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1、细菌内毒素检查法在药品和医细菌内毒素检查法在药品和医疗器械检查中的应用疗器械检查中的应用2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二1 1细菌内毒素检查细菌内毒素检查本讲座共分三部分一、基础部分二、标准部分三、实验操作部分2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二2 2一、基础部分一、基础部分1.1.前言前言前言前言 防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展，该方法已不全发挥了重要作用。但
2、随着制药工业的发展，该方法已不完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器械质量控制中的一项重要指标。械质量控制中的一项重要指标。1.11.1细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法 1885 1885年美国的年美国的W.H.HowellW.H.Howell发表了一篇有关鲎血的化学发表了一篇有关鲎血的化学组成和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史
3、的开组成和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史的开端。端。19561956年，美国动物学家年，美国动物学家F.BangF.Bang发表论文鲎的一种发表论文鲎的一种细菌性疾病，阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。细菌性疾病，阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。19641964年年F.BangF.Bang和和J.LevinJ.Levin提出了鲎血凝集的初步机理，提出了鲎血凝集的初步机理，19681968年正式建立鲎试验（年正式建立鲎试验（Limulus test,LT)Limulus test,LT)方法。方法。1980 1980年年USP20USP20版；版；19871987年欧洲药典、年欧洲药
4、典、19891989年英国药年英国药典典19891989增补本、增补本、19881988年日本药典第年日本药典第1111增补本、增补本、19931993年中年中国药典国药典19901990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二3 31.2 细菌内毒素在我国的发展细菌内毒素在我国的发展在我国，在我国，19751975年开始鲎试剂的研制，年开始鲎试剂的研制，19791979年开始年开始将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究，将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究，19831983年开始用于输液制剂
5、热原检查的协作研究。年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。19881988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4 4种种药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试方法；方法；19931993年中国药典年中国药典19901990年版第二增补本开始年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。收载细菌内毒素检查法。19951995年版中国药典规定年版中国药典规定1313个品种进行细菌内毒素检查法。个品种进行细菌内毒素检查法。20002000年版药典年版药典规定规定6060个品种进行细菌内毒素检查法。个品种进行细菌内毒素检查法。20
6、052005年版年版药典规定药典规定133133个品种进行细菌内毒素检查法。个品种进行细菌内毒素检查法。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二4 42 有关术语及相关内容有关术语及相关内容 2.12.1热原反应热原反应病人在静脉输注药剂后可能发生的发热、冷感、病人在静脉输注药剂后可能发生的发热、冷感、寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及四肢关节痛、肤色灰白、白寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及四肢关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强、昏迷、休克、死亡等一系列症细胞下降、血管通透性增强、昏迷、休克、死亡等一系列症状称为热原反应。状称为热原反应。2.2 2.2 热原热原所有能引起热原反应的
7、物质称为热原。药品中的所有能引起热原反应的物质称为热原。药品中的热原主要是细菌内毒素。一般可以认为：细菌内毒素是热原，热原主要是细菌内毒素。一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不等于细菌内毒素。但热原不等于细菌内毒素。2.32.3细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法20052005年版中国药典定义为：系利用年版中国药典定义为：系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。2.42.4鲎试剂鲎试剂我国生产的鲎试剂系鲎科动物东方鲎的血液变形我国生产的鲎试
