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1、第一节基因工程的步骤第1页，共17页，编辑于2022年，星期一第二节 基因工程的步骤第2页，共17页，编辑于2022年，星期一1、基因工程的基本工具（1）“分子手术刀”-。来源：主要是从 生物中分离纯化出来的功能：能够识别双链DNA分子的某种 的 序列，并且切割特定的两个脱氧核苷酸之间的 断裂，形成黏性末端。2、“分子缝合针”-。功能：缝合两个脱氧核苷酸之间的 。与DNA聚合酶作用的异同：。3、“分子运输车”-。最常用的载体是：。必须具备的条件：4、目的基因的获取方法：。复习回顾第3页，共17页，编辑于2022年，星期一如图为DNA分子的切割和连接过程：（1）EcoRl是一种 酶，其识别序列是
2、 ，切割点是 与 之间的 键。切割结果产生的DNA片段末端形式为。（2）不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是连接酶，此酶是通过在 与 之间形成 键，而起“缝合”作用的。限制酶限制酶 GAATTC 鸟嘌呤脱氧鸟嘌呤脱氧核苷酸核苷酸 腺嘌吟脱氧核苷酸腺嘌吟脱氧核苷酸 磷酸二酯键磷酸二酯键 黏性末端黏性末端 DNA 鸟嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌吟脱氧核苷酸腺嘌吟脱氧核苷酸 磷酸二酯键磷酸二酯键 第4页，共17页，编辑于2022年，星期一通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀
3、”能识别的序列和切点是一GGATCC一，请回答：（1）从羊染色体中“剪下羊蛋白质基因的酶是 。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是 。（2）请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。（3）人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是 ，“插入”时常用的工具是 。限制性内切酶限制性内切酶 DNA连接酶连接酶 用限制酶切割C CTAGGG GATCCCCTAG G有互补的碱基序列有互补的碱基序列 细菌质粒或病毒细菌质粒或病毒第5页，共17页，编辑于2022年，星期一基因工程的一般程序基因工程的一般程序一、目的基因的获得一、目的基因的获得二、重组载体的构建二、重组载体的构建
4、三、重组载体的导入和筛选三、重组载体的导入和筛选四、目的基因的表达与鉴定四、目的基因的表达与鉴定第6页，共17页，编辑于2022年，星期一一、目的基因的获得一、目的基因的获得 直接分离法直接分离法（最常用的方法（最常用的方法鸟枪法）鸟枪法）人工合成法人工合成法化学合成法化学合成法反转录法法反转录法法外源外源DNADNADNADNA片段片段目的基因目的基因多个目的基因多个目的基因信使信使RNARNADNADNA单链单链双链双链DNADNA多个目的基因多个目的基因多个目的基因多个目的基因蛋白质氨基酸序列蛋白质氨基酸序列目的基因核苷酸序列目的基因核苷酸序列目的基因目的基因第7页，共17页，编辑于20
5、22年，星期一质粒质粒目的基因目的基因限制酶限制酶DNA连接酶连接酶重组重组DNA 二、重组载体的构建二、重组载体的构建第8页，共17页，编辑于2022年，星期一二、重组载体的构建二、重组载体的构建基因基因表达载体表达载体的组成：的组成：b b、目的基因、目的基因a a、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因e e、复制原点、复制原点提醒提醒 与载体相比较与载体相比较,增加启动子、目的基因和终止子增加启动子、目的基因和终止子三个基因片段三个基因片段,其功能各不相同。其功能各不相同。启动子启动子(DNA片段片段)起始密码子起始密码子(RNA);终止终止子子(DNA片段片段
6、)终止密码子终止密码子(RNA)。第9页，共17页，编辑于2022年，星期一1 1、19971997年，科学家将动物体内的能够年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNADNA分分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。请据右下图回答问题。(1)(1)此图表示的是采取此图表示的是采取_合成基因的方法获取合成基因的方法获取_基基因的过程。因的过程。(2)(2)图中图中DNADNA是以为是以为_ _ 模板，形成单链模板，形成单链DNADNA，在酶的作用，在酶的作用下合成双链下合成双链DNADNA，从而获得了
