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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。L-赖氨酸的故事：从代谢途径到工业生产-1L-赖氨酸的故事：从代谢途径到工业生产1Introducti导言22LysineBiosyntheticP赖氨酸合成途径33作为生产菌的CorynebacteriumglutamicumasaProductionOrgan谷氨酸棒杆菌3.13.1赖氨酸的合成LysineBiosynthes33.2中心碳代谢CentralCarbonMetaboli3.33.3最大赖氨酸生产能力MaximalLysineProductionCapacity44菌种工程Strain
2、Engineering4.14.1经典工程ClassicalEngineering4.24.2赖氨酸合成的代谢工程MetabolicEngineeringofLysineBiosynthesis4.34.3NADPH的代谢工程MetabolicEngineeringofNADPHMetabolism4.44.4前体物质代谢工程MetabolicEngineeringofPrecursorSupply4.54.5通过系统生物方法的菌种工程GlobalStrainEngineeringthroughSystemsBiotechnologyApproaches55工业生产过程IndustrialPr
3、oductionProcesses5.15.1大规模生产Large-ScaleManufacturing5.25.2工艺优化ProcessOptimizationAbstractl-lysineisanessentialaminoacidrequiredfornutritionofanimalsandhu-摘要L-赖氨酸是一种动物和人类所必需的氨基酸，maIthastobepresentinfoodandfeed,which,inmanycases,isreali它在很多食品和饲料中是存在的，但是在很多情况下，高纯度的赖氨酸是被添加到饲料中的。随着对赖氨酸生化调控途径的研究以及微生物高产氨基酸
4、能力的研究，Thehighimportanceoflysineinnu-在营养需求上，赖氨酸的重要性越来越突出。一个重要的里程碑是在1956年从土壤微生物中分离得到的谷氨酸棒杆菌能够生产谷氨酸，Asanimportantmilestone,theglutamateproducingsoilbacteriumCorynebacteriumglu-并很快被用于生产anotheraminoacidstemmingfromtheTCAcycle:lysinTCA循环产生的另一种氨基酸：赖氨酸，第一次lysineproducingstrainswereobtained.获得了赖氨酸生产菌株。Thepas
5、t50yearsfollowingthediscoveryof在发现赖氨酸生产菌后的50年内，对该菌的生理特性的了解得到很大的发展，并对工业生产菌株进行了开发和优化。Thishasresultedineffectivebiotechnologicalprocessescurrentlyusedforproducing目前，生物技术在生产过程中的使用，使赖氨酸的年产量大约在about750000tonsoflysineperyear.750000吨左右。Today,systems-orientedapproachesaimingatin-今天，面向系统的方法，旨在vestigatingtheli
6、nkbetweenthedifferentcomponentsofcellularphysiologysuchas研究细胞不同组成部分如transcriptome,fluxomeandmetabolome,provideanovelpowerfulplatformthatw转录子，磁通量子和代谢组分的联系，提供了一个新的强大的平台，将surelydrivefutureresearchtowardsholisticunderstandingoflysineover-producingmi-推动更全面的理解和研究赖氨酸高产微生物，得到更优越的生产菌株。11导言IntroductionTheesse
7、ntialaminoacidl-lysineisoneofthemostimportantaminoacids作为动物饲料添加剂，L-赖氨酸是最重要的必需氨基酸之一appliedassupplementinanimalfeed.。Animalfeed,whichistypicallybase动物饲料，通常是基于oncorn,wheatorbarley,ispoorinlysin玉米，小麦或大麦，但是它们赖氨酸含量是非常低的。丰富的赖氨酸添加Thesupplementationofsuchfeed到饲料中可以更好的促进猪、鸡等畜类的生长。在此之外，直接添加赖氨酸被证明是非常有用的，Itdoesn
