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1、血清蛋白质醋酸纤1第1页，本讲稿共26页实验目的：A.掌握电泳的基本原理，了解电泳仪掌握电泳的基本原理，了解电泳仪电泳槽电泳槽的基本结构与功能。的基本结构与功能。B.熟悉电泳的基本过程与定量方法。熟悉电泳的基本过程与定量方法。C.熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。2第2页，本讲稿共26页1、电泳（、电泳（electrophoresis）法）法n n带点粒子在直流电场中向着相反电极带点粒子在直流电场中向着相反电极移动的现象称为电泳。移动的现象称为电泳。3第3页，本讲稿共26页电泳原理电泳原理：在一定在一定pH条件下，不同的质点由条件下，不同的质点由于具有不同的于具有
2、不同的等电点等电点而带不同性质的电荷，因而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离。使它们分离。影响电泳迁移率的外界因素影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液：电场强度、溶液的的pH值、溶液的离子强度和电渗现象值、溶液的离子强度和电渗现象影响电泳迁移率的内在因素影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状的量、质点的大小和形状4第4页，本讲稿共26页常见的电泳技术：l1.醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳l l2.聚
3、丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l l3.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳l l4.等电聚焦电泳等电聚焦电泳l l5.双向电泳双向电泳5第5页，本讲稿共26页采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为膜，其厚度为0.10.15mm6第6页，本讲稿共26页7第7页，本讲稿共26页优点：优点：uu1.吸附作用小吸附作用小uu2.电渗作用小电渗作用小uu3.需加样量
4、少需加样量少uu4.亲水性小亲水性小8第8页，本讲稿共26页+白蛋白白蛋白(A)12实验原理：实验原理：血清蛋白的血清蛋白的pI大多在大多在7.5以下，在以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成纤维薄膜上分离成A、1、2、和和五条区带。五条区带。蛋白名称等电点分子量白蛋白4.88690005.061：200002：300005.1290000-1500006.85
5、-7.50156000-3000009第9页，本讲稿共26页三、实验器材1.1.电泳仪：电泳仪：为电泳提供直流电源。为电泳提供直流电源。2.2.电泳槽：电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。3.3.血清加样器血清加样器 ：可用盖玻片或可用盖玻片或X X胶片或微量加样器。胶片或微量加样器。4.4.醋酸纤维素薄膜：醋酸纤维素薄膜：2cm8cm2cm8cm5.5.其它：其它：培养皿（直径培养皿（直径9-10cm9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。）、滤纸、玻璃板、镊子等。DYY-5型稳压型稳压稳流电泳仪稳流电泳仪DYY-型型电泳槽电泳槽
6、10第10页，本讲稿共26页实验试剂实验试剂q巴比妥巴比妥-巴比妥钠缓冲液巴比妥钠缓冲液(pH8.6、I=0.06)q氨基黑氨基黑10B染色液：氨基黑染色液：氨基黑10B0.25g，用甲醇，用甲醇50mL、冰醋酸、冰醋酸10mL、水水40mL溶解（可重复使用）。溶解（可重复使用）。q漂洗液：甲醇漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸、冰醋酸5ml和蒸馏和蒸馏水水50ml，混匀。，混匀。11第11页，本讲稿共26页实验操作流程实验操作流程薄膜的准备薄膜的准备 电泳槽的准备电泳槽的准备点样点样 电泳电泳 染色与漂洗染色与漂洗脱色脱色 12第12页，本讲稿共26页操作步骤：操作步骤：1.准备准备：将巴比妥缓冲
7、液加入电泳槽的电极将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极室内，室内，使正负极室的液面等高，电泳支架宽度正好适合使正负极室的液面等高，电泳支架宽度正好适合醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐桥，一醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。端浸入缓冲液中，一端搭在支架上。2.2.膜的预处理：膜的预处理：将薄膜切成将薄膜切成28cm28cm，先于膜条，先于膜条无光泽面距一端无光泽面距一端1.5cm1.5cm处用铅笔轻划一直线处用铅笔轻划一直线(点样点样线线)，再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比妥缓冲，再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比妥缓冲液中，液中，浸透为止（浸透为止（30min)
