转位的后果如
7、何？答：一种大于2000bp的可以在染色体基因组上移动，甚至可以在不同染色体间跳跃的基因序列，也可以称为插入因子IS因子。转位作用：转位子具有双向整合特性，可以插入其他基因及自身基因不同位点上的移动方式。后果：可以在细菌染色体或质粒中随机转移，被插入的基因即失去活性。可以在染色体或质粒的某一IS上脱落转位至另一相同的IS上，引起突变或基因转移。3.何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明？答：四大里程碑：1944年Oswald报道肺炎球菌转化实验，明确遗传物质是DNA；1953年Jameswaston和FrancisCrick阐明了DNA双螺旋结构(半保留复制及其中心法则)；遗传密码子的破译；基
8、因转移载体的发现。三大技术发明：工具酶的发明（内切酶、合成酶、连接酶）；基因合成和测序（合成仪、测序仪）；PCR技术（PCR扩增仪）。第三章名词解释：1基因表达：是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA,再以mRNA指导翻译成蛋白质。2启动子：是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，内含-35区（与因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录起始点开始转录。3终止子：位于一个基因编码区下游提供终止信号的DNA序列，可以被RNA聚合酶识别并发出停止mRNA合成的信号。4起始密码子：编码多肽链的第一位氨基酸的密码子AUG（或ATG），编码甲硫
9、氨酸（蛋氨酸）。在细菌中也有罕见的其实密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表达作用AUGGUG。5终止密码子：有三个密码子（UAA,UAG，UGA），为终止密码子，只表示链的终止，不表达氨基酸。问答1外源基因在大肠杆菌中表达需要的条件有哪些？答：条件：一：外源基因插入序列必须保持有正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏或错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列；二：原核mRNA聚合酶能够识别插入的基因，三:外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的信使RNA在菌体必须相当稳定，并且能有效的进行翻译，转译的蛋白分子在菌
10、体内不至于受菌体蛋白酶的降解2影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？答：包括以下这些因素：启动子结构对表达效率的影响；表达载体的选择；外源基因中密码子的作用；mRNA的一级结构与基因表达；mRNA的二级结构对翻译起始的影响；mRNA稳定性的影响；转录终止区对外源基因表达效率的影响；转录后的若干因素与基因表达的关系；宿主选择对表达的影响；培养条件的控制对表达效率的影响。第四章名词解释：1锌指结构：由两个半胱氨酸残基和两个组氨酸残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构，表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关。2亮氨酸拉链：存在与蛋白C末端，为两组走向平行.带亮氨酸的螺旋形成的对称
11、二聚体，约为30个氨基酸，每两个亮氨酸之间隔有六个氨基酸，于是每两圈螺旋就有一个亮氨酸，排成一排，从而在2个-螺旋的蛋白分子之间形成一条拉链。3RNA编辑：是mRNA转录后因插入，缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白。4增强子：是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，可独立存在与上游区、下游区或基因内部，可进行远距离增强启动作用，而且无方向性。问答1真核表达调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？答：顺式作用元件有：启动子，增强子，沉默子，衰减子，终止子。作用特点：是能够与DNA结合蛋白质结合的特定序列的
12、DNA片段，决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应。2真核表达调控的反式作用因子有哪些？其作用特点？答：反式作用元件：主要分为通用转录因子和转录调节因子两大类。作用特点：一，同一DNA序列可被不同蛋白质识别；二：同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系，多通过蛋白质-蛋白质先结合再影响DNA。三：蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA的结合，导致构象上细微的改变，从而发挥调控作用。四：反式作用元件在合成过程中有相当大的可变性和可塑性。4常用的真核表达载体有哪些？并简述其特点。答：主要有一下几种：逆转录病毒载体，痘类病毒载体，HSV-I单纯疱疹病毒载体。特点：一，逆转录病毒载体：对细胞的感染效率高
13、，并能表达整合的病毒基因；可以同时感染大量细胞；长时间感染细胞并不会发生毒害作用；宿主范围十分广泛；可以进行DNA的单拷贝整合；但稳定性差，安全性差，重组病毒滴度不高而且局限于感染分裂细胞。二，痘类病毒载体：对多种细胞敏感易于培养利于大量生产制备；对外环境相对稳定并易于保存运输；接种途径简单易行；利于多价疫苗的研究开发；利于大片段的外源性基因的插入，且不影响病毒的正常复制和表达，但是基因组分子量大不易操作，没有mRNA的剪切功能故不宜采用基因组DNA，需使用无内含子的cDNA。三，HSV-I单纯疱疹病毒载体：比较大利于大片段的外源性基因插入提供条件，而且插入容量大；可以感染神经细胞。5简述真核