8、剂系鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，用于细菌内毒素检查。细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，用于细菌内毒素检查。根据检查方法分为凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂；根据鲎试根据检查方法分为凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂；根据鲎试剂与内毒素反应的专一程度分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。剂与内毒素反应的专一程度分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。特异性鲎试剂是专一对内毒素反应的鲎试剂。鲎试剂灵敏度特异性鲎试剂是专一对内毒素反应的鲎试剂。鲎试剂灵敏度用符号用符号 表示，单位用表示，单位用EU/mlEU/ml表示。表示。2.52.5鲎鲎 鲎是一种栖生于海洋的低等无脊椎动物，出现在古鲎是一种栖生于海洋的
9、低等无脊椎动物，出现在古代泥盆纪，现存于世的有三属四种，常见的有两种，美洲鲎代泥盆纪，现存于世的有三属四种，常见的有两种，美洲鲎和东方鲎和东方鲎2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二5 52.6细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞外壁层上的特有结构，即脂多糖，具有广泛的生物活性，以致热居首。其量值以国际单位（IU)或内毒素单位（EU)表示，现规定1 IU=1 EU。2.7细菌外毒素与细菌内毒素 细菌外毒素是一种由活菌合成并释放出来，对热敏感的蛋白质。细菌内毒素是一种对热抵抗，且只有当菌体死亡裂解或人工破碎后方可释放来。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二6 6外毒素与内
10、毒素的主要区别外毒素与内毒素的主要区别区别要点区别要点外毒素外毒素内毒素内毒素来源来源GG+、部分、部分GG-GG-存在不位存在不位胞浆内合成分泌至菌体外胞浆内合成分泌至菌体外细胞壁成分细胞壁成分化学成分化学成分蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖稳定性稳定性不稳定，不稳定，60-8060-80破坏破坏160-240160-240破坏破坏毒性作用毒性作用强，有选择性强，有选择性弱弱抗原性抗原性强，可制成类毒素强，可制成类毒素弱弱举例举例肉毒毒素，白喉外毒素肉毒毒素，白喉外毒素大肠杆菌内毒素大肠杆菌内毒素2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二7 7内毒素的主要生物活性：1 发热反应 2 白细胞
11、反应 3 代谢性酸中毒 4 感染性休克 5 弥漫性血管内凝血（DIC)2.8细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品分为细菌内毒素国际标准品、国家标准品和工作标准品。在我国，细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二8 8 1996年WHO 建立第二批国际内毒素标准品（94/580，10000IU），规定1IU=IEU。981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品，共生产8批。细菌内毒素工作品分为冻干品和液体两种剂型，均可用于鲎试剂复核、干扰试验和实验中的阳性对照。本品为一次性使用。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期
12、二9 92.9细菌内毒素检查用水 2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用水。3 细菌内毒素的化学结构、量值和限值3.1化学结构 细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要有两部分组成：多糖和类脂A。多糖部分又可进一步分为O-特异性多糖链、核心寡聚糖。O-特异性脂多糖一般由3-6个单糖通过糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是LPS分子中最易变异的成分。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二1010核心寡聚糖分为内核和外核。外核由数种己糖组成，内核含有庚糖特殊的酮糖，这部分结构对不同菌株的LPS基本
13、相似。类脂A是LPS的毒性及生物活性中心。典型的类脂A含有一个以1，6-糖苷键相连的D-氨基葡萄糖双糖组成的基本骨架，双糖骨架的游离羟基及氨基可携带长链脂肪酸和磷酸基团。不同种属细菌合成的类脂A的分子组成及其骨架上的取代基团性质有差异。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二11113.2细菌内毒素的量值 1996年WHO建立第二批国际内毒素标准品(94/580，10000IU),规定1IU=1EU。我国国家标准品981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品。每支含内毒素9000EU。3.3 细菌内毒素的限值 供试品细菌内毒素限值按一下公式确定L=K/M，式中L为供试品内毒素限
