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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流L-赖氨酸的故事：从代谢途径到工业生产.精品文档.1 L-赖氨酸的故事：从代谢途径到工业生产1 Introducti导言 22 Lysine Biosynthetic P赖氨酸合成途径 33作为生产菌的Corynebacterium glutamicum as a Production Organ谷氨酸棒杆菌 3.1 3.1 赖氨酸的合成Lysine Biosynthes 33.2中心碳代谢Central Carbon Metaboli 3.3 3.3最大赖氨酸生产能力Maximal Lysine Production Capacity44菌
2、种工程Strain Engineering 4.1 4.1经典工程Classical Engineering 4.2 4.2赖氨酸合成的代谢工程Metabolic Engineering of Lysine Biosynthesis 4.3 4.3 NADPH的代谢工程 Metabolic Engineering of NADPH Metabolism 4.4 4.4前体物质代谢工程Metabolic Engineering of Precursor Supply 4.5 4.5通过系统生物方法的菌种工程Global Strain Engineering through Systems Bio
3、technology Approaches55工业生产过程Industrial Production Processes 5.1 5.1大规模生产Large-Scale Manufacturing 5.2 5.2工艺优化Process OptimizationAbstract l-lysine is an essential amino acid required for nutrition of animals and hu-摘要 L-赖氨酸是一种动物和人类所必需的氨基酸，maIt has to be present in food and feed, which, in many case
4、s, is reali它在很多食品和饲料中是存在的，但是在很多情况下，高纯度的赖氨酸是被添加到饲料中的。随着对赖氨酸生化调控途径的研究以及微生物高产氨基酸能力的研究，The high importance of lysine in nu-在营养需求上，赖氨酸的重要性越来越突出。一个重要的里程碑是在1956年从土壤微生物中分离得到的谷氨酸棒杆菌能够生产谷氨酸，As an important milestone, the glutamate producing soil bacterium Corynebacterium glu-并很快被用于生产another amino acid stemmin
5、g from the TCA cycle: lysinTCA循环产生的另一种氨基酸：赖氨酸，第一次lysine producing strains were obtained.获得了赖氨酸生产菌株。 The past 50 years following the discovery of 在发现赖氨酸生产菌后的50年内，对该菌的生理特性的了解得到很大的发展，并对工业生产菌株进行了开发和优化。This has resulted in effective biotechnological processes currently used for producing目前，生物技术在生产过程中的使用，
6、使赖氨酸的年产量大约在 about 750000 tons of lysine per year.750000吨左右。 Today, systems-oriented approaches aiming at in- 今天，面向系统的方法，旨在vestigating the link between the different components of cellular physiology such as研究细胞不同组成部分如transcriptome, fluxome and metabolome, provide a novel powerful platform that w转录子，
7、磁通量子和代谢组分的联系，提供了一个新的强大的平台，将surely drive future research towards holistic understanding of lysine over-producing mi-推动更全面的理解和研究赖氨酸高产微生物，得到更优越的生产菌株。 11导言Introduction The essential amino acid l-lysine is one of the most important amino acids作为动物饲料添加剂，L-赖氨酸是最重要的必需氨基酸之一applied as supplement in animal fee
8、d.。 Animal feed, which is typically base动物饲料，通常是基于on corn, wheat or barley, is poor in lysin玉米，小麦或大麦，但是它们赖氨酸含量是非常低的。丰富的赖氨酸添加The supplementation of such feed到饲料中可以更好的促进猪、鸡等畜类的生长。在此之外，直接添加赖氨酸被证明是非常有用的，It does not cause an extra uptake and metabolization of other amino aci它不会导致超出他们需要的其它氨基酸额外的吸收和代谢beyon