14、，原核俩大表达系统的优缺点？答：一，真核生物DNA只有一小部分是裸露的，有核膜包裹；原核生物大部分属于非结合状态，且无核膜的阻隔，转录的mRNA直接在胞质中进行蛋白合成。二，真核生物DNA都有内含子，可以剪接加以去除；原核生物mRNA的剪接加工能力。三，真核生物可以在需要时可以重排某些DNA片段和扩增特定基因的机制，而原核生物没有。四，真核生物有三种mRNA酶，可参与不同类型的RNA分子转录作用，而原核生物只有一种RNA酶。五，真核生物产生的mRNA分子寿命大多比原核生物长。六，真核生物具有对初级转录产物的剪接能力。七，真核生物不存在操纵子结构，原核生物多是。八，真核生物基因多拷贝，而原核生物
15、含有很少的重复序列。在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产
16、物的生物活性较低为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及；能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。第五章名词解释：1限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的
17、核酸内切酶。2同尾酶：有一些限制性核酸内切酶识别的碱基顺序不完全恒定，即识别顺序不同，但酶切后产生同样黏性末端的两种酶称为同尾酶，如BamH和Bgl。3同裂酶：识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶。如:Mbo和Sau3A共同识别序列GATC，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。4甲基化酶：常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相应碱基甲基化。常用于使酶切位点中的碱基甲基化而避免降解，保护酶切位点。5Klenow酶：为DNA聚合酶大片段，分子质量为7.6KD，是经过枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶，切除小亚基，保留的大亚基部分。这种酶只有DNA聚合酶的活性和3/外切
18、酶的活性，但是没有5/外切酶活性。6碱性磷酸酶：该酶的功能是以单链或双链的DNA、RNA为基质，将DAN或RNA片段的5端的磷酸切除，产生5-OH7逆转录酶：又称为依赖RNA的DNA聚合酶，可以RNA为模板，逆转录成cDNA第一链，这种酶具有聚合酶活性和3外切酶活性。8DNA连接酶(Ligase）:是一种能够催化在双股DNA链的3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。问答：1影响型核算内切酶活性的因素有哪些？如何克服？答：一、DNA的纯度。限制性核酸内切酶消化DNA底物的反应速率，很大程度
19、上取决于所使用的DNA本身的纯度。在DNA制剂中的你、某些污染物质，如蛋白质、酚、氯仿、究竟、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸钠）以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切酶的活性。克服的方法为：a、增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些；b、扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应的稀释；c、延长酶催化反应的保温时间。二、DNA的甲基化程度。限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列，因此甲基化会强烈的影响酶的活性。为了避免这种问题，在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。三、酶切消化反应的温度。不同的限制性核酸内切酶具有不同的
20、最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数限制酶的标准反应温度是37C，但也有例外。温度过高或过低都会影响酶的活性甚至最终导致其完全失活。四、DNA分子结构。有些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的酶量要比消化线性DNA高出许多倍，而有些限制性核酸内切酶切割他们自己处于不同部位限制位点的效率也有明显的差别。五、限制性核酸内切酶的缓冲液。不同的内切酶对盐浓度要求不一样。同时还有其他一些如巯基试剂、适宜PH值、甘油体积分数等对不同的内切酶来说要求也不同2如何实现DNA粘性末端连接?单酶切点的连接如何降低本底和克服自我环化？答：用同一限制性内切酶对载体及外源DNA作相同消化，随后
21、把这两种DNA混合起来，加入DNA连接酶，便可产生出稳定的杂种DNA。上述方法的缺点是限制酶切割产生的具有黏性末端的载体DNA分子连接反应混合物中会发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构，使得只含有载体分子的转化子克隆的“本底”比例大幅度上升。克服这一缺点的方法是：用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶（BAP或CAP），预先处理线性的载体DNA分子，以移去其末端的5/-P基团，于是在连接反应中，它自己的两个末端就再也不能被连接酶共价连接起来了。这样形成的杂种DNA分子的每一个连接位点中，载体DNA都只有一条链是外源DNA连接上的，而另外一条链由于失去了5/-P基团，不能作