14、值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量，以EU/kg表示，注射剂K=5EU/kg/hr。M为人用最大剂量，以ml/kg/hr,mg/kg/hr,U/kg/hr表示，中国人均体重按60kg计算。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二12124中国药典中国药典中国药典中国药典20052005年版细菌内毒素检查法的修订内容年版细菌内毒素检查法的修订内容年版细菌内毒素检查法的修订内容年版细菌内毒素检查法的修订内容 中国药典2005年版较中国药典2000年版有重大修订，主要修订内容如下：4.1.定义改变：2005年版药典定义细菌内毒素检
15、查法为利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二13134中国药典中国药典2005年版细菌内毒素检查法年版细菌内毒素检查法的修订内容的修订内容 2000年版定义为：利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。4.2.把中国药典2000年版的细菌内毒素检查法应用指导原则，合并入附录E细菌内毒素检查法。4.3.明确了细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法和光度测定法，供试品检测时，可用其中任意一种方法进行试验，只有当测定结果有争议时，以凝胶法结果为准。20
16、21/7/27 2021/7/27 星期二星期二14144.4 细菌内毒素检查用水的要求提高，内毒素含量降到了0.015EU/ml，光度测定法用细菌内毒素检查用水的内毒素含量小于0.005EU/ml。4.5增加了供试品溶液的制备这一项，明确了供试品溶液的PH 值在6.08.0范围内，配制酸、碱及缓冲盐的容器应去除内毒素，水用细菌内毒素检查用水。4.6鲎试剂灵敏度的定义有所改变 2000年版的定义是：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度；2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二1515 2005年版的定义是：在本检查法规定的条件下使鲎试剂产生凝聚
17、的最低内毒素浓度4.7.把原来的凝胶法细分为凝胶限量试验和凝胶半定量试验。4.8.凝胶限量试验中，阴性对照和阳性对照的平行管数都增加为2支。4.9.增加了凝胶半定量试验，通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。4.10.较详细讲述了光度测定法的方法。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二1616二、标准部分二、标准部分2.1 细菌内毒素检查法（中国药典2005年版）2.2 医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法GB/T14233.2-932.3生物材料和医疗器材的细菌内毒素检查法 （卫生部药政局1997年药发1997第81号）2021/7/27 2021/7/27 星期二
18、星期二1717医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法生物材料和医疗器械的细菌内毒素检查法生物材料和医疗器械的细菌内毒素检查法与中国药典与中国药典2005 年版的比较年版的比较 法规法规项目项目医用输液、输血医用输液、输血 注射器注射器BETBET 生物材料和生物材料和医疗器械医疗器械BETBET 中国药典中国药典20052005年年BETBET除热原除热原 程序程序玻璃器具玻璃器具180180干烤干烤2h2h获获25025030min,30min,塑料器具塑料器具30%30%双氧水双氧水4h4h，无热原水冲洗，无热原水冲洗后后60 60 烘干。烘干。250
19、 250 至少至少3030Min,Min,或或180 180 至少至少2h,2h,也可也可用其他适宜的用其他适宜的方法。方法。250 250 至少至少1h1h也可用其他也可用其他适宜的方法，适宜的方法，并应确证不并应确证不干扰干扰BETBET的检的检查查2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二1818鲎试剂灵鲎试剂灵敏度复核敏度复核检测能出现阳性检测能出现阳性结果阴性结果的结果阴性结果的4 4个连续个连续2 2倍等比倍等比稀释液，平行稀释液，平行4 4管，管，371371保温保温602min,602min,最高浓最高浓度的度的4 4管均为阳管均为阳性，最低浓度的性，最低浓度的4 4
20、管均为阴性。管均为阴性。按公式计算按公式计算当当s s0.3650.365时按时按=log-1(x/4)=log-1(x/4)计算鲎试剂的灵计算鲎试剂的灵敏度；敏度；s0.365s0.365时，测定无效。时，测定无效。检测检测2.02.0、0.50.5、0.250.25的内毒素平行的内毒素平行4 4组，同时做组，同时做4 4管管阴性，最高浓阴性，最高浓度的度的4 4管均为阳管均为阳性，最低浓度性，最低浓度的的4 4管均为阴性。管均为阴性。S S 标准差标准差X 4X 4个连续内毒个连续内毒素稀释液最低素稀释液最低阳性结果浓度阳性结果浓度的对数值。的对数值。检测检测2.02.0、0.50.5、0