9、d their need so that superfluous formation of ammonia and environ-，可以避免多余的氨的形成以及在肥料中因氮含量的增加所形成的环境负担。在过去20年，The全世界不同的国家continuing development of an increased consumption of white meat in vari-持续的白肉消费量的增加，导致赖氨酸市场的急速增大（图1）。Currently, the目前， world-wide production of lysine is about 750000 tons with a pr
10、edicted ma全球范围的每年赖氨酸生产量为75.00万吨， 预计明年产量将增长约8。Since only the l-isomer of lysine因为只有左旋异构体的赖氨酸作为is effective as feed supplement, all manufacturing processes utilize fermenta饲料添加剂是有效的，所有的制造过程将采用发酵法进行生产。 The cradle of biotechnological lysine 赖氨酸的生物技术的摇篮production stands in Japan坐落在日本，Stimulated by the in
11、creased demand for amino氨基酸需求量的增加， acids, especially glutamate, a large screening program was initiated in Jap特别是谷氨酸，大约在50年前的1956年日本出现了大量的菌种筛选程序about 50 years ago which, in 1956, led to the discovery of the glutamate ex-，导致了生产谷氨酸的微生物谷氨酸棒杆菌的发现。Within a few years, the first lysine excreting mutants of
12、 C几年之内，筛选得到了第一个生产赖氨酸的突变菌株，而且在大规模生产中得到推广应用。 Since then a continuous optimization of produ自那时以来，生产菌的发酵流程得到了不断的优化，导致赖氨酸的生产效率，renewable resources covering the high demand for this compound required包括生产赖氨酸所需的可再生资源， 得到了很有效的提高。today (de Graaf et al. 2001; Eggeling and Sahm 1999; Hermann 2003; Pfefferle Fig
13、.1 Development of the world-wide annual biotechnological production of l-lysine 图1不断发展的世界各地每年通过生物技术生产的L -赖氨酸的量 2 2赖氨酸合成途径In microorganisms, lysine can be synthesized by two completely different 在微生物中赖氨酸的合成具有两个完全不同的routes: either from 2-oxoglutarate and acetyl-CoA via the -aminoadipate路线：一个是从酮戊二酸或乙酰辅
14、酶A开始的通过- 氨基已二酸的途径，另一个是route or from aspartate via the diaminopimelate route.从天冬氨酸开始的通过二氨基庚二酸的途径。Two variants of the 其中- 氨基已二酸途径多occur in higher fungi and in archaea like Thermoproteus neutrophilus on the发生在高等真菌，古细菌以及细菌中，分别由以下one hand and in the bacterium Thermus thermophilus on the other hand. In fi
15、ve reactions that are catalyzed by homoisocitrate synthase (EC 4.1.3.21)5个酶：高异柠檬酸盐合成酶，高乌头酸合酶/顺高乌头酸酶， homoaconitate hydratase/cis-homoaconitase (EC 4.2.1.36) and homoisoci-异柠檬酸脱氢酶，- 酮戊二酸和乙酰辅酶A催化生成-氨基已二酸，再经过-氨基已二酸还原酶，酵母氨酸还原酶和酵母氨酸脱氢酶催化生成赖氨酸。这这 这一途径中首次是在嗜热链球菌中发现，-氨基已二酸转化生成赖氨酸经过乙酰lated intermediates 中间体：
16、 2N2 -acetyl-l- -aminoadipate, -乙酰-L-氨基已二酸， 2N2 -acetyl-l-aminoadipyl- -乙酰- L氨基-phosphate, N磷酸盐，N2 -acetyl-l-aminoadipyl- -乙酰- L氨基半醛和N2 -acetyl-l-aminoadipyl- -乙酰- L-赖氨酸，这些中间体的编码基因分别为： catalyzed by the gene products of lysX , lysZ , lysY and either lysJ or argD andlysX，lysZ，lysY，要么lysJ或argD ，either
17、lysK or argE . 要么 lysK或argF 。 In bacteria and plants, lysine may be synthesized from aspartate by one 在细菌和植物中，赖氨酸是由天冬氨酸通过二氨基庚二酸途径合成的。该途径不同于常见的中间物四氢吡啶羧化酶（As shown in Fig.如图2所示），one of these pathways involves succinylated intermediates, while the acetylase这些途径包括琥珀酰中间体，而乙酰化酶pathway comprises acetylated
