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1、关于酶免疫技术第一页，讲稿共五十一页哦第一节第一节 酶免疫技术的特点酶免疫技术的特点第二页，讲稿共五十一页哦主要试剂主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原酶标物特点：酶标物特点：免疫学活性免疫学活性 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特抗原抗体反应的特异性异性+酶高效催化反应的酶高效催化反应的专一性专一性原理及特点原理及特点第三页，讲稿共五十一页哦特点：特点：灵敏度高、特异性强、灵敏度高、特异性强、准确性好准确性好酶标记试剂能够较长时间酶标记试剂能够较长时间保持稳定保持稳定操作简便、对环境没操作简便、对环境没有污染。有污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围
2、更广的新衍生出适用范围更广的新方法方法。原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析性或定量的测定分析 原理及特点原理及特点第四页，讲稿共五十一页哦标记酶的要求：标记酶的要求：活性高活性高 性质稳定性质稳定 专一性强专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 一、酶和酶作用底物一、
3、酶和酶作用底物第五页，讲稿共五十一页哦辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm（辅基）（辅基）与与275nm275nm（主酶）（主酶）ODOD值之比值之比 RZRZ值与酶活性无关，值与酶活性无关，酶活性单位比酶活性单位比RZRZ值更值更为重要为重要 ELISAELISA中应用最为广中应用最为广泛的标记用酶泛的标记用酶 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物第六页，讲稿共五十一页哦碱性磷酸酶碱性磷酸酶（APAP）菌源性菌
4、源性AP AP 肠粘膜肠粘膜APAP 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-GalGal）用于均相酶用于均相酶免疫测定免疫测定 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物第七页，讲稿共五十一页哦HRPHRP的底物的底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2HD+2H2 2O O HRPHRP供氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，底物有习惯上被称为底物，底物有多种多种 H H2 2O O2 2为受氢体，为受氢体，HRPHRP对受氢体的专一对受氢体的专一性很高性很高 常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物第八页，讲稿共五十一页哦HRPHRP的常见底物的常见底物 邻苯二胺邻苯二胺 OPDO
5、PD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基-二二(3-(3-乙基乙基-苯并噻唑啉苯并噻唑啉磺酸磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSABTS常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物第九页，讲稿共五十一页哦OPDOPD反应后显橙黄反应后显橙黄色，加酸终止反应色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定后呈棕黄色，测定波长波长492nm492nm。不稳。不稳定，致癌性。定，致癌性。TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后，加酸终止反应后变为黄色变为黄色,测定波长测定波长450nm 450nm，稳定，无，稳定，无致癌性，致
6、癌性，ELISAELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。HRPHRP的常见底物的常见底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物第十页，讲稿共五十一页哦APAP的的底物底物-Gal-Gal的底物的底物 对对-硝基苯磷酸酯（硝基苯磷酸酯（pNPP pNPP）4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半-乳糖苷（乳糖苷（4MUG 4MUG）经经APAP作用后的产物为黄色对硝基作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为酚，最大吸收峰波长为405 nm405 nm。酶作用后，生成高强度酶作用后，生成高强度荧光物荧光物 ，用荧光计，用荧光计 测测量。量。常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物第十一页
7、，讲稿共五十一页哦酶免疫技术的核心组成酶免疫技术的核心组成部分部分 酶结合物酶结合物（conjugateconjugate）酶标记物酶标记物 通过化学反应或免通过化学反应或免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 二、酶标记抗体或抗原二、酶标记抗体或抗原第十二页，讲稿共五十一页哦抗原要求纯度高，抗原性完整抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。易纯化。制备方法要制备方法要求求酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原第十三页，讲稿共五十一页哦制备方
8、法要制备方法要求求技术方法简单、产率高，重复性好技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定酶标记物稳定 ，不形成聚合物，不形成聚合物酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原第十四页，讲稿共五十一页哦制备方法制备方法过碘酸钠法（直接法）过碘酸钠法（直接法）常用于常用于HRPHRP标记抗体或抗原标记抗体或抗原 戊二醛交联法戊二醛交联法酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原第十五页，讲稿共五十一页哦戊二醛交联戊二醛交联法法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRPHRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法
9、和和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。物质量较均一。酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原第十六页，讲稿共五十一页哦纯化及鉴定纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、游标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度性染色强度 常用的纯化方法：常用的纯化方法：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200
10、/G-150G-200/G-150过柱层析纯化过柱层析纯化50%50%饱和硫酸铵沉淀提纯饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原第十七页，讲稿共五十一页哦固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面相载体的表面 三、固相载体三、固相载体第十八页，讲稿共五十一页哦要求要求 结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性不影
11、响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济种类种类塑料制品塑料制品 微颗粒微颗粒膜载体膜载体 固相载体固相载体第十九页，讲稿共五十一页哦将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血清消小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附吸附包被包被coatingcoating封闭封闭blockinblocking g包被与封闭包被与封闭第二十页，讲稿共五十一页哦第二节酶免疫技术分类第二节酶免疫技术分类 第二十一
12、页，讲稿共五十一页哦酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均均 相相非均相非均相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量第二十二页，讲稿共五十一页哦用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗记物，通
