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1、关于免疫组化结果分析和判关于免疫组化结果分析和判断断第一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第一节 免疫组化结果的判断原则 免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点：第二张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。抗原表达必须在特定部位。如如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及及p53蛋蛋白白应应定定位位在在细细胞胞核核内内；EMA应定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。第三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有
2、时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。第四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 尽尽量量避避开开出出血血、坏坏死死及及切切片片刀刀痕痕和和界界面面边边缘缘细细胞胞的的阳阳性性表表达达，特特别别是是酶酶免免疫疫标标记记。因因为为这这类类阳阳性性着着色色多多系系内内源源干干扰扰，或或系系人人为为因因素素所致。所致。第五张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应应结结合合临临床床资资料料、X线等影像学及实验结果综合分析。第六张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 第二节 对照染色设计 第七张，PPT共四十四页，创作于2022年6月(
3、一）对照染色的目的 设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三：组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。第八张，PPT共四十四页，创作于2022年6月假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：自发荧光或内源酶等干扰；抗体试剂不纯(特别是一抗）；操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；Fc受体的干扰，等等。受体的干扰，等等。第九张，PPT共四十四页，创作于2022年6月（二）对照的种类及其选用目的（二）对照的种类及其选用目的 对对照照染染色
4、色大大致致可可分分为为阳阳性性组组织织对对照照、阴性组织及阴性试剂对照和自身对照四大类：阴性组织及阴性试剂对照和自身对照四大类：第十张，PPT共四十四页，创作于2022年6月阳阳性性组组织织对对照照指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。第十一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月阴性组织对照指指用用已已证证实实不不含含靶靶抗抗原原的的同同步步处处理理和和免免疫疫标标记记染染色色的的组组织织对对照照。正正确确的的结结果果应应为为阴阴性性，目目的的
5、是是除除外外假假阳性。阳性。第十二张，PPT共四十四页，创作于2022年6月阴性试剂对照是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空空白白对对照照；替替代代对对照照；吸吸收收试试验验和和抑抑制制试试验验，等等。目目的的在在于于除除外外假假阳阳性性和和证证实实所所用用免免疫疫组组化化试试剂剂及及其其技技术术方方法法的的有有效效性性和和待待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。第十三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月空白对照指以缓冲液（PBS、TBS等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第
6、二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。第十四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月取代对照 指指以以所所用用方方法法第第一一抗抗体体同同源源动动物物的的正正常常血血清清，或或与与本本实实验验无无关关的的抗抗体体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。吸收试验 是是指指用用事事先先经经过过量量抗抗原原吸吸收收的的第第一一抗抗体体上上清清液液取取代代第第一一抗抗体体，其其他他步步骤骤不不变变的的免免疫疫染染色色试试剂剂对对照照。结结果果应应是是阴阴性性或或阳阳性性着着色色明明显显减减弱弱（吸吸收不全时）。收不全时）。第十五张，P
7、PT共四十四页，创作于2022年6月抑抑制制试试验验 是是指指用用标标记记抗抗体体和和未未标标记记抗抗体体（可可以以是是一一抗抗，也也可可以以是是二二抗抗或或桥桥抗抗体体）两两者者的的混混合合物物作作试试剂剂，其其他他步步骤骤不不变变的的免免疫疫组组化化染染色色试试剂剂对对照照，结结果果其其阳阳性性着着色色应应成成比比例例的的减减弱弱（等等量或量或1 1：9）。此试剂对照多用于直接法。）。此试剂对照多用于直接法。第十六张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 这类阴性试剂对照的选用原则是是：空空白白对对照照不不能能省省，其其他他对对照照在在预预实实验验中中应应尽尽量量多多做做，尤尤其其是是应
8、应用用新新抗抗体体试试剂剂；对对照照必必需需与与实实验片同步进行染色；验片同步进行染色；对照的结果应附合要求。对照的结果应附合要求。第十七张，PPT共四十四页，创作于2022年6月自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。第十八张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第三节非特异染色第十九张，PPT共四十四页，创作于2022年6月非特异染色是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景
9、着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：第二十张，PPT共四十四页，创作于2022年6月内源性干扰(自自发发荧荧光光、内内源源酶酶、内内源源性性生生物物素素等等)；试剂污染(质量差，交叉反应，FcFc受受体体干干扰扰等等)；组组织织处处理理不不当当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等)。第二十一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月纠正的方法视原因而异，可在预实验基础上，采用有针对性的纠正对策，即对症下药(具具体体纠纠正正方方法法不不展展开开讲讲了了，同同学学们们可可以自己阅读讲
