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1、基因工程的操作步骤第1页，本讲稿共17页 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，其中常含有抗药基因，如四环素的如四环素的标记基因。标记基因。质粒的存在与否对宿主质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。只能在宿主细胞内成。质粒是质粒是一种裸露的、结构简单、独一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核立于细菌染色体（即拟核DNADNA）之外，）之外，并且具有自我复制能力的双链环状并且具有自我复制能力的双链环状DNADNA分子。分子。质粒是基因工程最常用的运载体。质粒是基因工程最常用的运载体。第
2、2页，本讲稿共17页当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线处中心轴线处切开时，产生的是切开时，产生的是平末端平末端。当限制酶从识别序列的当限制酶从识别序列的中心轴线两侧中心轴线两侧切开时，产生的是切开时，产生的是黏性末端。黏性末端。第3页，本讲稿共17页四、基因工程基本操作的四个步骤四、基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定第4页，本讲稿共17页目的基因的获取目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要
3、是指_编码蛋白质的结构基因，是人们所需要转移或编码蛋白质的结构基因，是人们所需要转移或改造的基因。改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。2 2、获
4、取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段第5页，本讲稿共17页（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库为基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cD
5、NA文库）文库）基因文库基因文库第6页，本讲稿共17页 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_ _、_ _、_._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内
6、成百万倍地扩增(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第7页，本讲稿共17页 过程过程高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸（适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环第8页，本讲稿共17页思考：思考：PCRPCR技术与技术与DNADNA复制有何异同？复制有何异同？第9页，本讲稿共17页 对对DNADNA连接酶、连接酶、DNADNA聚合酶等的理解聚合酶等的理解名名 称称 作作 用用 生理过程生理过程DNADNA连接连接酶酶 限制酶
7、限制酶DNADNA聚合酶聚合酶RNARNA聚合酶聚合酶解旋酶解旋酶连接两个连接两个DNADNA片段片段基因工程基因工程切割某种特定的切割某种特定的脱氧核苷酸序列脱氧核苷酸序列基因工程基因工程将众多游离的脱氧核苷酸将众多游离的脱氧核苷酸聚合成脱氧核苷酸长链聚合成脱氧核苷酸长链DNADNA复制复制逆转录逆转录转录转录RNARNA复制复制DNADNA复制复制转录转录使碱基间氢键断裂形成使碱基间氢键断裂形成脱氧核苷酸链脱氧核苷酸链将众多游离的核糖核苷酸将众多游离的核糖核苷酸聚合成核糖核苷酸长链聚合成核糖核苷酸长链第10页，本讲稿共17页8.8.（20102010广州模拟）下图为广州模拟）下图为DNAD
8、NA分子在不同酶的分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（是（）A.B.A.B.C.D.C.D.C第11页，本讲稿共17页第12页，本讲稿共17页基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢?第13页，本讲稿共17页基因文库的构建方法基因文库的构建方法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶
9、限制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离(直接分离法直接分离法)第14页，本讲稿共17页反转录法：反转录法：以目的基因转录成以目的基因转录成的信使的信使RNARNA为模板，反转为模板，反转录成互补的单链录成互补的单链DNADNA，然，然后在酶的作用下合成双后在酶的作用下合成双链链DNADNA，从而获得所需的，从而获得所需的基因。基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(目的基因目的基因)第15页，本讲稿共17页根据已知的
10、氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法法 ：根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNARNA序列，序列，然后按照碱基互补配然后按照碱基互补配对原则，推测出它的对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合以单核苷酸为原料合成目的基因。成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成第16页，本讲稿共17页上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，分工作量大，盲目，分离出来的有时并非一离出来的有时并非一个基因个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技术条件较高术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对较少的简单基因较少的简单基因第17页，本讲稿共17页