22、此连接，故留下一个具有3/-OH和5/-OH的缺口，尽管如此，这样的DNA分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞内完成缺口的修复工作。3基因片段与载体间的平末端连接有什么方法？答：连接平末端DNA分子的方法有两种：一、T4连接酶连接法。T4DNA连接酶除了能封闭具有3/-OH和5/-P末端的双链DNA的缺口外，在存在ATP和加入高浓度酶的条件下，它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子，但其连接效率比黏性末端要低的多。二、同聚物加尾法。先用末端核苷酰转移酶给平末端DNA分子3/-OH基团端加上同聚物尾巴，再用DNA连接酶进行连接。为了在平末端的DNA分子上产生带有3/-OH的单链延伸，需
23、要用5/特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸。将要连接的DNA分子3/-OH基团端延伸出poly（dA）和poly（dT）或者poly（dG）和poly（dC）尾巴后，互补的尾巴就会连接起来，连接分子的裂口可通过大肠杆菌DNA聚合酶的作用予以补上，留下的单链缺口则可由DNA连接酶封闭。三、用化学合成的衔接物链接DNA分子。第六章名词解释：1.COS质粒，粘性质粒（Cosmid）带有噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子量小，可包装30-45kb外源基因，可由Ampr抗性筛选，常用于构建
24、基因文库。2.Cos位点（Cohesive-endsite）：DNA为线状双链分子，两端各有几个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。3.COS细胞：用一个复制起始部位缺失的SV40突变种感染猴细胞，由于病毒DNA不能自主复制，便整合到宿主染色体DNA中，病毒DAN?,早期基因表达产生功能性的T抗原，这样的细胞就叫COS细胞。问答：1基因重组是常用哪几种载体？其共同特点如何？答：常用载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（COS、M13）、动物病毒；共同特征：自主复制易于扩增分离纯化有非必需区有单一酶切位点（多克隆位点）单一酶切位
25、点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点；多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点有选择标记基因表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）2作为理想的质粒载体有哪些基本条件？答：作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。第七、八章名词解释：1RT-PCR：即逆转录PCR，先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成DNA,再以cDNA为模板进
26、行PCR反应。这样低浓度的mRNA被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测RNA的方法，可用于分析基因的转录产物、克隆cDNA及合成cDNA探针、改造cDNA序列等。2锚定PCR：在基因未知序列端添加同聚尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因配对互补结合后进行PCR扩增。3反向PCR：用限制性内切酶消化DNA，然后环化切割的的产物，再用已知序列上也可将两端相反方向的引物进行PCR，也可将环化DNA线性化再进行PCR，是扩增未知序列的简便方法。4原位PCR：直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增的方法。在单个细胞
27、中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交即可检出含该特异序列的细胞。5Southern印迹：将DNA经酶切后琼脂电泳分离，在凝胶中进行碱变性处理，再转移到硝酸纤维膜等固体载体上，用标记的DNA特异探针对固定在膜上的DNA进行杂交的方法。主要用来检测DNA限制性内切酶图谱。6Northern印迹：将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。7斑点杂交：直接将变性DNA样品点于硝酸纤维素膜上，固定好后先预杂交，再与标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗(低盐高温)，降低本底和提高特异性。探针与同源样品杂
28、交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂交。8原位杂交：用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞或组织切片中核酸进行杂交检测的方法.有两种：与胞内DNA的杂交和与RNA的杂交。9Western印迹:一种蛋白质的固定和分析技术，将蛋白质电泳分离后转移到硝酸纤维素膜等固体载体上，然后加入抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。10差异显示PCR：又称为差异显示RT-PCR，用于分离在不同的真核细胞中差异表达的DNA并加以克隆，产生不同长度的DNA片段，电泳后比较两者差别。该技术最大的优点是省去了cDNA克隆和随后繁杂的克隆筛选工作。问答：1试述PCR技术在基因诊断中的应用？举例说