8、otcauseanextrauptakeandmetabolizationofotheraminoaci它不会导致超出他们需要的其它氨基酸额外的吸收和代谢beyondtheirneedsothatsuperfluousformationofammoniaandenviron-，可以避免多余的氨的形成以及在肥料中因氮含量的增加所形成的环境负担。在过去20年，The全世界不同的国家continuingdevelopmentofanincreasedconsumptionofwhitemeatinvari-持续的白肉消费量的增加，导致赖氨酸市场的急速增大（图1）。Currently,the目前，wo
9、rld-wideproductionoflysineisabout750000tonswithapredictedma全球范围的每年赖氨酸生产量为75.00万吨，预计明年产量将增长约8。Sinceonlythel-isomeroflysine因为只有左旋异构体的赖氨酸作为iseffectiveasfeedsupplement,allmanufacturingprocessesutilizefermenta饲料添加剂是有效的，所有的制造过程将采用发酵法进行生产。Thecradleofbiotechnologicallysine赖氨酸的生物技术的摇篮productionstandsinJapan坐
10、落在日本，Stimulatedbytheincreaseddemandforamino氨基酸需求量的增加，acids,especiallyglutamate,alargescreeningprogramwasinitiatedinJap特别是谷氨酸，大约在50年前的1956年日本出现了大量的菌种筛选程序about50yearsagowhich,in1956,ledtothediscoveryoftheglutamateex-，导致了生产谷氨酸的微生物谷氨酸棒杆菌的发现。Withinafewyears,thefirstlysineexcretingmutantsofC几年之内，筛选得到了第一个生
11、产赖氨酸的突变菌株，而且在大规模生产中得到推广应用。Sincethenacontinuousoptimizationofprodu自那时以来，生产菌的发酵流程得到了不断的优化，导致赖氨酸的生产效率，renewableresourcescoveringthehighdemandforthiscompoundrequired包括生产赖氨酸所需的可再生资源，得到了很有效的提高。today(deGraafetal.2001;EggelingandSahm1999;Hermann2003;PfefferleFig.1Developmentoftheworld-wideannualbiotechnolog
12、icalproductionofl-lysine图1不断发展的世界各地每年通过生物技术生产的L-赖氨酸的量22赖氨酸合成途径Inmicroorganisms,lysinecanbesynthesizedbytwocompletelydifferent在微生物中赖氨酸的合成具有两个完全不同的routes:eitherfrom2-oxoglutarateandacetyl-CoAviathe-aminoadipate路线：一个是从酮戊二酸或乙酰辅酶A开始的通过-氨基已二酸的途径，另一个是routeorfromaspartateviathediaminopimelateroute.从天冬氨酸开始的通
13、过二氨基庚二酸的途径。Twovariantsofthe其中-氨基已二酸途径多occurinhigherfungiandinarchaealikeThermoproteusneutrophilusonthe发生在高等真菌，古细菌以及细菌中，分别由以下onehandandinthebacteriumThermusthermophilusontheotherhand.Infivereactionsthatarecatalyzedbyhomoisocitratesynthase(EC4.1.3.21)5个酶：高异柠檬酸盐合成酶，高乌头酸合酶/顺高乌头酸酶，homoaconitatehydratase/
14、cis-homoaconitase(EC4.2.1.36)andhomoisoci-异柠檬酸脱氢酶，-酮戊二酸和乙酰辅酶A催化生成-氨基已二酸，再经过-氨基已二酸还原酶，酵母氨酸还原酶和酵母氨酸脱氢酶催化生成赖氨酸。这这这一途径中首次是在嗜热链球菌中发现，-氨基已二酸转化生成赖氨酸经过乙酰latedintermediates中间体：2N2-acetyl-l-aminoadipate,-乙酰-L-氨基已二酸，2N2-acetyl-l-aminoadipyl-乙酰-L氨基-phosphate,N磷酸盐，N2-acetyl-l-aminoadipyl-乙酰-L氨基半醛和N2-acetyl-l-ami