21、.250.25的内毒素平行的内毒素平行4 4组，同时做组，同时做2 2管阴性，最大管阴性，最大浓度浓度2.02.0的的4 4管均为阳性，管均为阳性，最低浓度最低浓度0.250.25的的4 4管均管均为阴性为阴性NCNC均为阴性均为阴性 c=lgc=lg-1 1(x/4)(x/4)在在0.52.00.52.0间间有效有效2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二1919干干扰扰试试验验未涉及未涉及比较鲎试剂在水中比较鲎试剂在水中和样品中的灵敏度，和样品中的灵敏度，各平行各平行4 4组，结果组，结果E Es s、E Et t均应均应0.52.00.52.0之之间，样品的稀释不间，样品的稀
22、释不大于大于MVD,3MVD,3个批号个批号比较鲎试剂在水中和样比较鲎试剂在水中和样品中的灵敏度，各平行品中的灵敏度，各平行4 4组，结果组，结果E Es s、E Et t均应均应0.52.00.52.0之间，样品的之间，样品的稀释不大于稀释不大于MVD,3MVD,3个批个批号号2 2个以上厂家的鲎试剂个以上厂家的鲎试剂检检查查法法供试品至少供试品至少3 3个个浸提介质：内毒素浸提介质：内毒素含量含量0.05EU/ml0.05EU/ml输液器输液器10ml,10ml,输血输血器器15ml,15ml,反复荡洗反复荡洗5 5次后两端密闭，次后两端密闭，37 37 2h2h后合并后合并2 2支支NC
23、,2NC,2支支PC,PC,2 2支供试品。支供试品。样品稀释到样品稀释到MVDMVD，1 1支支NC,1NC,1支支PC,1PC,1支支PPCPPC2 2支供试品。支供试品。样品稀释到样品稀释到MVDMVD，2 2支支NC,2NC,2支支PC,2PC,2支支PPCPPC2 2支供试品。支供试品。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二2020结果判断结果判断PCPC为阳性为阳性NCNC为阴性为阴性样品均为阴性，样品均为阴性，合格合格PCPC为阳性为阳性PPCPPC为阳性为阳性NCNC为阴性为阴性样品均为阴性，样品均为阴性，合格合格PCPC为阳性为阳性PPCPPC为阳性为阳性NCN
24、C为阴性为阴性样品均为阴性，样品均为阴性，合格合格其他其他鲎试剂灵敏度鲎试剂灵敏度0.25EU/ml 0.25EU/ml 供试品细菌内供试品细菌内毒素限量不超毒素限量不超过过0.5EU/ml0.5EU/ml样品溶液不稀样品溶液不稀释，当结果出释，当结果出现阳性时，现阳性时，1212稀释，稀释，4 4支，支，1 1支阳，支阳，无热原注射用无热原注射用水水0.05EU/ml0.05EU/ml为浸提介质为浸提介质细菌内毒素检细菌内毒素检查用水内毒素查用水内毒素含量小于含量小于0.015EU/ml 0.015EU/ml 2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二2121三、试验操作三、试验操
25、作1.简述1.1 鲎试剂灵敏度复核项的目的不仅是考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。因此每个实验室再将一批新的鲎试剂用于试验前应进行鲎试剂灵敏度复核项试验。1.2干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制作用。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二22221.3 供试品检查时，阴性对照、阳性对照、和供试品阳性对照必须同时进行，否则结果无效。2试验材料及用具 天平、电热干燥箱（180300）、恒温水浴箱（37 1）、漩涡混合器、鲎试剂(应具有国家主管部门的批
26、准文号）、细菌内毒素工作品、细菌内毒素检查用水；其他试验用具如移液枪、封口膜、一次性安剖等。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二23233.凝胶实验技术凝胶实验技术3.1凝胶法的实验程序 1试验准备：试剂、仪器及用具等 2 确定药品的细菌内毒素限值L 3选择鲎试剂的灵敏度 4 计算供试品的最大有效稀释倍数或最小有效浓度 5 鲎试剂灵敏度复核 6 药品与鲎试剂相容性的初筛试验 7 供试品干扰试验 8 干扰试验的验证 9 供试品日常的内毒素限量检查2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二24243.2.鲎试剂灵敏度复核3.2.1内毒素标准溶液的制备 取细菌内毒素国家标准
27、品或国家工作标准品一支，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻璃屑落入瓶内。按药典操作。例如使用细菌内毒素工作标准品（150601-2005-10，100EU/ml)时的方法如下：复溶：准确吸取细菌内毒素检查用水1ml假如瓶内，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15分钟，即为100EU/ml。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二2525稀释：取0.2ml内毒素标准溶液加入1.8ml细菌内毒素检查用水为110稀释液，即为10EU/ml内毒素标准溶液。取0.2ml 110稀释液，加入1.8ml细菌内毒素检查用水1100稀释液即为1EU/ml内毒素标准溶液。以
28、后依次成倍稀释分别为0.5EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml，0.0625EU/ml，0.03125EU/ml。在上述稀释过程中，每稀释一步，均需在漩涡混合器上混合30秒钟。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二26263.2.3待复核鲎试剂按药典准备待复核鲎试剂按药典准备例如：复核湛江博康海洋生物有限公司例如：复核湛江博康海洋生物有限公司TALTAL（0511090,0.125EU/ml0511090,0.125EU/ml）反应结果）反应结果平行平行管数管数内毒素标准溶液浓度内毒素标准溶液浓度NCNC反应反应终点终点浓度浓度X X0.250.250.120.1
