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1、基因工程基本操作定稿第1页，本讲稿共20页一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.1.基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 受体菌包含了某种生物受体菌包含了某种生物所有的基因所有的基因，该受体菌群，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。体称为这种生物的基因组文库。2.部分基因文库部分基因文库 受体菌包含了一种生物受体菌包含了一种生物部分基因部分基因，该受体菌群体称为这，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如种生物的部分基因文库，如cDNA文库。文库。指满足人们需要，能编码蛋白质的指满足人们需要，能编码蛋白质的结构基因结构基因。第2页，本讲稿共20页3.基因文库的构建基因文库
2、的构建（1 1）基因组文库的构建）基因组文库的构建）基因组文库的构建）基因组文库的构建提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）片段）（2 2）cDNAcDNA文库的构建文库的构建文库的构建文库的构建mRNAmRNA反转录形成反转录形成反转录形成反转录形成mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物该生物
3、cDNA文库文库第3页，本讲稿共20页PCR技术技术聚合酶链式反应原理：原理：前提：前提：条件：条件：PCR扩增仪扩增仪DNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）DNADNA的两条链为模板的两条链为模板温度控制温度控制（二）利用PCR技术扩增目的基因第4页，本讲稿共20页PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，断裂，形成断裂，形
4、成_ _ b b、复性（、复性（55-6055-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链p 双链双链DNADNA是在高温条件下解链为单链是在高温条件下解链为单链DNADNA的，因此的，因此整个过程不需要解旋酶。整个过程不需要解旋酶。第5页，本讲稿共20页（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因蛋白质的氨基蛋白
5、质的氨基蛋白质的氨基蛋白质的氨基酸顺序酸顺序酸顺序酸顺序mRANmRAN核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列基因基因基因基因DNADNA的核苷酸的核苷酸的核苷酸的核苷酸序列序列序列序列目的目的目的目的基因基因基因基因推推测测推推测测合合成成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。序列已知时，可采用此种方法。序列已知时，可采用此种方法。序列已知时，可采用此种方法。第6页，本讲稿共20页目的：使目的基因在受体细胞中
6、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够能够表达和发挥作用表达和发挥作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因二、基因表达载体的构建第7页，本讲稿共20页1.下表关于基因工程中有关基因操作下表关于基因工程中有关基因操作的名的名词词及及对应对应的内容，正确的的内容，正确的组组合是合是第8页，本讲稿共20页3.PCR3.PCR技术扩增技术扩增DNA,DNA,需要的条件是需要的条件是()()目目的的基基因因引引物物四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸DNADNA聚聚合合酶酶等等mRN
7、AmRNA核糖体核糖体 A A、B B、C C、D D、2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.B.C.D.A.B.C.D.第9页，本讲稿共20页4.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测
8、C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接 5.哪项不是基因表达载体的组成部分哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因第10页，本讲稿共20页 目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 农杆菌农杆菌 导入植物细胞导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 1.1.农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞的染色体上可转移至受体细胞的染色
9、体上2.转转化化（一）导入植物细胞（2）基因枪法）基因枪法 （3）花粉管通道法）花粉管通道法三、将目的基因导入受体细胞导入受体细胞的方法导入受体细胞的方法 主要主要 是是借鉴细菌或病毒侵染细胞的借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径途径，且因受体细胞的不同而不同。，且因受体细胞的不同而不同。第11页，本讲稿共20页显微注射技术显微注射技术含目的基因含目的基因的表达载体的表达载体动动 物物 的的受受 精精 卵卵含目的基因的含目的基因的受精卵受精卵早早 期期胚胚 胎胎雌性动物输卵雌性动物输卵管或子宫管或子宫转基因转基因动动 物物显微显微注射注射分裂分裂分化分化移移 植植发发育育问题问题为什么将目的基因导入动