15、noadipyl-乙酰-L-赖氨酸，这些中间体的编码基因分别为：catalyzedbythegeneproductsoflysX,lysZ,lysYandeitherlysJorargDandlysX，lysZ，lysY，要么lysJ或argD，eitherlysKorargE.要么lysK或argF。Inbacteriaandplants,lysinemaybesynthesizedfromaspartatebyone在细菌和植物中，赖氨酸是由天冬氨酸通过二氨基庚二酸途径合成的。该途径不同于常见的中间物四氢吡啶羧化酶（AsshowninFig.如图2所示），oneofthesepathway
16、sinvolvessuccinylatedintermediates,whiletheacetylase这些途径包括琥珀酰中间体，而乙酰化酶pathwaycomprisesacetylatedintermediatesandtheso-calleddehydroge-途径包括乙酰化中间体和所谓的脱氢nasepathwaydirectlyformsdl-diaminopimelatefromtetrahydrodipicolinate激酶途径直接从四氢吡啶羧化酶形成DL-二氨基庚二酸。recentlydescribedtooperateinChlamydia,convertstetrahydro
17、dipicolinate最近研究发现在衣原体中存在转氨酶途径，首先从四氢吡啶羧化酶形成LL-二氨基庚二酸，然后再转化为DL-二氨基庚二酸。大多数细菌只包括这些途径之一。Whereasthesuccinylasepathwayis但是琥珀酰途径presentbothingramnegativeandgrampositivebacteria,theacetylasevari-在革兰阴性和革兰氏阳性菌中都存在，而乙酰化酶途径只在芽孢杆菌种存在。Onlyinafew只有在少数organismslikedifferentspeciesofthegeneraCorynebacteriumandinBaci
18、l-生物中如棒状杆菌和浸麻芽孢杆菌属中两个途径是可以共存的。两个不同代谢途径的共同点在于均受到天冬氨酸激酶的反馈抑制调节。在谷氨酸棒杆菌中，天冬氨酸激酶有一个同功酶存在，它由两个基因：lysC和lysC编码，这两个基因是该酶的两个亚基的编码基因。赖氨酸和苏氨酸对该酶的生化活性具有反馈抑制作用，这个酶在芽孢杆菌中存在相同的反馈抑制作用，但是却存在两种不同的同功酶。目前存在的同功酶受赖氨酸和蛋氨酸的抑制作用，但是另外一个同功酶仅仅受苏氨酸的抑制作用。Itsactivityisbio-。此外，在有些细菌如大肠杆菌coliandB.和芽孢杆菌中，酶的活性调控代谢物在赖氨酸合成途径中还具有转录调控作用。
19、33CorynebacteriumglutamicumasaProductionOrganism作为生产菌的谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum,includingitssubspeciesBrevibacterium谷氨酸棒状杆菌，包括其亚种黄色短杆菌vum,Brevibacteriumlactofermentum,Corynebacteriumlilium,Corynebac-亚种，乳糖短杆菌，钝齿棒状杆菌和分枝短杆菌，isthemostimportantorganismforindustriallysineproduction.是赖氨酸工业生产中最重要的微生物
20、。其他物种Theonly唯一在otherspeciesusedforlysineproductionarerecombinantE.赖氨酸生产中使用的是重组的大肠杆菌菌株。20世纪50年代发现(Imaizumietal.2005,2006).。ThecapabilityofC.谷氨酸棒杆菌具有分泌aminoacidswasdiscoveredinthe1950s(Kinoshitaetal.1957;Udaka1960).氨基酸的功能是，该菌Itisagram-positive,rod-like,non-motile,aerobicbacterium(Fig.3).该菌该菌是革兰氏阳性，棒状，
21、非活动，好氧菌（图3）。图2二氨基庚酸途径和在原核生物中从天冬氨酸开始的赖氨酸的合成途径prokaryotes:succinylasepathway(A);acetylasepathway(B),dehydrogenasepathway(C),：琥珀酰途径（A）;乙酰途径（B），脱氢酶途径（C），andaminotransferasepathway(D).和转氨酶途径（D）Fur-Fig.3RasterelectronmicrographofCorynebacteriumglutamicumATCC13032cultivated图3谷氨酸棒状杆菌ATCC13032电镜图thercharacte