8、30min)。取充分浸透的膜条，。取充分浸透的膜条，将薄膜将薄膜无光泽面向上无光泽面向上，滤纸吸取多余的缓冲液，滤纸吸取多余的缓冲液，不要吸太干。不要吸太干。13第13页，本讲稿共26页3.3.加样加样：用滴管吸取待测血清一滴于玻璃片用滴管吸取待测血清一滴于玻璃片上，用上，用点样器点样器末端处蘸取少许样品，垂直末端处蘸取少许样品，垂直轻轻印印（迅速均匀）到薄膜（迅速均匀）到薄膜点样线点样线上，上，使血清完全使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的此步是实验的关键关键：以印章法加样时，动以印章法加样时，动作应作应轻、稳，用力不
9、能太重，轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。点样前点样前可先在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正可先在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。式点样。14第14页，本讲稿共26页4.平衡：平衡：待血清渗入薄膜后，将膜条待血清渗入薄膜后，将膜条无光泽面向无光泽面向下下置于电泳槽支架上，置于电泳槽支架上，点样端靠近负极点样端靠近负极，薄，薄膜两端要紧贴滤纸（点样线不要压在滤纸上）膜两端要紧贴滤纸（点样线不要压在滤纸上），中间平直悬空，加盖密封，平衡，中间平直悬空，加盖密封，平衡5分钟。分钟。5.电泳：电泳：将电泳槽
10、正负极分别与电源正负极接将电泳槽正负极分别与电源正负极接好。开启电源，调节电流密度为好。开启电源，调节电流密度为0.5mA/cm，如有，如有10条宽条宽2cm的膜条，其总宽度为的膜条，其总宽度为20cm，应使用电流强度为，应使用电流强度为20cm0.5mA/cm10mA。电压。电压15V/cm。通电。通电50分钟左右，分钟左右，关闭电源。关闭电源。6.染色和漂洗：染色和漂洗：取下薄膜直接浸于氨基黑取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色染色液中，染色5分钟后取出，先用自来水分钟后取出，先用自来水漂洗漂洗1-2次，然后用漂洗液漂洗次，然后用漂洗液漂洗34次，至次，至背景完全无色为止。背景完全无
11、色为止。15第15页，本讲稿共26页7.7.定量定量（1 1）洗洗脱脱比比色色：将将各各蛋蛋白白质质区区带带仔仔细细剪剪下下，分分置置各各试试管管中中，另另从从空空白白背背景景剪剪块块平平均均大大小小的的膜膜条条置置于于空空白白管管中中。各各管管加加入入0.4mol/l 0.4mol/l NaOH NaOH 4ml,4ml,于于3737水水浴浴2020分分钟钟（不不时时振振荡荡），待待颜颜色色脱脱净净即即用用波波长长620nm620nm比比色色，以以空空白白管管调调零零读读取取各管吸光度。各管吸光度。（2 2）计算计算:吸光度总和（吸光度总和（T T）=A+=A+1 1+2 2+（吸光度）（吸
12、光度）16第16页，本讲稿共26页血清蛋白组分的相对百分数：血清蛋白组分的相对百分数：A%=A/T100%TA%=A/T100%T吸光度总和吸光度总和1 1%=%=1 1/T100%/T100%2 2%=%=2 2/T100%/T100%=/T100%=/T100%=/T100%=/T100%17第17页，本讲稿共26页 (1)(1)醋酸纤维素薄膜的预处理醋酸纤维素薄膜的预处理 1.1.市市售售醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜均均为为干干膜膜片片，薄薄膜膜的的浸浸润润与与选选膜膜是是电电泳泳成成败败的的关关键键之之一一。为为防防止止指指纹纹污污染染，取取膜膜时时应应戴戴指指套套或或用用夹夹子子。所
13、所选选薄薄膜膜应应厚厚薄薄均均匀匀，否否则则应应弃弃去去不不用用，以以免免造造成成电电泳泳区区带带扭扭曲曲，界界线线不不清清，背背景景脱脱色困难，结果难以重复。色困难，结果难以重复。2.2.由由于于薄薄膜膜吸吸水水性性比比纸纸小小，浸浸泡泡30 30 minmin以以上上是是保保证证膜膜片片上上有有一一定定量量缓缓冲冲液液，并并使使其其恢恢复复到到原原来来多多孔孔的的网网状状结结构构，最最好好让让薄薄膜膜吸吸满满缓缓冲冲液液后后自自然然下下沉沉，这这样样可将膜片上聚集的小泡赶走。可将膜片上聚集的小泡赶走。3.3.点样时薄膜上的缓冲液不宜太多，但也不能太干。点样时薄膜上的缓冲液不宜太多，但也不能
14、太干。注意事项注意事项注意事项注意事项:18第18页，本讲稿共26页(2)(2)缓冲液的选择缓冲液的选择 1.1.1.1.本实验常用的本实验常用的本实验常用的本实验常用的pH8pH8pH8pH86 6 6 6巴比妥缓冲液，其浓度为巴比妥缓冲液，其浓度为巴比妥缓冲液，其浓度为巴比妥缓冲液，其浓度为0.050.050.050.05O.09 molO.09 molO.09 molO.09 molL L L L。2.2.2.2.选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。选用何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快
15、，并由于扩散缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；变宽；变宽；变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。分布过于集中，不易分辨。分布过于集中，不易分辨。分布过于集中，不易分辨。19第19页，本讲稿共26页(3)(3)(3)(3)加样量加样量加样量加样量 1.1.1.1.加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色方法与检测加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色