29、明答：一，在法医学上的应用。即个人识别和亲子鉴定。二，遗传病相关基因的检测：如果碱基突变的位置与某种限制性内切酶的识别位点相关，突变会产生新的或消除原有的内切酶位点，那么用特定的限制性内切酶消化PCR产物，通过电泳酶切图谱就能直接判断碱基发生突变与否。若某一遗传病与这一酶切位点的存在或消失有连锁关系，PCR-RFLP即可用于该遗传病的诊断。用于遗传病的产前诊断比如苯丙酮尿症，镰刀状红细胞贫血，杜氏营养不良症，血友病。三，致病病毒的检测：检测HIV，HBV,HSV单纯疱疹病毒,HPV人乳头病毒,等。比如人类免疫缺陷病毒HIV-1是一种RNA的逆转录病毒，根据其保守序列设计引物，先用逆转录酶以RN
30、A为模板产生cDNA，再进行PCR扩增。该法比分子杂交、血清学等诊断方法敏感性高，且操作简便，是诊断HIV的最佳方法。直接检测临床标本中HBVDNA序列的存在，对确定患者血液标本的感染性。HCV是单股正链RNA病毒，可采用逆转录PCR结合巢式PCR法对急性丙型肝炎作出快速诊断四，肿瘤的诊断和研究如抑癌基因，癌基因的检测，肿瘤相关病毒基因的研究等。如人类一些血液系统的恶性肿瘤与特定的染色体易位或基因重排有关，这种易位、重排扰乱了基因的正常调控，可导致原癌基因从相对静止状态变成激活状态。应用PCR技术能发现微量存在有染色体易位的癌细胞。五，感染性疾病病原体的诊断和研究。比如在针对支原体，螺旋体，衣
31、原体，幽门螺旋杆菌等不易生长的细菌检测。2核酸探针标记常用哪些方法？答：一、探针放射性同位素标记法放射性同位素的选择：32P、35S或3H均可用于标记DNA或RNA。32P最常用于核酸的标记。35S适用于原位杂交和DNA序列测定。3H放射比活度低，故常用于原位杂交。核酸探针的标记方法缺口平移法大肠杆菌DNA聚合酶I具有53DNA聚合酶活性，以相对应的链为模板，从切口处3-OH端逐个加入新的核苷酸，此酶还具有53外切核酸酶活性，可从切口的5端逐个切去核苷酸，造成切口平移。若反应体系中存在一种或多种标记的核苷酸，如a-32PdNTP，则随着反应的进行，这些标记的核苷酸将置换原有的核苷酸，制备出核素
32、标记的DNA探针。缺口平移法适用于标记大于1kb的双链DNA。随机引物法：随机引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用随机引物，沿单链模板进行DNA的合成。末端标记只将DNA3端或5端标记的方法称末端标记，常用的方法如下：(1)DNA聚合酶IKlenow片段末端标记法(图7-3)。用该酶将含有核素标记的dNTP补平切口或粘性末端。(2)T4DNA聚合酶标记法。加入dNTP后抑制外切活性可将标记的dNTP进行填充标记。(3)T4多核苷酸激酶标记法。用该酶可将g-32P从g-32PATP转移至核酸的5-OH端(4)末端脱氧核苷酸转移酶标记法。将多种标记的dNTP逐个转移到核酸缺口中的3-OH端，形成长
33、尾标记。二、非放射性标记核酸探针：生物素标记：生物素能以共价结合方式连接到UTP或dUTP的嘧啶环C5位置上，形成生物素化的核苷酸。其标记方法有掺入标记法和光敏生物素标记方法。1.掺入标记法：生物素标记的dNTP可代替相应的单核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，通过随机引物法或缺口平移法，将生物素化核苷酸掺入到DNA分子中，获得生物素标记的DNA探针。2.光敏生物素标记法：先通过连接臂将一个光敏基团连接于生物素，成为光敏生物素(photobiotin)半抗原地高辛配基标记方法：将Dig与dUTP(或dCTP，dCTP)相连生成Dig-dUTP复合物，再通过切口平移法和随机引物法将其掺入到DNA上。
34、3核酸分子杂交在基因诊断中的应用？举例说明。答：核酸杂交（Nucleicacidhybridization）是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。常用的技术有Southern印迹、Northern印迹、斑点杂交、原位杂交等。通过核酸杂交技术，可以利用带有某种标记的已知核酸片段作为探针，去检测未知核酸序列。因此，核酸杂交可用于基因鉴定和基因突变分析等领域1、限制性片段长度多态性（RFLP）分析：多态性（polymorphism）指基因组中特定基因座位（DNA序列）存在两种或两种以上状态（等位基因），并且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于1%。
35、限制性片段长度多态性（RFLP）是由于DNA变异（产生新的酶切位点或消除原有的酶切位点）导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度的片段。可借助southernblotting或PCR的方法进行检测RFLP分析与遗传病基因诊断。人类染色体VNTR序列的RFLP分析图谱：DNAfingerprinting。2、等位基因特异性寡核苷酸（ASO）探针杂交寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。3、基因表达分析常用Northernblotting或原位杂交分析。第九章名词解释：1基因组文库：分离真核生物中某种DNA