29、25 50.060.060.030.031 10.120.125 5-0.9030.9032 20.120.125 5-0.9030.9033 30.120.125 5-0.9030.9034 40.060.06-1.22-1.222021/7/27 2021/7/27 星期二星期二2727数据处理c=lg-1（X/4）=lg-1(-0.903)*3+(-1.22)=0.104EU/ml结果判断 c在2.00.5（0.25EU/ml0.06EU/ml）范围内，本批TAL的灵敏度标示值符合规定，应按标示值使用。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二28283.3新品种细菌内毒素检查
30、的实验设计方法新品种细菌内毒素检查的实验设计方法3.3.13.3.1设计原理设计原理 凝胶法是将等体积的样品溶液和新配制的鲎试剂凝胶法是将等体积的样品溶液和新配制的鲎试剂（各（各0.1ml0.1ml）在试管中混匀）在试管中混匀 371 371反应反应602602分钟。分钟。如果检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其如果检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有的内毒素浓度等于或大于鲎试剂灵敏度时，含有的内毒素浓度等于或大于鲎试剂灵敏度时，就会在试管中显示阳性反应，其机理为内毒素在就会在试管中显示阳性反应，其机理为内毒素在钙、镁二价阳离子的参与下，首先激活鲎试剂凝钙、镁二价阳离子的参与下，首先激
31、活鲎试剂凝固酶系统的固酶系统的C C因子，最后将凝固蛋白原变成凝固因子，最后将凝固蛋白原变成凝固蛋白。如果药品中存在阻碍或促进该反应的因素蛋白。如果药品中存在阻碍或促进该反应的因素时，均会导致结果异常。当检测一个新品种时，时，均会导致结果异常。当检测一个新品种时，须证明该样品本身是否存在这些因素，这就是通须证明该样品本身是否存在这些因素，这就是通常说的干扰试验。当存在干扰因素时，为了排除常说的干扰试验。当存在干扰因素时，为了排除干扰，最简单的方法就是对其进行适当的稀释。干扰，最简单的方法就是对其进行适当的稀释。通过稀释，可以降低该样品中干扰成分的浓度。通过稀释，可以降低该样品中干扰成分的浓度。
32、2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二29293.3.2干扰试验干扰试验干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且用为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。存在干扰作用。由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下由于干扰实验检验的是在供试
33、品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰试验预试验中原则剂的灵敏度无关，因此在干扰试验预试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂，但建议使用较低上可使用任一灵敏度的鲎试剂，但建议使用较低灵敏度的鲎试剂，可尽量避免供试品所含内毒素灵敏度的鲎试剂，可尽量避免供试品所含内毒素对干扰试验造成的阳性影响。对干扰试验造成的阳性影响。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二30303.3.2内毒素限值（内毒素限值（L）的确定）的确定记录供试品名称、浓度C（干粉规格及溶解后浓度），最大人体剂量。例如：注射用盐酸阿糖胞苷
34、（05090801，0.1g/支），最大剂量药品说明书给出为3g/m2计算供试品限值L=K/M K=5EU/kg,人体表面积为1.55m2，体重为60kg,L=5/(3000*1.55/60)=0.065EU/mg选择鲎试剂灵敏度 0.25EU/ml2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二3131计算供试品的最大有效稀释倍数MVD=CL/或最低有效浓度MVC=/L=C/MVD按市售鲎试剂的灵敏度为1.0EU/ml0.03EU/ml稀释样品取本品一支加细菌内毒素检查用水2ml溶解，按上述鲎试剂灵敏度范围样品依次稀释为6.5倍、13倍、26倍、52 倍、104倍。预试验的目的是初步确定
35、供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数。为正式干扰试验提供依据。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二32323.3.33.3.3预试验预试验预试验预试验制备制备NPCNPC稀释系列（不含内毒素的供试品稀释系稀释系列（不含内毒素的供试品稀释系列）列）制备制备PPCPPC稀释系列（含稀释系列（含2 2 内毒素的供试品稀释内毒素的供试品稀释系列）确证系列）确证PPCPPC的有效性。的有效性。反应反应 TAL+NPC;TAL+PPC TAL+NPC;TAL+PPC 每个浓度平行每个浓度平行2 2管。管。2 0.25 0.125 NC PC 2 0.25 0.125 NC PCPPC