18、 intermediates and the so-called dehydroge-途径包括乙酰化中间体和所谓的脱氢nase pathway directly forms dl-diaminopimelate from tetrahydrodipicolinate激酶途径直接从四氢吡啶羧化酶形成DL-二氨基庚二酸。recently described to operate in Chlamydia , converts tetrahydrodipicolinate最近研究发现在衣原体中存在转氨酶途径，首先从四氢吡啶羧化酶形成LL-二氨基庚二酸，然后再转化为DL-二氨基庚二酸。大多数细菌只包括
19、这些途径之一。 Whereas the succinylase pathway is但是琥珀酰途径present both in gram negative and gram positive bacteria, the acetylase vari-在革兰阴性和革兰氏阳性菌中都存在，而乙酰化酶途径只在芽孢杆菌种存在。Only in a few只有在少数organisms like different species of the genera Corynebacterium and in Bacil-生物中如棒状杆菌和浸麻芽孢杆菌属中两个途径是可以共存的。两个不同代谢途径的共同点在于均受到天
20、冬氨酸激酶的反馈抑制调节。在谷氨酸棒杆菌中，天冬氨酸激酶有一个同功酶存在，它由两个基因：lysC和lysC 编码，这两个基因是该酶的两个亚基的编码基因。赖氨酸和苏氨酸对该酶的生化活性具有反馈抑制作用，这个酶在芽孢杆菌中存在相同的反馈抑制作用，但是却存在两种不同的同功酶。目前存在的同功酶受赖氨酸和蛋氨酸的抑制作用，但是另外一个同功酶仅仅受苏氨酸的抑制作用。Its activity is bio-。此外，在有些细菌如大肠杆菌coli and B.和芽孢杆菌中，酶的活性调控代谢物在赖氨酸合成途径中还具有转录调控作用。3 3 Corynebacterium glutamicum as a Produc
21、tion Organism作为生产菌的谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum , including its subspecies Brevibacterium 谷氨酸棒状杆菌，包括其亚种黄色短杆菌vum , Brevibacterium lactofermentum , Corynebacterium lilium , Corynebac-亚种，乳糖短杆菌，钝齿棒状杆菌和分枝短杆菌，is the most important organism for industrial lysine production.是赖氨酸工业生产中最重要的微生物。其他物种The onl
22、y唯一在other species used for lysine production are recombinant E.赖氨酸生产中使用的是重组的大肠杆菌菌株。20世纪50年代发现(Imaizumi et al. 2005, 2006).。The capability of C.谷氨酸棒杆菌具有分泌amino acids was discovered in the 1950s (Kinoshita et al. 1957; Udaka 1960).氨基酸的功能是，该菌It is a gram-positive, rod-like, non-motile, aerobic bacteriu
23、m (Fig. 3).该菌该菌 是革兰氏阳性，棒状，非活动，好氧菌（图3）。图2二氨基庚酸途径和在原核生物中从天冬氨酸开始的赖氨酸的合成途径 prokaryotes: succinylase pathway ( A ); acetylase pathway ( B ), dehydrogenase pathway ( C ),：琥珀酰途径（A）;乙酰途径（ B），脱氢酶途径（C），and aminotransferase pathway ( D ).和转氨酶途径（D） Fur-Fig.3 Raster electron micrograph of Corynebacterium glutami
24、cum ATCC 13032 cultivated 图3谷氨酸棒状杆菌 ATCC 13032电镜图 ther characteristics comprise a cell wall with arabino-galactan and mycolic更详细的特点包括细胞壁上具有细胞壁半乳聚糖和具有26-36个碳原子组成的霉菌酸和通过中间交叉连接的acids with 26 to 36 carbon atoms and a murein sacculus with peptido-glycan胞壁质囊酸聚糖，基因组The GC-的GCcontent of its genome is 53.8%
25、(Kalinowski et al. 2003).含量为53.8。进一步Extensive biochemical进一步进一步的生化studies in the last decades as reviewed in a recent handbook on Corynebac-研究，如最近的谷氨酸棒杆菌手册，它综述了过去几十年 terium glutamicum (Eggeling and Bott 2005) and the recent unravelling of the谷氨酸棒杆菌的研究和最近测序得到的genome sequence (Haberhauer et al. 2001;