22、risticscompriseacellwallwitharabino-galactanandmycolic更详细的特点包括细胞壁上具有细胞壁半乳聚糖和具有26-36个碳原子组成的霉菌酸和通过中间交叉连接的acidswith26to36carbonatomsandamureinsacculuswithpeptido-glycan胞壁质囊酸聚糖，基因组TheGC-的GCcontentofitsgenomeis53.8%(Kalinowskietal.2003).含量为53.8。进一步Extensivebiochemical进一步进一步的生化studiesinthelastdecadesasrev
23、iewedinarecenthandbookonCorynebac-研究，如最近的谷氨酸棒杆菌手册，它综述了过去几十年teriumglutamicum(EggelingandBott2005)andtherecentunravellingofthe谷氨酸棒杆菌的研究和最近测序得到的genomesequence(Haberhaueretal.2001;IkedaandNakagawa2003;Tauch基因组序列，使我们对赖氨酸的生物合成和代谢反应有了更详细的了解ofthereactionsoflysinebiosynthesisandcentralmetabolisminthismicro-（
24、图4）。Fig.4图4CentralmetabolicpathwaysandlysinebiosynthesisinCorynebacteriumglutam-中央代谢途径和在谷氨酸棒状杆菌中赖氨酸的合成途径3.13.1赖氨酸合成LysineBiosynthesisLysinebelongstotheaspartateaminoacidfamilyandinC.赖氨酸属于天冬氨酸族氨基酸，在谷氨酸棒杆菌中是producedfrompyruvate,oxaloacetateandtwoammoniamoleculesinvolv-从丙酮酸，草酰乙酸和二个氨分子（供应生成还原型辅酶来增加能量）开始
25、合成的。Interestingly,theorganismhasasplitpathwayforthebiosynthesisofly-有趣的是，机体有一个赖氨酸合成分枝途径。Thetwoalternativebranches这个分支途径增加了改变谷氨酸棒杆菌环境条件的复杂性，例如氨含量的改变。dl-diaminopimelateasintermediateofthelysinepathwayaddition-DL-二氨基庚二酸作为赖氨酸途径的中间代谢物是胞壁质囊合成必不可少的组成部分。赖氨酸生物合成的调节物天冬氨酸激酶，是是催化天冬氨酸磷酸化的关键酶，该酶受Itisfeedbackregul
26、atedbyconcertedactionoflysineandthreonine(Kalinowskietal.1991).赖氨酸和苏氨酸反馈调节。ingblocksandcofactorslysineformationiscloselylinkedtothecentral赖氨酸合成中辅助因子的形成与中央新陈代谢是密切相关的metabolism.。Theenzymesinvolvedinlysinebiosynthesisaresummarized赖氨酸在合成过程中涉及的酶总结见inTable1.表1。3.3.2中央碳代谢CentralCarbonMetabolismThemostrelev
27、antsubstratesforindustriallysineproductionarestarchand赖氨酸工业生产中最重要的底物是淀粉和molasses.糖蜜。Theyarebasedonglucose,fructose,andsucroseasmajorcarbon它们是基于葡萄糖，果糖和蔗糖为主要碳sources.来源的，Thesecompoundsaretakenupviaphosphoenolpyruvate-dependent这些化合物通过磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统来吸收。Thecarbonsourcehasanin-碳源的选择决定谷氨酸棒杆菌在合成赖氨酸过程进入中
28、心代谢的入口，最早在谷氨酸棒杆菌中鉴定得到的中心代谢网络包括Thethepathwaysofglycolysis,pentosephosphatepathway(PPP),tricarboxylic糖酵解途径，磷酸戊糖途径，三羧酸acid(TCA)cycleandglyoxylatecycle,whiletheEntnerDoudoroffpath-循环（TCA）和乙醛酸循环，而恩特纳-杜德洛夫途径还没有被发现。磷酸戊糖途径中的氧化部分包括氧化还原型辅酶pendentenzymesglucose6-phosphatedehydrogenase(EC1.1.1.49)(Ihnen依赖性酶葡萄糖6