36、成分,通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克隆株群体称基因组文库。2.cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库（genelibrary）。问答1目的基因克隆时常用哪些方法分离和获得基因？答：一、化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其对应的多肽链氨基酸序列。第一个核苷酸固定于不溶性的固相载体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3、5-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物,再用同样的
37、步骤与下一个核苷酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。二、聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因：以DNA变性复制的某些特性为原理，以目的DNA片段为模板,利用酶促反应（Taq酶），在特定引物的引导下，将加入的4种dNTP由引物沿模板从53按碱基配对原则,形成与模板DNA互补的半保留复制链,新合成的链又可作为下一轮循环的模板。经25-30个循环产物呈2n指数扩增，由pgg（紫外可见），可获得基因片段三、建立基因组DNA文库：分离真核生物中某种DNA成分,通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆
38、菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克隆株群体称基因组文库。四、构建cDNA文库筛选目的基因：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库（genelibrary）五、其他方法构建差示文库筛选特殊基因差示文库；mRNA差异显示法获得目的基因；基因改造可获得新型目的基因2.构建基因组文库的意义及构建过程如何？答：意义：提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5端控制基因转录的调控序列,内含子的分布和作用,以及重复序列的数量分布及大小过程：分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA；制备全部基因组的DNA片断。机械断裂法:用超
39、声波或高速搅拌DNA溶液断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端，因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用EcoR,现在用Sau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。DNA片断与载体的连接包装常用载体：粘性质粒噬菌体酵母人工染色体基因组DNA+粘性质粒重组DNA转化细菌菌落基因组DNA+噬菌体重组DNA包装成噬菌体感染细菌噬菌斑1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。3构建cDNA文库的意义？常用载体及构建过程如何？答：意义：通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因
40、所编码的蛋白质的相互作用关系因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。它是发现新基因和研究基因功能的工具。常用载体是质粒（噬菌体）。过程：1.制备mRNA1)取材：mRNA约占总RNA的15，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料；2)从总的RNA中分离mRNA：将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸oligo(dT)纤维素中进行亲和层析2.第一股cDNA合成1）以Oligo(dT)为引物：从模板3末端开
41、始，沿模板的35方向合成,对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA；2）随机引物：以68个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）3.第二股cDNA的合成自身引导法；置换合成法；外加引物合成法4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞4采用单酶切点法克隆基因时有什么缺点？如何克服？答：（1）高背景：载体经单一限制性核酸内切酶切割后，载体分子易于自我环化，既不利于目的基因的重组连接，大大降低阳性克隆效率，又可使非重组性载体造成高背景。应对方法：通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5-p以抑制DNA的自我环化。（2）双向插入：经单一限制核算内切酶切割的目的基因和载
42、体，因两者的粘性末端是相同的，因此在连接反应中，目的基因可发生双向插入。载体对目的基因的表达是有方向的，而目的基因可双向与之连接，这种连接如以克隆目的基因片段为目的则没有影响，若以表达为目的，就要对插入的片段进行方向鉴定。应对方法：若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以使定向克隆。5目的基因与载体的连接方法有哪些？基因重组时在俩个酶切位点中其中有一个不相匹配时，你如何解决连接问题？答：连接方法：粘性末端的连接：1单酶切点的粘性末端：目的基因片段与载体由相同的单一限制性内切酶消化酶切后，两者的末端均具有相同的粘性末端，然后两者相互连接。2