13、过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。原或抗体的含量。原原理理一、均相酶免疫测定一、均相酶免疫测定第二十三页，讲稿共五十一页哦最具代表性的两种技术最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定第二十四页，讲稿共五十一页哦EMITEMIT示意图示意图第二十五页，讲稿共五十一页哦CEDIACEDIA示意图示意图第二十六页，讲稿共五十一页哦
14、分类：分类：液相酶免疫测定液相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（验（ELISAELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相与均相不同之不同之处处需分离游离与结合的酶标记物需分离游离与结合的酶标记物二、非均相酶免疫测定二、非均相酶免疫测定第二十七页，讲稿共五十一页哦第三节酶联免疫吸附试验第三节酶联免疫吸附试验 第二十八页，讲稿共五十一页哦底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体加入待测抗体或或抗原和酶标抗原和酶标抗原抗原
15、或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合的抗原抗体复合物物与未结合的分离与未结合的分离1234一、基本原理一、基本原理第二十九页，讲稿共五十一页哦固相的抗原或抗固相的抗原或抗体体 酶标记物（酶结合酶标记物（酶结合物物）酶反应的底酶反应的底物物 三个必要试剂三个必要试剂 二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理第三十页，讲稿共五十一页哦双抗体夹心法双抗体夹心法方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色体，加底物显色应用：应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原
16、、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCGHCG等等ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法第三十一页，讲稿共五十一页哦第三十二页，讲稿共五十一页哦1、已知抗体包 被于载体表面3、加酶标抗体 与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物 不产生颜色双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包 被于载体表面2、加待检物无抗 原与抗体结合3、加酶标抗体 无抗原结合+-E EE EE EE EE EE EE EE EE E第三十三页，讲稿共五十一页哦竞争法竞争法 方法：方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标用已知抗体包被，加入待测
17、血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）素等）ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法第三十四页，讲稿共五十一页哦第三十五页，讲稿共五十一页哦竞争法测抗原竞争法测抗原+-E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已
18、知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E第三十六页，讲稿共五十一页哦间接法间接法方法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgGIgG（抗抗体或二（抗抗体或二抗）加底物显色。抗）加底物显色。优点优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用应用 常用于常用于HCVHCV抗体、抗体、HIVHIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定EL
19、ISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法第三十七页，讲稿共五十一页哦第三十八页，讲稿共五十一页哦1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色间接法测抗体间接法测抗体-E EE EE EE EE EE EE EE EE E+第三十九页，讲稿共五十一页哦双抗原夹心法双抗原夹心法原理：原理：类似双抗体夹心法类似双抗体夹心法操作步骤操作步骤：类似类似 应用：应用：乙型肝炎表面抗体乙型肝炎表面抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗
20、体的方法第四十页，讲稿共五十一页哦竞争法竞争法原理：原理：类似检测抗原的竞争法类似检测抗原的竞争法 应用应用：乙型肝炎病毒核心抗体乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)(HBcAb)和和乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗体抗体(HBeAb)(HBeAb)的检测的检测 ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法第四十一页，讲稿共五十一页哦捕获法捕获法 应用：应用：病原体急性感染诊断中的病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗体型抗体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗体抗体 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗体抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的
21、方法第四十二页，讲稿共五十一页哦捕获法捕获法 原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标记特异加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体性抗原的抗体 底物显色底物显色 第四十三页，讲稿共五十一页哦捕获法原理捕获法原理+-E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4
22、 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加特异性抗原，不能与非原，不能与非特异性特异性IgMIgM结合结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体无抗原结合，无抗原结合，加底物不显色加底物不显色第四十四页，讲稿共五十一页哦第四十五页，讲稿共五十一页哦第四十六页，讲稿共五十一页哦第四十七页，讲稿共五十一页哦第第四节四节 酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用第四十八页，讲稿共五十一页哦均均相相酶酶免免疫疫测测定定主主要要用用于于药药物物和和小小分分子子物物
23、质质的的检检测测。非非均均相相免免疫疫测测定定中中的的ELISAELISA应应用用更更为为广广泛泛，ELISAELISA广广泛泛用用于于传传染染病病的的诊诊断断，病病毒毒如如病病毒毒性性肝肝炎炎（甲甲肝肝抗抗体体、“乙乙肝肝三三对对”、丙丙肝肝抗抗体体、丁丁肝肝抗抗体体、戊戊肝肝抗抗体体）、风风疹疹病病毒毒、疱疱疹疹病病毒毒、轮轮状状病病毒毒等等；细细菌菌如如结结核核杆杆菌菌、幽幽门门螺螺杆杆菌菌等等。也也用用于于一一些些蛋蛋白白质质检检测测，如如各各种种免免疫疫球球蛋蛋白白、补补体体、肿肿瘤瘤标标志志物物（甲甲胎胎蛋蛋白白、癌癌胚胚抗抗原原、前前列列腺腺特特异异性性抗抗原原等）。等）。第四十
24、九页，讲稿共五十一页哦1 1酶免疫技术的要点？酶免疫技术的要点？2 2酶联免疫吸附试验的原理（酶联免疫吸附试验的原理（ELISAELISA）？）？3 3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4 4常用的底物有哪几类？特点？常用的底物有哪几类？特点？5 5常用的酶有哪几类？特点？常用的酶有哪几类？特点？6 6何谓包被与封闭？其作用？何谓包被与封闭？其作用？7 7常用固相载体的种类和特点？常用固相载体的种类和特点？8 8举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。9 9ELISAELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？的非特异性干扰有哪些，其机制？1010对酶免疫技术的应用评价如何？对酶免疫技术的应用评价如何？思考题思考题第五十页，讲稿共五十一页哦感感谢谢大大家家观观看看第五十一页，讲稿共五十一页哦