29、磷酸脱氢酶andDemain1969;Moritzetal.和6磷酸葡萄糖脱氢酶nase(1.1.1.44)(Moritzetal.2000;Ohnishietal.2005).激酶。对Bothenzymeswere这两种酶的动力学特性有更intensivelystudiedregardingtheirkineticproperties(Moritzetal.2000).深入的研究。谷氨酸棒杆菌代谢途径涉及到C44metabolitesoftheTCAcycleandC代谢的TCA循环和C33代谢的metabolitesofglycolysis糖酵解途径(Fig.4).（图4）。Foranap
30、leroticreplenishmentoftheTCAcycleC.该途径中具有补充TCA循环的丙酮酸羧化酶，phosphoenolpyruvatecarboxylase(EC4.1.1.31).磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，苹果酸酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，草酰乙酸脱羧酶，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，其中草酰乙酸脱羧酶和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的编码基因还没有找到，这两个酶催化reactionsfromtheTCAcycletowardsglycolysis.从TCA循环到糖酵解的脱羧反应。Inselectedcases,NADPH在特定的情况下，由苹果酸酶供应的还原型辅酶可以促进supplybym
31、alicenzymesupportsgrowthandlysineproductionofC.醋精促进菌的生长。However,deletionofmalE然而，苹果酶的删除并doesnotaffectgrowthofC.不影响以glutamicumonglucoseoracetate,suggesting葡萄糖或谷氨酸酯为营养元素的谷氨酸棒杆菌的增长，表明有还原型辅酶参与的代谢途径是非常复杂的，有人推断，enzymesbetweenpyruvate/phosphoenolpyruvateandmalate/oxaloacetateis丙酮酸之间的酶/磷酸和苹果酸/草酰乙酸循环合作参与了过剩A
32、TP的再生。Inadditiontothecentralcatabolicroutes,alsoanabolicpathwayshave除了中央分解途径，合成代谢途径也有了beenstudiedindetailprovidingdetailedinformationonthecellularcom-更深入的研究，它可以提供更详细的关于细胞的组成和前体物质的增长需求的信息。约16.4mmol还原型辅酶isrequiredforbiomasssyn-是生物量合成所必需的。thesis.。很明显，还原型辅酶的合成与赖氨酸合成是相互竞争的lysineproduction.。Consideringabi
33、omassyieldof0.5(gdrybiomass)(g在好氧条件下每合成0.5克（干物质/葡萄糖）生物产量需要至少合成,whichisachievedbyC.需要需要1.7摩尔还原型辅酶（摩尔葡萄糖），来促进磷酸戊糖途径和TCA循环的运行。Itshouldbenoted应当指出thattheknowledgeaboutthemetabolicnetworkiscontinuouslybeingup-有关代谢网络的知识正在不断增加，datedwithnovelfindingssuchasthedetectionofpyruvatecarboxylaseas例如作为补缺酶的丙酮酸羧化酶的鉴定
34、，特殊底物如蔗糖在菌的生长中所产生的一些新的反应。3.3.3最大赖氨酸生产能力MaximalLysineProductionCapacityThemaximalcapacity,iethetheoreticalmaximumyield,ofaC.谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸的最大能力，即理论上的最高产量是一个重要的特点，因为它提供anestimateoftheremainingoptimizationpotentialofarunningindustrial一个正在运行的工业程序和流程所剩余的优化潜力processandgivesadviceforprocessorgeneticengineers.