43、.双酶切片段的定向克隆使外源性DNA片段定向插入到载体分子中的克隆，是用两个不同的限制性内切酶切割目的基因，使之产生两个不同的粘性末端，载体也用相同的两个限制性内切酶将载体切开，此时载体不仅不会发生自我环化，而且只能在DNA连接酶的作用下与目的基因的相应的粘性末端互补连接平端连接法：1.同聚物加尾法；2.用衔接物连接法；3.适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）；4.TA克隆法TaqDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时,能不依赖模板而在扩增产物两3端加上两个游离的“A”。6试述T-A克隆法的原理和用途。答：T-A克隆法是一种对PCR产物直接克隆的技术。TaqDNA聚合酶在扩增目的基因DNA
44、的同时,能不依赖模板而在扩增产物两3端加个游离的“A”。这样只要载体切口处人工加上游离的“T”，PCR产物即可与载体连接。这种技术使得PCR产物的克隆变得非常简单。第十章1转染：病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。2转导：以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。3转化：以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化，常见的转化方法有：原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法4-互补：原理：所谓基因内互补作用，在LacZ体系中,是指二个彼此互补的突变基因（突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的
45、近操纵基因而无-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过肽互补作用可呈现有功能的-半乳糖苷酶活性,进而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-青定蓝,使菌落呈现出蓝色反应。问答1重组DNA向受体细胞的导入方法有哪些？答：一.转化:以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞。转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法。原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA
46、，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。化学转化法:将对数生长期的细菌在0下,用预冷的CaCl2溶液低渗处理,以使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加,菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内。电穿孔法：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,在脉冲过后,微孔复原。二、通过接合作用传递质粒DNA：质粒由F+向F菌的转移过程叫接合作用传递质粒,又称质粒的接合传递。凡带有在染色体上整合F质粒的细菌又称高频重组株系（Hfr株系）。Hfr株系不稳定，F质粒可发生接合传递质粒DNA,F+菌株可失去F质粒,F菌也可获得F质粒,其转移难以人为控制,又不稳定，通常不用作克隆载体。三、通过
47、转染/转导作用传递遗传物质。转染：病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）的过程称转染。转导：以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程称转导。原理：1.重组外源基因的噬菌体DNA,体外包装成噬菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。2.噬菌体的主动感染将含有外源DNA片段的重组噬菌体DNA导入宿主菌体内。2如何利用抗体标记基因筛选阳性克隆？答：大多数质粒载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄西林基因，抗四环素基因等，当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌能在相应抗生素的琼脂平板上生长，并形成菌落，而未被转化的原宿主菌则不能
48、生长，据此可筛选携带外源基因的重组DNA转化子。在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因DNA片段插入其中一个抗性基因，就会导致该抗性基因的功能失活，用两个分别含不同抗生素药物的平板进行对照筛选，可筛选出阳性重组子克隆菌体。3、 如何从所克隆到的基因重组体载体中鉴定基因的存在和正确性？答：（1）重组子大小鉴别筛选：重组子中装有一段较大分子量的外源性基因，其分子量明显比原载体大很多，因此可将提取的重组载体和原载体，用一种限制性内切酶消化后，直接进行凝胶电泳，从而据其电泳特性而初步筛选重组子中是否插入外源基因片段。（2）酶切鉴定：对于筛选出的具有重组子的菌株，经小量培养后，再分别提取原载体或重组载体DNA，根据已知重组时外源基因两端的酶切位点，用相应的两种内切酶进行酶解，经琼脂糖电泳后，就可以看出载体中是否含有目的基因片段，以及有DNAmarker条带对比分析可得知插入基因片段的大小。（3）PCR筛选法：利用能与插入基因片段两端互补的特异引物，以少量抽提的重组子DNA为模板进行PCR分析，能扩增出特