26、Ikeda and Nakagawa 2003; Tauch基因组序列，使我们对赖氨酸的生物合成和代谢反应有了更详细的了解of the reactions of lysine biosynthesis and central metabolism in this micro-（图4）。 Fig.4 图4 Central metabolic pathways and lysine biosynthesis in Corynebacterium glutam- 中央代谢途径和在谷氨酸棒状杆菌中赖氨酸的合成途径3.1 3.1赖氨酸合成Lysine Biosynthesis Lysine belong
27、s to the aspartate amino acid family and in C. 赖氨酸属于天冬氨酸族氨基酸，在谷氨酸棒杆菌中是produced from pyruvate, oxaloacetate and two ammonia molecules involv-从丙酮酸，草酰乙酸和二个氨分子（供应生成还原型辅酶来增加能量）开始合成的。Interestingly, the organism has a split pathway for the biosynthesis of ly-有趣的是，机体有一个赖氨酸合成分枝途径。The two alternative branches
28、这个分支途径增加了改变谷氨酸棒杆菌环境条件的复杂性，例如氨含量的改变。dl-diaminopimelate as intermediate of the lysine pathway addition- DL-二氨基庚二酸作为赖氨酸途径的中间代谢物是胞壁质囊合成必不可少的组成部分。赖氨酸生物合成的调节物天冬氨酸激酶，是是催化天冬氨酸磷酸化的关键酶，该酶受It is feedback regulated by concerted action oflysine and threonine (Kalinowski et al. 1991).赖氨酸和苏氨酸反馈调节。ing blocks and co
29、factors lysine formation is closely linked to the central赖氨酸合成中辅助因子的形成与中央新陈代谢是密切相关的metabolism.。 The enzymes involved in lysine biosynthesis are summarized 赖氨酸在合成过程中涉及的酶总结见in Table 1.表1。 3.3.2中央碳代谢Central Carbon Metabolism The most relevant substrates for industrial lysine production are starch and 赖
30、氨酸工业生产中最重要的底物是淀粉和molasses.糖蜜。They are based on glucose, fructose, and sucrose as major carbon它们是基于葡萄糖，果糖和蔗糖为主要碳sources.来源的，These compounds are taken up via phosphoenolpyruvate-dependent这些化合物通过磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统来吸收。 The carbon source has an in-碳源的选择决定谷氨酸棒杆菌在合成赖氨酸过程进入中心代谢的入口，最早在谷氨酸棒杆菌中鉴定得到的中心代谢网络包括The
31、the pathways of glycolysis, pentose phosphate pathway (PPP), tricarboxylic糖酵解途径，磷酸戊糖途径，三羧酸acid (TCA) cycle and glyoxylate cycle, while the EntnerDoudoroff path-循环（TCA）和乙醛酸循环，而恩特纳-杜德洛夫途径还没有被发现。磷酸戊糖途径中的氧化部分包括氧化还原型辅酶pendent enzymes glucose 6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) (Ihnen依赖性酶葡萄糖6磷酸脱氢酶and
32、Demain 1969; Moritz et al.和6 磷酸葡萄糖脱氢酶nase (1.1.1.44) (Moritz et al. 2000; Ohnishi et al. 2005).激酶。 对Both enzymes were这两种酶的动力学特性有更intensively studied regarding their kinetic properties (Moritz et al. 2000).深入的研究。 谷氨酸棒杆菌代谢途径涉及到C44metabolites of the TCA cycle and C代谢的TCA循环和C33代谢的metabolites of glycolys
33、is糖酵解途径(Fig. 4).（图4）。 For anaplerotic replenishment of the TCA cycle C. 该途径中具有补充TCA循环的丙酮酸羧化酶，phosphoenolpyruvate carboxylase (EC 4.1.1.31).磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，苹果酸酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，草酰乙酸脱羧酶，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，其中草酰乙酸脱羧酶和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的编码基因还没有找到，这两个酶催化reactions from the TCA cycle towards glycolysis.从TCA循环到糖酵解的脱羧反应。In select