10、义以自己阅读讲义p123-126)p123-126)。第二十二张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第四节 阳性标记的形态特征和判断第二十三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月免疫组化标记具有一定形态特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断。特点包括定性、定位和定量三方面。第二十四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。第二十五张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 一、阳性标记免疫特征：分弱弱(+)(
11、+)、中(+)、强(+)(+)三级。免疫荧光法（FITCFITC为为例例）则则表表现现为为浅浅绿绿色色荧荧光光、明明显显绿绿色色荧荧光光和和亮亮绿色耀眼荧光；绿色耀眼荧光；第二十六张，PPT共四十四页，创作于2022年6月免疫酶标记（HRP-DAB/H2O2 2）则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。一般图片照像，原则上多取强阳性区域。第二十七张，PPT共四十四页，创作于2022年6月二、阳性标记细胞学特征（以HRP-DAB/H2 2OO2为例）可分为胞膜型；胞核型；胞质(浆)型；微绒毛型和复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞胞质质兼兼有有，或或微微绒绒毛毛-胞质兼有）等五
12、种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。第二十八张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第二十九张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第三十张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第三十一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第三十二张，PPT共四十四页，创作于2022年6月三、阳性标记组织学特征（以HRP-DAB/H2O2为例）免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：局灶型；弥漫型；片块型；网状型；腺管型；腔缘型和菊团型，等等。这这主主要要取取决决于于抗抗原原抗抗体体复复合合物物在在细胞内的分布和阳
13、性细胞在组织内的群体分布特点。细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。第三十三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月四、阳性标记强度特征依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）1分；中等阳性（+）2分；强 阳 性（+）3分分。依依照照阳阳性性细细胞胞数数量量，可可分分为为：弱阳性（弱阳性（+，指阳性细胞总数在25%25%以下）；以下）；第三十四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月中等阳性（+,指阳性细胞总数在25%49%)；强阳性（+，指阳性细胞总数在50%以上)。目前多采用积分综合计量。计算公式为：（+）%x1+（+）%x2+%x2+（+）%x3；总数值1.01.
14、5者为(+)。至少随机观察5-10个HPF。第三十五张，PPT共四十四页，创作于2022年6月第五节染色失败的可能原因 第三十六张，PPT共四十四页，创作于2022年6月 免免疫疫组组化化染染色色的的基基本本要要求求有有二二：实实验验切切片片的的阳阳性性抗抗原原定定位位准准确确，呈呈色色鲜鲜明明，背背景景着着色色浅浅或或无无，二二者者的的比比值值应应大大于于1 1（阳阳性性/背背景景）；对对照照染染色色的的结结果果应应附附合合要要求求。否否则则，所所得实验结果都是错误的，或为假阳性或为假阴性。得实验结果都是错误的，或为假阳性或为假阴性。第三十七张，PPT共四十四页，创作于2022年6月假阳性是
15、指实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等有关。第三十八张，PPT共四十四页，创作于2022年6月假阴性是指实验切片呈阴性，阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果，谓之假阴性。其原因与组织处理不当，组织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、错加、失效、变质等),操作失误等有关。第三十九张，PPT共四十四页，创作于2022年6月对照结果判断：对照结果判断：表中表中1 15 5结果无效，结果无效，6 6、7 7结果可靠结果可靠（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）检测标本含抗体，结果可靠检测标本含抗体，结果可靠（
16、）（）（）（）（）（）7 7检测标本不含抗体结合可靠检测标本不含抗体结合可靠（）（）（）（）（）（）6 6非特异染色非特异染色（）（）（）（）（）（）5 5阳性对照不含定位抗原阳性对照不含定位抗原（）（）（）（）（）（）4 4阴性对照内含定位抗原阴性对照内含定位抗原()()()（）（）（）（）3 3非特异性染色非特异性染色（）（）（）（）（）（）2 2抗体失活，操作有误抗体失活，操作有误（）（）（）（）（）（）1 1结果判断结果判断检测结果检测结果替代对照替代对照阴性对照阴性对照阳性对照阳性对照第四十张，PPT共四十四页，创作于2022年6月染色失败原因：染色失败原因：均为阴性均为阴性均为弱阳
17、性（除阴性对照）均为弱阳性（除阴性对照）背景染色过深背景染色过深阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照好，待检标本弱阳性阳性对照无背景，待检标本背景深阳性对照无背景，待检标本背景深第四十一张，PPT共四十四页，创作于2022年6月判断原则：判断原则：实验设计实验设计抗体选择抗体选择抗原定位性抗原定位性抗原分布不均一性抗原分布不均一性第四十二张，PPT共四十四页，创作于2022年6月识别假阴性识别假阴性 抗原丢失或减弱抗原丢失或减弱 抗体失活抗体失活 操作不当操作不当识别假阳性识别假阳性 抗原弥散抗原弥散 抗原异位表达抗原异位表达 瘤细胞吞噬瘤细胞吞噬 病变中正常组织残留病变中正常组织残留 抗体交叉反应抗体交叉反应 内源性物质着色内源性物质着色第四十三张，PPT共四十四页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看第四十四张，PPT共四十四页，创作于2022年6月