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1、原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制一、杂交前准备（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触
2、标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。注意：DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。（二）载玻片的处理组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗23次，置160以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。（2）HCl处理法试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇步骤: a. 玻片在室温下于1M
3、 HCL中浸泡30分钟 b. DEPC水中洗片 c. 95%乙醇中洗片 d. 空气中干燥 e. 重复一遍 ad. f. 铝箔包好备用.（三）硅化【方法】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。（5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于180烘烤4h过夜
4、。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。附：2%DMDCDMDC2ml 三氯乙烷 98ml配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于250以上烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60烧干。【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅
5、浣）法 试剂: 2%的APES/丙酮(V/V),丙酮,DEPC水 步骤: 1. 玻片先于室温中在APES液中浸泡10秒2. 丙酮中洗涤3.DEPC水中漂洗4.空气中干燥5.4度保存(最好用铝箔包好,避免污染)仪器专场展示：化学试剂标准物质生化试剂常用试剂试剂配制原位杂交组织化学【方法4】（1）49ml氯仿与1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水冲洗；（3）玻璃器皿使用前位于180以上烘烤2h以上，塑料器皿应于60烘烤过夜。注意：DMDC有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤或吸入。（四）载片的包被（粘贴）沾附
6、剂（1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)储备液（05%）: PLL 25mg,DEPC水 5ml 按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装，-20存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。工作液（0.01%）：0.5% PPL, DEPC水 50ml充分混合，静止待气泡消失。（2）明胶液配方: 明胶 2.4g, 甲明矾 2.4g, DEPC水 1000ml配法：先称取明胶溶于500800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在60左右，效果
7、最佳。方法同PLL包被玻片。2多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）（1）将事先准备好的经160以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4备用。注意：浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；干燥过程中注意避免尘埃污染；按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4更长），但仍建议尽早使用。（2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0），将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于
8、细胞涂片和切片。（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5l/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。（4）Vectabond粘附剂该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日久，可能由于包被不完全或局部脱落而致
9、切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：标本（铺片、切片等）丙酮（5min）Vectabond试剂工作液（5min）dH2O(25min)干燥（温箱，数小时过夜）用铝箔包好，室温备用。注意：制备和保存过程中避免污染。经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4可更长）。（五）硅鱼精子DNA的制备（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；（2）加入2.5ml 2mol/L HCl，室温放置
10、，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（23min）；（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置5015min助溶；（4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）；（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.07.5；（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20l DNA液混合于980l水中，混匀后测定，吸收值乘以50即为DNA浓度（g/ml）；（8）
11、制备好的DNA液储于-20备用，用前取出冻融后煮沸。二、关于探针的标记（一）cRNA探针的同位素标记1 标记液（转录标记）5X转录缓冲液 2ulDDT(400mmol/L 1ul线性化DNA探针(模板) (1ug/ul) 1ug32P-CTP(12.5umol/L-50uCi 5ulRNA多聚酶(20u/ul) 1ul2 转录缓冲液Tris-HCl(pH7.5)200mmol/L,MgCl2 30mmol/L, 精眯 10mmol/L,DTT50mmol/L, BSA(不含RNA酶)0.5mg/ml, HPRI 5000u/ml,ATP,GTP,UTP各 2.5mmol/L, CTP*：用地高
12、辛或生物素标记时，用UTP替代。3 标记终止液无RNA酶的DNA酶 1ul,tRNA(10mg/ml)1ul,灭菌去离子水 188ul4标记探针水解液0.4mmol/L 碳酸氢钠20ul, 0.6mmol/L 碳酸钠 20ul, 灭菌去离子水 160ul.先用dH2O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60条件下反应。5探针水解时间注：LO探针初始长度（kb）Lf探针的终长度（kb）K0.11kb/min6探针水解终止液 3mmol/L醋酸钠6.6ul, 醋酸 1.3ul每次加入充分混合，临用前配。7探针沉淀液 7mmol/L醋酸胺 100ul,纯酒精750ul, rRNA(10mg/
13、ml) 2ul每次加入，充分混合，新鲜配制。（二）寡聚核苷酸3端标记（cRNA探针）1 标记反应液寡核苷酸 20ng, 5X转录缓冲液4ul, 32P-dATP(3000Ci/mmol/L) 7ul,CoCl22ul, 末端转移酶 1ul, 灭菌去离子水20ul.2终止液：0.2mol/L EDTA3.探针沉淀液 tRNA 1ul, 7mmol/L 醋酸胺100ul, 纯乙醇750ul（三）cRNA探针非同位素标记（地高辛及生物素）1 标记液5X转录缓冲液2ul, 0.2mmol/L DTT 1ul, 模板DNA(1ug/ul) 1ul,Dig-11-UTP(10mmol/L) * 1ul,3
14、2PCTP# 1ul,RNA 聚合酶(20u/ul)1ul, 无菌去离子水3ul*：生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP#：为检测标记率而加。2转录标记终止液（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法（2）生物素标记终止液： 无RNA酶的DNA酶(1u/ul) 1ul,tRNA(10mg/ml)2ul,HPRI 1ul,灭菌去离子水 186ul（四）DNA探针标记常用试剂的配制（1）10 缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/L-巯基乙醇、1mg/ml BSA。（2）缺口平移反应终止液：200mm
15、ol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。（3）DNase:干粉状DNase(20003000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10l分装，-20保存一年。（4）10DNA聚合酶（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。（5）10激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20mmol/L DTT; 1.0mmo