36、 PPC NPC NPC 以上结果确认，本品的最小不干扰稀释倍数为以上结果确认，本品的最小不干扰稀释倍数为1313倍。并且用灵敏度倍。并且用灵敏度0.25EU/ml0.25EU/ml以上的鲎试剂检查以上的鲎试剂检查2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二33333.4供试品干扰试验供试品干扰试验 3.4.13.4.1试验程序试验程序 1 1计算：供试品的内毒素限值计算：供试品的内毒素限值L=K/ML=K/M 2 2选择：鲎试剂灵敏度选择：鲎试剂灵敏度 3 3计算：供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度计算：供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度 4 4根据初筛试验选择：供试品有效稀
37、释倍数或有效浓度根据初筛试验选择：供试品有效稀释倍数或有效浓度 5 5制备：制备：22、0.50.5、0.250.25内毒素水溶液内毒素水溶液E ES S系列系列 2 2、0.50.5、0.250.25内毒素供试品溶液内毒素供试品溶液E Et t系列系列 6 6反应：反应：TAL+BETTAL+BET水（水（NCNC）,TAL+,TAL+供试品溶液（供试品溶液（NPCNPC），），平行平行2 2管，管，TAL+ETAL+ES S系列系列,TAL+E,TAL+Et t系列，平行系列，平行4 4管管 7 7结果判断：试验有效：结果判断：试验有效：NC NC管全部阴性（管全部阴性（-），），NPCN
38、PC全部阴性（全部阴性（-）TAL+E TAL+ES S系列：系列：22管全部阳性（管全部阳性（+）,0.25,0.25管全部阴性管全部阴性 TAL+E TAL+Et t系列：系列：2 2管全部阳性（管全部阳性（+）,0.25,0.25管全部阴性管全部阴性 8 8 数据处理：供试品在该浓度下无干扰数据处理：供试品在该浓度下无干扰2.0ES0.52.0ES0.5，2.0 Et0.5,2.0 Et0.5,若供试品在该浓度下有干扰，选择灵敏度若供试品在该浓度下有干扰，选择灵敏度更高的鲎试剂更高的鲎试剂2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二34343.5供试品检查供试品检查1日常检查包括
39、2支供试品管，2支阴性对照，2支阳性对照，2支供试品阳性2检查程序供试品：按MVD稀释供试品溶液内毒素：BET水复溶稀释为2内毒素水溶液 供试品溶液复溶稀释为含2内毒素供试品溶液3鲎试剂：BET 水复溶2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二3535供试品管供试品管NCNCPCPCPPCPPC一、加样一、加样0.1mlTAL0.1mlTAL0.1ml0.1ml供试供试品溶液品溶液0.1mlBET 0.1mlBET 水水0.1ml0.1ml22内毒素内毒素水溶液水溶液0.1ml20.1ml2内毒内毒素供试品溶液素供试品溶液平行管数平行管数2 22 22 22 2二、封口、混合、孵育二
40、、封口、混合、孵育371371。602min602min结果判断结果判断合格合格不合格不合格复试复试 试验无效试验无效复试复试 2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二36363.6供试品稀释举例供试品稀释举例假设选择鲎试剂灵敏度为假设选择鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml 0.25EU/ml 1 1 复方利多卡因注射液：复方利多卡因注射液：L=1.8EU/mg,L=1.8EU/mg,规格规格40mg/5ml40mg/5ml；MVD=1.8/0.25=7.2MVD=1.8/0.25=7.2倍倍稀释过程稀释过程0.5ml0.5ml（8mg/ml8mg/ml）4ml 1mg/ml 4ml
41、 1mg/ml（1mg/ml1mg/ml1ml1ml（1mg/ml1mg/ml）3.6ml(3.63.6ml(3.6倍倍)1ml2ml(7.21ml2ml(7.2倍）倍）2.2.注射用克林霉素磷酸酯：注射用克林霉素磷酸酯：L=0.21EU/mgL=0.21EU/mg规格规格0.3g/0.3g/支，加水支，加水3ml 3ml 稀释稀释100mg/ml 100mg/ml MVD=100*021/025=84MVD=100*021/025=84倍倍取取0.2ml 4.2ml(210.2ml 4.2ml(21倍倍)取取1ml4ml1ml4ml（8484倍）倍）2021/7/27 2021/7/27 星
42、期二星期二3737结束语结束语随着内毒素研究工作的进展，细菌内毒素检查法随着内毒素研究工作的进展，细菌内毒素检查法应用范围越来越广，用于药品成品检查的品种越应用范围越来越广，用于药品成品检查的品种越来越多。制药工业上更是日益显示出它的应用价来越多。制药工业上更是日益显示出它的应用价值，该法用于药品生产过程检查，属于一种事前值，该法用于药品生产过程检查，属于一种事前控制的制控手段，对提高药品质量，避免造成药控制的制控手段，对提高药品质量，避免造成药品成批报废有重要意义。品成批报废有重要意义。在临床上检测机体内毒素可以作为一个衡量病情在临床上检测机体内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的一个参考指标，也可用于指导临床和判断预后的一个参考指标，也可用于指导临床治疗。治疗。2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二3838谢 谢 大 家2021/7/27 2021/7/27 星期二星期二3939