16、方法与检测加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色方法与检测加样品量的多少与电泳条件、样品性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。手段灵敏度密切相关。手段灵敏度密切相关。手段灵敏度密切相关。2.2.2.2.作为一般原则，检测方法作为一般原则，检测方法作为一般原则，检测方法作为一般原则，检测方法越灵敏越灵敏越灵敏越灵敏，加样量越少加样量越少加样量越少加样量越少，对，对，对，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至相互干扰，染色也较费时。楚，甚至
17、相互干扰，染色也较费时。楚，甚至相互干扰，染色也较费时。楚，甚至相互干扰，染色也较费时。3.3.3.3.点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章，以印章，以印章，以印章法加样时，动作应法加样时，动作应法加样时，动作应法加样时，动作应轻、稳轻、稳轻、稳轻、稳，用力不能太重用力不能太重用力不能太重用力不能太重，以免将薄膜，以免将薄膜，以免将薄膜，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。弄破或印出凹陷而影响
18、电泳区带分离效果。20第20页，本讲稿共26页注意事项注意事项1 1市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在若飘浮于液面的薄膜在151530 s30 s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳膜均匀可用于电泳2 2醋酸纤维素薄膜电泳常选用醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6pH8.6巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.050.050.09 0.09 mol/Lmol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有
19、关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，度快区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨不易分辨3 3点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果分离效果4 4点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响点样时，
20、动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果电泳区带分离效果5 5电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.40.6mA/cm0.6mA/cm膜宽度。电流强度高，膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散6 6操作过程为防止指纹污染，应戴手套操作过程为防止指纹污染，应戴手套21第21页，本讲稿共26页临床意义：临床意义：n血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳，通常可分血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳，通常可分离离白蛋白白蛋白(Alb)、1、2、和和-球蛋白球蛋白五
21、个组分，正常人血清中各种蛋白质浓度五个组分，正常人血清中各种蛋白质浓度的差别较大，所以在许多疾病时仅表现出的差别较大，所以在许多疾病时仅表现出轻微变化轻微变化，往往没有特异的临床诊断价，往往没有特异的临床诊断价值。值。n分析几种疾病的电泳分析结果，可以看分析几种疾病的电泳分析结果，可以看出出较显著的变化较显著的变化。22第22页，本讲稿共26页典型异常血清蛋白电泳图谱在异常电泳图谱中，在异常电泳图谱中，肾病综合征、肝硬化和多发性骨髓肾病综合征、肝硬化和多发性骨髓瘤瘤(M(M蛋白血症型蛋白血症型)最具有特征性，在临床上诊断意义最最具有特征性，在临床上诊断意义最大。大。23第23页，本讲稿共26页几种疾病的蛋白电泳变化 病名白蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白肾病弥温性肝损害肝硬化-桥原发性肝癌AFP多发性骨髓瘤慢性炎症妊娠无丙种球蛋白血症双白蛋白血症双峰24第24页，本讲稿共26页思思 考考 题：题：问答题问答题n n1.CAME1.CAME的基本原理是什么？的基本原理是什么？n n2.CAME2.CAME分分离离血血清清蛋蛋白白电电泳泳时时应应注注意意哪哪些些问问题？题？25第25页，本讲稿共26页1.滤纸桥滤纸桥 2.电泳槽电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架电泳槽膜支架 5.电极室中电极室中央隔板央隔板点样26第26页，本讲稿共26页