35、，提供建议或遗传工程。之前的化学metriccalculationconsideringonlythemajorpathwaysinvolvedinlysine度量计算只考虑所涉及到的赖氨酸代谢的主要途径，productionhaveyieldedamolarlysineyieldonglucoseof75%(Hollan-生产上理论推断得到最大75的葡萄糖摩尔赖氨酸产量。通过计量网络workanalysisconsideringthefullsetofavailablepathwaysinthecentral络网网络分析Amoredetailedinsightcanbegainedviast
36、oichiometricnet-对代谢途径有了更详细的了解，它可以考虑到在中央代谢途径中全部可用metabolismwithinformationonreversibilityorirreversibilityofthedif-的代谢，包括不同反应可逆或不可逆信息以及额外的补充和限制造成的metabolicnetwork.代谢网络。Thisapproach,namedelementaryfluxmodeanalysis这种方法被命名为初级流量模式分析，最近已应用于计算谷氨酸棒杆菌生产蛋氨酸的能力。这种分析方法得到的谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸Thetheoreticalmaximummolaryie
37、ldofC.的最大理论产量为82（图5）。硅片pathwayanalysisalsoprovidesinformationonthereactionscontributingto通路分析还提供了关于这一理论的最佳的生化反应信息thistheoreticaloptimum,iethecorrespondingtheoreticalmetabolicflux，即相应的理论代谢通量distribution.分布。Shownforoneoftheoptimalelementaryfluxmodes,ieopt最佳的基本流量模式，即最大赖氨酸产量，磷酸戊糖和苹果酸酶所提供还原型辅酶的最佳量在（图5）中有
38、详细的说明。Herebytheconcertedactionofpyruvatecarboxylase,malatedehy-丙酮酸羧化酶，苹果酸drogenase(EC1.1.1.37)andmalicenzymeformatranshydrogenase-likecycle脱氢酶和苹果酸酶形成一个像转氢酶的循环促使NADHconvertingNADHintoNADPHandthusprovidinganadditionalamountof转化为还原型辅酶，从而提供额外大量的重要的辅助因子。这种代谢周期不同于以前describedcyclicpathwayinvolvingPCx,PCK,a
39、ndMDHasshowntooper-描述的涉及到PCx，PCK，和MDH的体外循环途径。除了可溶性苹果酸脱氢酶，谷氨酸棒杆菌还有其他的促进草酰乙酸转化为苹果酸的酶：glutamicumposmembrane-boundmalate:quinoneoxidoreductase(MQO,EC1.1.99.16)：膜结合的苹果/醌氧化还原酶。这Both两个enzymesprobablycatalyzeacyclicreactioninvivoleadingtoanetoxida-酶在体内的催化反应可能是循环的，从而导致NADH进行氧化还原反应。Thedehydrogenasebranchoflys
40、in赖氨酸合成途径中脱氢酶分支是biosynthesisisthesolelysineproducingroute.是赖氨酸合成的唯一途径，这意味着通过TCA循环的通量为零，也没有生物量的形成，canhardlyberealized这是很难以实现。生产上的最佳生产率可以比理论最大值低一些生产，但是仍然大大要higherthantheyieldachievedinpractice,whichisintherangeofabout55%高于目前实践所取得的收益（大约55的范围）。44菌种工程Afterthediscoveryofitsabilitytoproduceandexcreteaminoa
41、cids在发现它有生产和排泄氨基酸的能力之后，谷氨酸棒杆菌被用于建立一个能生产calproductionprocessforseveralaminoacids.几个氨基酸的生化生产程序。多年来各种菌种methodsforstrainengineeringhavebeendevelopedtocreatemoreefficient菌种工程方法已被开发用来建立更加有效的productionstrains.生产菌株。4.14.1经典工程在谷氨酸棒杆菌被发现之后，通过对它进行反复的随机突变（紫外线或化学诱变）和选育才得到了第一个生产氨基酸菌株。在这些试验中成功的关键是使用toxiclysineanal
42、ogues,suchasS-(2-aminoethyl)cysteine,toscreenforfeed-有毒的赖氨酸类似物，如S-（2-乙基）半胱氨酸，来筛选具有耐药性的菌株。Thesestrainslaterall后来发现所有这些菌株revealedpointmutationsintheaspartokinasegene,throughwhichtheen-在天冬氨酸激酶基因上有点突变，使该基因编码的酶（受赖氨酸和苏氨酸反馈抑制）codedenzymewasreleasedfromfeedbackinhibitionbylysineandthreonine被释放。这是该菌可以进行ofthe