10、物细胞常用的受体细为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？胞是受精卵？（二）导入动物细胞第12页，本讲稿共20页（三）导入微生物细胞2.2.优点优点 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。简单、价格低廉。3.3.常用受体细胞常用受体细胞 大肠杆菌（大肠杆菌（E.coliE.coli）1.1.过程过程（1 1）制备感受态细胞：）制备感受态细胞：用用CaCa2+2+（CaClCaCl2 2）处理细菌，使细菌）处理细菌，使细菌细胞壁通透性增加，易于接受外源细胞壁通透性增加，易于接受外源DNADNA分子。分子。（2 2）重组）重
11、组DNADNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。CaCa2+2+处理法处理法第13页，本讲稿共20页四、目的基因的检测与鉴定 目的基因是否真正插入受体细胞的目的基因是否真正插入受体细胞的DNADNA中，是否能中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。鉴定才能得知。常用的检测手段主要从常用的检测手段主要从分子水平分子水平和和个体水平个体水平进行。进行。第14页，本讲稿共20页（一）分子水平1.1.检测转基因生物的染色体检测转基因生物的染色体DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入
12、了目的基因 提取受体生提取受体生物全部物全部DNA适当限制适当限制酶切割酶切割DNA片段片段用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交显显 出出杂交杂交带带（表明目的基因已插入）（表明目的基因已插入）分子杂交技术分子杂交技术2.2.检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA 提取受体生提取受体生物的物的mRNA用同位素标记的用同位素标记的目的基因片段杂交目的基因片段杂交显显 出出杂交带杂交带（表明目的基因已转录出了（表明目的基因已转录出了mRNA）检测检测DNA利用的是利用的是DNA与与DNA杂交，检测杂交，检测mRNA利利用的是用的是DNA与与mRNA
13、杂交。杂交。第15页，本讲稿共20页3.3.检测目的基因是否翻译出蛋白质检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术提取受体生提取受体生物的蛋白质物的蛋白质与相应抗体杂交与相应抗体杂交显显 出出杂交带杂交带（表明目的基因已形成蛋白（表明目的基因已形成蛋白质产品）质产品）（二）个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。第16页，本讲稿共20页归
14、纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCR扩增扩增u化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、Ca Ca 2+2+处理处理4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译第17页，本讲稿共20页1.1.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方
15、法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()()A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法2.早期的基因工程的受体细胞主要是（早期的基因工程的受体细胞主要是（）A动物细胞动物细胞 B植物细胞植物细胞 C.病毒病毒 D原核生物原核生物第18页，本讲稿共20页3.要检测目的基因是否成功的插入了受体要检测目的基因是否成功的插入了受体DNA中，需要用基因探针，基因探针是指中，需要用基因探针，基因探针是指A用于检测疾病的医疗器械用于检测疾病的医疗器械 B用放射性同位素或荧光分子等标记的用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子分子C合成一球蛋白的
16、合成一球蛋白的DNA D合成苯丙羟化酶的合成苯丙羟化酶的DNA片段片段第19页，本讲稿共20页 4.科学家将动物控制合成胰岛素的基因与大肠杆菌的科学家将动物控制合成胰岛素的基因与大肠杆菌的科学家将动物控制合成胰岛素的基因与大肠杆菌的科学家将动物控制合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNADNADNADNA分子拼接分子拼接分子拼接分子拼接在一起并在大肠杆菌内成功表达，如下图在一起并在大肠杆菌内成功表达，如下图在一起并在大肠杆菌内成功表达，如下图在一起并在大肠杆菌内成功表达，如下图指出图中指出图中指出图中指出图中2 2 2 2、4 4 4 4、6 6 6 6、7 7 7 7的名称的名称的名称的名称:2_
17、2_2_2_，4_4_4_4_，6_6_6_6_，7_7_7_7_。一般获取一般获取一般获取一般获取4 4 4 4采用的方法是采用的方法是采用的方法是采用的方法是_。6666的获得必须用的获得必须用的获得必须用的获得必须用_切割切割切割切割3 3 3 3和和和和4 4 4 4，使它们产生相同，使它们产生相同，使它们产生相同，使它们产生相同的的的的_，再加，再加，再加，再加入适量的入适量的入适量的入适量的_酶，才酶，才酶，才酶，才可形成。可形成。可形成。可形成。质粒质粒 重组质粒重组质粒 同一种限制性内切酶同一种限制性内切酶 人工合成人工合成 目的基因（或胰岛素基因）目的基因（或胰岛素基因）受体细胞（或大肠杆菌）受体细胞（或大肠杆菌）黏性末端黏性末端 DNA连接连接第20页，本讲稿共20页