34、ed cases, NADPH在特定的情况下，由苹果酸酶供应的还原型辅酶可以促进supply by malic enzyme supports growth and lysine production of C.醋精促进菌的生长。 However, deletion of malE然而，苹果酶的删除并does not affect growth of C.不影响以glutamicum on glucose or acetate, suggesting葡萄糖或谷氨酸酯为营养元素的谷氨酸棒杆菌的增长，表明有还原型辅酶参与的代谢途径是非常复杂的，有人推断， enzymes between pyruv
35、ate/phosphoenolpyruvate and malate/oxaloacetate is丙酮酸之间的酶/磷酸和苹果酸/草酰乙酸循环合作参与了过剩ATP的再生。 In addition to the central catabolic routes, also anabolic pathways have 除了中央分解途径，合成代谢途径也有了been studied in detail providing detailed information on the cellular com-更深入的研究，它可以提供更详细的关于细胞的组成和前体物质的增长需求的信息。约16.4 mmol还原
36、型辅酶is required for biomass syn- 是生物量合成所必需的。thesis.。很明显，还原型辅酶的合成与赖氨酸合成是相互竞争的lysine production.。 Considering a biomass yield of 0.5 (g dry biomass) (g在好氧条件下每合成0.5克（干物质/葡萄糖）生物产量需要至少合成, which is achieved by C.需要需要1.7摩尔还原型辅酶（摩尔葡萄糖），来促进磷酸戊糖途径和TCA循环的运行。 It should be noted应当指出that the knowledge about the me
37、tabolic network is continuously being up-有关代谢网络的知识正在不断增加， dated with novel findings such as the detection of pyruvate carboxylase as 例如作为补缺酶的丙酮酸羧化酶的鉴定，特殊底物如蔗糖在菌的生长中所产生的一些新的反应。 3.3.3最大赖氨酸生产能力Maximal Lysine Production Capacity The maximal capacity, ie the theoretical maximum yield, of a C. 谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸
38、的最大能力，即理论上的最高产量是一个重要的特点，因为它提供an estimate of the remaining optimization potential of a running industrial一个正在运行的工业程序和流程所剩余的优化潜力process and gives advice for process or genetic engineers.，提供建议或遗传工程。之前的化学metric calculation considering only the major pathways involved in lysine度量计算只考虑所涉及到的赖氨酸代谢的主要途径， pro
39、duction have yielded a molar lysine yield on glucose of 75% (Hollan-生产上理论推断得到最大75的葡萄糖摩尔赖氨酸产量。通过计量网络work analysis considering the full set of available pathways in the central络网网络 分析A more detailed insight can be gained via stoichiometric net-对代谢途径有了更详细的了解，它可以考虑到在中央代谢途径中全部可用metabolism with informatio
40、n on reversibility or irreversibility of the dif-的代谢，包括不同反应可逆或不可逆信息以及额外的补充和限制造成的metabolic network.代谢网络。 This approach, named elementary flux mode analysis这种方法被命名为初级流量模式分析，最近已应用于计算谷氨酸棒杆菌生产蛋氨酸的能力。 这种分析方法得到的谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸The theoretical maximum molar yield of C.的最大理论产量为82（图5）。硅片pathway analysis also provi
41、des information on the reactions contributing to通路分析还提供了关于这一理论的最佳的生化反应信息this theoretical optimum, ie the corresponding theoretical metabolic flux，即相应的理论代谢通量distribution.分布。 Shown for one of the optimal elementary flux modes, ie opt最佳的基本流量模式，即最大赖氨酸产量，磷酸戊糖和苹果酸酶所提供还原型辅酶的最佳量在（图5）中有详细的说明。 Hereby the conc