7、所需，从而获得了所需要的目的基因。要的目的基因。(3)(3)图中图中代表代表 ，它，它往往含往往含 基因，以便对目的基基因，以便对目的基因的检测。因的检测。人工人工 目的目的 信使信使RNARNA 重组重组DNADNA分子分子 标记标记 第10页，共17页，编辑于2022年，星期一三、重组载体的导入和筛选三、重组载体的导入和筛选细胞细胞类型类型常用常用方法方法受体受体细胞细胞转化过程转化过程植物植物细胞细胞农杆菌农杆菌转化法转化法体细胞体细胞将目的基因插入将目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上转入农杆菌转入农杆菌导入植物细胞导入植物细胞整合整合到受体细胞的到受体细胞的DNA
8、DNA上上动物动物细胞细胞显微注显微注射技术射技术受精卵受精卵将含有目的基因的表达载体提纯将含有目的基因的表达载体提纯取卵取卵获得受精卵获得受精卵显微注射显微注射早早期胚胎培养期胚胎培养胚胎移植胚胎移植发育成为发育成为 具有新性状的动物具有新性状的动物微生微生物细物细胞胞CaCa2+2+处处理增大理增大细胞壁细胞壁通透性通透性原核原核细胞细胞或酵或酵母菌母菌用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重组重组表达载体表达载体DNADNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收 提醒提醒 唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。唯一不涉及到碱基互补配对的操作
9、步骤。微生物做受体细胞主要是个体微小微生物做受体细胞主要是个体微小,代谢代谢旺盛旺盛,繁殖速度快繁殖速度快,获得目的基因产物多。获得目的基因产物多。植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。第11页，共17页，编辑于2022年，星期一基因表达基因表达 基因表达指基因组中某基因在细胞中基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。和翻译成蛋白质的过程。基因表达的改变预示着细胞在分子水平基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态功能变化之上的变化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。前的变化。DNARNAProtein
10、转录转录翻译翻译四、目的基因的检测和表达四、目的基因的检测和表达第12页，共17页，编辑于2022年，星期一32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法lDNA杂交直接鉴定第13页，共17页，编辑于2022年，星期一检测检测第14页，共17页，编辑于2022年，星期一2、下图为利用生物技术获得动物乳腺反应器和抗虫棉的过程，据图回答：在基因工程中，A表示，如果直接从苏云金杆菌中获得抗虫基因，过程使用的酶区别于其他酶的特点是 ，B表示。在研究过程中，研究人员首先从相关基因组中获取了目的基因，并采用 技术对目的基因进行了扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了重组载体。在重组载体的构建过程中需要的工
11、具酶有 。目的基因 识别特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割DNA分子 重组DNA PCR 限制性内切酶、DNA连接酶 第15页，共17页，编辑于2022年，星期一基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括哪些部分?。将目的基因导入受体细胞的过程中，在过程中一般是采用 方法，在过程中一般采用 方法，受体细胞一般是。由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法及结果是什么?。要确定目的的基因（抗虫基因）导入棉花细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体水平上的鉴定过程：。目的基因、启动子、终止子、标记基
12、因等部分 农杆菌转化法 显微注射技术 受精卵 进行抗原抗体杂交如果出现杂交带，表明奶牛中出现了抗原蛋白；不出现杂交带，表明奶牛中未出现抗原蛋白 让害虫吞食棉花叶，观察害虫是否具有抗虫性状 第16页，共17页，编辑于2022年，星期一为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 做探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性 a a 基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）耐盐基因（目的基因）耐盐基因（目的基因）一定浓度的一定浓度的盐水浇灌盐水浇灌（移植到盐（移植到盐碱地中）碱地中）第17页，共17页，编辑于2022年，星期一