16、l/L亚精胺。（6）10随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L -巯基乙醇；500g/ml BSA。（7）1加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。（8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室温保存。（10）4mol/L醋酸钠：
17、取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45m膜过滤，室温保存。（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。（12）20SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。（14）10激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgCl2;50mmol/l DTT;10
18、mmol/L亚精胺（非必需）。（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/l，保存在甘油中，-20。（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l EDTA,pH8.0(20l 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-20贮存。（19）0.5mol/L
19、EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTANa22H2O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。（22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。（23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。三、固定剂进行原位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组
20、织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：能很好地保持组织细胞的状态；对核酸无抽提、修饰及降解作用；不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；理化性质稳定、价格低廉。1 4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）PFA 40g,DEPC水 500ml, 2XPBS 500ml 配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至6065，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500m
21、l 2PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4保存备用。注意：配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；加热时，温度不宜过高，常为6065，否则，PFA降解失效；配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。配法：按上述比例称取试剂，溶于DEPC水（也可用蒸馏水加DEPC）500800ml中，过滤后，加水定容至1000ml，高压灭菌。通常配制成10PBS的储备液，2PBS和1PBS可用DEPC水稀释获得。除用DEPC水配制PFA
22、外，也有用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.010.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事项同上。4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定412h，载片固定时间在1015min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。2甲醛10%甲醛（Formaldehyde,FA）量取市售甲醛(约40%)10ml和DEPC水90ml充分混合而可。较适于检测RNA的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。10%福尔马林试剂：较适于固定细胞。10%中性福尔
23、马林市售甲醛100mlNa2HPO44gNaH2PO46.5gDEPC水1000ml常用于石蜡样品切片的固定。10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用，干扰DNA变性，故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。34%戊二醛效果较40%差。40.1%戊二醛常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测DNA的原位组织杂交方法。5乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按3：1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测DNA时。乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交
24、中，但RNA保留较差，可本底很低，即背景染色淡。6甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比3：1比例充分混合即可。7甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。84%多聚甲醇-0.5%1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。四、LB培养基（一）液体LB培养基（Luria-Bertani培养基）配制：取一1000ml的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加H2O约500800ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高压灭20min。（二）琼脂糖平板培养基细菌培养用琼脂（或琼脂糖）15g液体培养基（如LB）1000ml按浓度比例，将
25、琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。五、小量质粒提取主要液体(见试剂盒)六、杂交前处理1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20存放
26、，用时再取出冻融，余者弃去。（2）工作液（临用前配）：取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。称取上述试剂，充分混合即可。1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：0.5mol/L的EDTA：2甘氨酸（1）1mol/L甘氨酸：（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：30.25%醋酸-0.25%醋酸酐配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl 5g，然后加入三乙醇胺13.2ml及浓HCl 4ml。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐2.5ml，充分混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，
27、最好在通风条件下进行。生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。4RNA酶 A溶液取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20储存。临用前，取RNA酶A储备液，用2SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。七、杂交用液1SSC（Standard Saline Citrate, SSC）通常配成10，20，50的储备液.2Denhard
28、ts液通常配成10，50或100的储备液3杂交液及予杂交液变性被打断的无关DNA（常为鲑精DNA或鲱精DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.52g/ml，DNA探针浓度为1g/ml,此外，如使用35S标记的探针，还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交
29、液及杂交后的洗脱液中。八、杂交后漂洗溶液无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。九、原位杂交信号显示目前应用原位杂交方法中，信号的显示主要有放射自显影，酶底物及免疫金银等方法，在此归纳有关的主要试剂。1A-B显影液A液: 对苯二酚 0.85g,柠檬酸钠 2.35 g, 柠檬酸 2.55ml, 去离子水 50ml.B 液: 硝酸银93mg, 去离子水 50ml.称取上述试剂，按配方分别溶于50ml ddH2O中，于显影前，在室温将两者（A液及B液）按1：1混合，稍加摇动促进混合，即可将贴有切片标本的切片放入显影液，于室温避光（可暗室）反应515min。显影时间和温度相关，需自己根据情况摸索。终止反应只需将显影液倒出，自来水冲洗即可。倒出的AB显影液可暂时不扔，光镜下观察，若明显显影不够，还可重新或继续显影。AB显影液要求临用前配制，在显影时才将AB二液混合。否则，A液过久会产生黄色沉淀，增加背景。AB液用于免疫金银法中，使金标记颗粒信号放大，形成棕黑色沉淀。2DAB-H2O显色液该液用于标本被标记上辣根过氧化物酶（HRP）的方法。产物为棕黄色。3NBT-BCIP显色液该液用于有碱性磷酸酶标记物的方法中。产物为紫蓝色。