43、mostimportantcharacteristicsoflysineproductionstrainsatall.赖氨酸生产的最重要的特Fig.5MetabolicfluxdistributionofCorynebacteriumglutamicumwithmaximaltheoret-图5最大赖氨酸产量的谷氨酸棒状杆菌代谢流量分布征，后来还发展成可以减弱甚至blockedbiosynthesisofthreonine,ieauxotrophyforthreonine(Nakayama阻止苏氨酸的生物合成，即营养缺陷型菌株。Throughfurthercyclesofmutagenesis
44、andselectionstrains通过进一步的诱变和选育，获得其他氨基酸，维生素或抵抗不同抗代谢物得营养缺陷型菌。Thefirstproductionstrainswerecreatedwithinafewyearsafterthedis-株。随后mutantsfromsuchastraingenealogyexhibitedastepwiseimprovementof的突变体逐步得到改善，获得具有显著的生产特点显著的如转化率达50和赖氨酸盐酸生产性能titreabove100gL效价高于100的衍生株。在菌种发展过程中，Theadditionalnutrientrequirementan
45、dthe额外的营养需要和weakstresstolerance,duetothelargenumberofundesiredmutationsac-弱胁迫导致大量的不需要的突变株产生，但是这些不利的菌株促进菌株优化程序中更具有目的性的方法产生。通过目标通过基因来改善lysineproductionhadbeenidentified(seebelow),itbecamepossibletoin-赖氨酸生产已确定（见下文），这就有可能通过troducemutantallelesofthesegenesisolatedfromtheclassicallyobtained引入从野生型菌株中分离获得的突
46、变的等位基因来建立producerstrainsintothewildtypetogeneratestableandstress-tolerantly-sineproducerstrainswithoutadditionalnutrientrequirements(Georgietal.没有额外的营养需求的稳定的或耐胁迫的赖氨酸生产菌。4.24.2代谢工程的赖氨酸合成MetabolicEngineeringofLysineBiosynthesis随着分子生物学和基因工程手段的开展，可以通过对针对性的基因进行修Thepossibilitytoperformtargetedgeneticmodif
47、icationsthroughdevelop-改，ofeffortstowardsrationaloptimizationtoC.实现谷氨酸棒杆菌更合理的优化。Logically,manyofthesestudieshavefocussedonthe从逻辑上讲，这些研究很多都集中在optimizationofthefluxthroughthelysinebiosynthesisbydirectlymodifying通过直接修饰赖氨酸合成途径中的酶来优化流量分布（图5）。ieaspartatekinase(LysC),dihydrodipicolinatesynthase(DapA,EC4.2.
48、1.52)天冬氨酸激酶，二氢吡啶二羧酸合成酶andthelysineexporter(LysE),wasespeciallyvaluablewithrespecttoim-和赖氨酸运出酶这三个酶的修改，对于赖氨酸产量的提高具有很大的影响（图6）。Aspartatekinaseisthekeyenzym天冬氨酸激酶是赖氨酸代谢控制途径中的关键酶，它受afeedbackinhibitionbythreonineandlysine(Kalinowskietal.1991;Malum-苏氨酸和赖氨酸的反馈抑制。lysC基因-亚基编码区的不同点突变，可以释放反馈控制的enzymefromfeedback
49、controlandleadtoenhancedlysineformation(Cre-酶，并导致形成赖氨酸的产量增加。Similarly,alsooverexpressionoftheaspartatekinasegenestimulated同样，天冬氨酸激酶基因lysC的过表达也可以刺激production(Jettenetal.1995).生产。今天，具有反馈控制释放的天冬氨酸激酶feedbackcontrolisregardedasoneofthemostimportantfeaturesofindus-被认为是工业赖氨酸生产菌的重要特点。Thisisalsounderlinedbythevariouspatents这被认为是不同的模型具有不同的氨基酸含量变化（表1）。质粒编码的dapA基因的过表达显着increaseslysine(Bonnassieetal.1990;Cremeretal.