42、erted action of pyruvate carboxylase, malate dehy- 丙酮酸羧化酶，苹果酸drogenase (EC 1.1.1.37) and malic enzyme form a transhydrogenase-like cycle脱氢酶和苹果酸酶形成一个像转氢酶的循环促使NADH converting NADH into NADPH and thus providing an additional amount of 转化为还原型辅酶， 从而提供额外大量的重要的辅助因子。这种代谢周期不同于以前described cyclic pathway invol
43、ving PCx, PCK, and MDH as shown to oper-描述的涉及到PCx，PCK，和MDH的体外循环途径。除了可溶性苹果酸脱氢酶，谷氨酸棒杆菌还有其他的促进草酰乙酸转化为苹果酸的酶：glutamicum posmembrane-bound malate:quinone oxidoreductase (MQO, EC 1.1.99.16)：膜结合的苹果/醌氧化还原酶。 这Both两个enzymes probably catalyze a cyclic reaction in vivo leading to a net oxida-酶在体内的催化反应可能是循环的， 从而导
44、致NADH进行氧化还原反应。 The dehydrogenase branch of lysin赖氨酸合成途径中脱氢酶分支是biosynthesis is the sole lysine producing route.是赖氨酸合成的唯一途径，这意味着通过TCA循环的通量为零，也没有生物量的形成， can hardly be realized这是很难以实现。 生产上的最佳生产率可以比理论最大值低一些生产 ，但是仍然大大要higher than the yield achieved in practice, which is in the range of about 55%高于目前实践所取得的
45、收益（大约55的范围）。44菌种工程After the discovery of its ability to produce and excrete amino acids 在发现它有生产和排泄氨基酸的能力之后，谷氨酸棒杆菌被用于建立一个能生产cal production process for several amino acids.几个氨基酸的生化生产程序。多年来各种菌种methods for strain engineering have been developed to create more efficient菌种工程方法已被开发用来建立更加有效的production strai
46、ns.生产菌株。 4.1 4.1经典工程在谷氨酸棒杆菌被发现之后，通过对它进行反复的随机突变（紫外线或化学诱变）和选育才得到了第一个生产氨基酸菌株。在这些试验中成功的关键是使用toxic lysine analogues, such as S-(2-aminoethyl) cysteine, to screen for feed-有毒的赖氨酸类似物，如S -（2 -乙基）半胱氨酸，来筛选具有耐药性的菌株。 These strains later all后来发现所有这些菌株revealed point mutations in the aspartokinase gene, through wh
47、ich the en-在天冬氨酸激酶基因上有点突变，使该基因编码的酶（受赖氨酸和苏氨酸反馈抑制）coded enzyme was released from feedback inhibition by lysine and threonine被释放。这是该菌可以进行of the most important characteristics of lysine production strains at all.赖氨酸生产的最重要的特Fig.5 Metabolic flux distribution of Corynebacterium glutamicum with maximal theo
48、ret- 图5 最大赖氨酸产量的谷氨酸棒状杆菌代谢流量分布征，后来还发展成可以减弱甚至blocked biosynthesis of threonine, ie auxotrophy for threonine (Nakayama阻止苏氨酸的生物合成，即营养缺陷型菌株。 Through further cycles of mutagenesis and selection strains 通过进一步的诱变和选育，获得其他氨基酸，维生素或抵抗不同抗代谢物得营养缺陷型菌。 The first production strains were created within a few years af
49、ter the dis-株。随后mutants from such a strain genealogy exhibited a stepwise improvement of的突变体逐步得到改善，获得具有显著的生产特点显著的 如转化率达50和赖氨酸盐酸生产性能titre above 100 gL效价高于100的衍生株。在菌种发展过程中，The additional nutrient requirement and the额外的营养需要和weak stress tolerance, due to the large number of undesired mutations ac-弱胁迫导致大量的不需要的突变株产生，但是这些不利的菌株促进菌株优化程序中更具有目的性的方法产生。 通过目标通过基因来改善lysine production had been identified (see below), it b