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1、关于血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳现在学习的是第1页，共13页一、实验目的一、实验目的1.了解电泳的基本原理；了解电泳的基本原理；2.掌握电泳分离蛋白质的原理；掌握电泳分离蛋白质的原理；3.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法。熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法。现在学习的是第2页，共13页二、实验原理二、实验原理1.1.电泳的基本原理电泳的基本原理 电泳电泳是带电粒子在电场中向其电性相反的电极发生是带电粒子在电场中向其电性相反的电极发生移动的现象。移动的现象。利用电泳技术可进行物质利用电泳技术可进行物质分离分离、纯化纯化及及鉴定鉴定。现在学习的是第3页，共13页影响带电粒子电泳速率的因素：影响带电粒子电泳速
2、率的因素：1.带电量带电量 F=qE2.分子量分子量3.形状形状现在学习的是第4页，共13页2.2.电泳分离蛋白质的原理电泳分离蛋白质的原理蛋白质的两性解离：蛋白质的两性解离：等电点等电点 即即 pI(isoelectric point）pIpH小于小于pIpH大于大于pI当当pH距离距离pI越远时，所带电量越多。越远时，所带电量越多。+OH-+OH-+H-+H-现在学习的是第5页，共13页 血清蛋白质的等电点为血清蛋白质的等电点为4.87.5，均低于，均低于8.6，因此电泳，因此电泳时常采用时常采用pH8.6的缓冲液。此时，蛋白质解离带负电荷，的缓冲液。此时，蛋白质解离带负电荷，在电场中向正
3、极移动。在电场中向正极移动。现在学习的是第6页，共13页3.3.醋酸纤膜薄膜电泳分离血清蛋白质原理醋酸纤膜薄膜电泳分离血清蛋白质原理醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作支持物的一种电泳技术。是采用醋酸纤维素薄膜作支持物的一种电泳技术。醋酸纤维素薄膜做区带电泳的支持物优点醋酸纤维素薄膜做区带电泳的支持物优点:1.用样量少，分离清晰，对染料无吸附作用用样量少，分离清晰，对染料无吸附作用;2.快速简便，应用范围广快速简便，应用范围广;3.染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。便于保存和定量
4、分析。目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。现在学习的是第7页，共13页三、主要试剂与器材三、主要试剂与器材试剂：血清试剂：血清 巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 染色液，漂洗液染色液，漂洗液器材：电泳仪，电泳槽器材：电泳仪，电泳槽 醋酸纤维素薄膜（醋酸纤维素薄膜（28 cm）血清加样器血清加样器现在学习的是第8页，共13页四、操作步骤四、操作步骤1.浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中，充浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中，充分浸透后用镊子取出（约分浸透后用镊子取出（约3-
5、5 min，直到，直到膜上没有斑点，膜上没有斑点，中间没有气泡中间没有气泡为止）。为止）。2.点样：点样：毛面向上毛面向上，用点样器，在距膜一端约，用点样器，在距膜一端约1.5 cm处，处，点加点加3-5 L待分离血清。注意取样待分离血清。注意取样适量适量、均匀均匀；血清线；血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。1.5cm现在学习的是第9页，共13页3.搭桥：首先将双层纱布铺好，分别放置于电泳槽两端，其下搭桥：首先将双层纱布铺好，分别放置于电泳槽两端，其下端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄膜端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄膜光面向上光面向上
6、平直地平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的方向，贴于电泳槽的支架上。注意桥的方向，点样的一端位于点样的一端位于负极负极，点样线不能搭在滤纸上。，点样线不能搭在滤纸上。醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图现在学习的是第10页，共13页4.电泳：电泳：红正红正黑负。黑负。电压电压120 V。电泳时间约电泳时间约40 50 min。5.染色：氨基黑染色：氨基黑10B,染色染色1-2 min.6.脱色：脱色：2个表面皿，装入漂洗液，依次漂去多余染料，直到个表面皿，装入漂洗液，依次漂去多余染料，直到背景漂白为止。背景漂白为止。现在学习的是第11页，共13页五、结果与分析五、结果与分析1.1.定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。2.2.定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法现在学习的是第12页，共13页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第13页，共13页