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1、名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分别蛋白质一、试验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS PAGE测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术；二、试验原理蛋白质是两性电解质,在肯定的 pH 条件下解离而带电荷；当溶液的 pH 大于蛋白质的等电点 pI 时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动；当溶液的 pH 小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子外形、电场强度等；聚丙烯酰胺凝胶是由肯定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而
2、成的三维网状孔结构；本试验采纳不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶；这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率；由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带；这就是常说的浓缩效应和分子筛效应；同时,在制备上层胶 浓缩胶 和下层胶 分别胶 时,采纳两种缓冲体系；上层胶 pH=6.7 6.8 ,下层胶 pH 8.9 ； Tris HCI 缓冲液中的 Tris 用于维护溶液的电中
3、性及 pH,是缓冲配对离子；CI- 是前导离子；在 pH6.8 时,缓冲液中的 Gly- 为跟随离子,而在 pH 8.9 时, Gly 的解离度增加；这样浓缩胶和分别胶之间pH 的不连续性,掌握了慢离子的解离度,进而达到掌握其有效迁移率之目的；不同蛋白质具有不同的等电点,在进入分别胶后,各种 蛋白质由于所带的静电荷不同,而有不同的迁移率；由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中 存在的浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同的蛋白质在同一电场中达到有效 的分别；假如在聚丙烯酰胺凝胶中加入肯定浓度的十二烷基硫酸钠SDS ,由于SDS 带有大量的负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特殊是在强仍原剂如 巯
4、基乙醇存在下,蛋白质分子内的二硫键被仍原,肽链完全舒展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性的蛋白质电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量,SDS复合物；此时,蛋白质分子上所带的负 掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异；蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快；反之,愈慢；蛋白质的分子量与电泳迁 移率之间的关系是：式中 MrMr =K10-b m logMr=LogK bRm,蛋白质的分子量；logK 截距；b斜率；Rm 相对迁移率；细心整理归纳 精选学习资料 试验证明,蛋白质分子量在15,000 200,000的范畴内,电泳迁移率与分子量 第 1 页,共 4 页 - - - - - - - -
5、 - - - - - - - - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -的对数之间呈线性关系；蛋白质的相对迁移率Rm蛋白质样品的迁移距离染料 溴酚蓝 迁移距离；这样,在同一电场中进行电泳,把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图,由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量； SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE 法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、 重复性好的优点,是目前一般试验室常用的测定蛋白质分子量的方法；三、试剂及主要器材1主要试剂1 标准蛋白混合液内含：兔磷酸化酶 BMw 97,4
6、00 ,牛血清蛋白 Mw 66,200 ,兔肌动蛋白 Mw 43,000 ,牛磷酸酐酶 Mw 31,000 和鸡蛋清溶菌酶 Mw 14,400 230 凝 胶贮 备 液 ： 丙烯 酰 胺 （ Acr ）29.2g , 亚 甲 基 双 丙烯 酰 胺 （ Bis ）0.8g,加双蒸水至 100mL；外包锡纸,4冰箱储存, 30 天内使用；3 分别胶缓冲液 1.5mol L: Tris 18.17g, 加双蒸水溶解 ,6mol/L HCl 调 pH8.8,定容 100mL； 4冰箱储存4 浓缩胶缓冲液 0.5mol L: Tris 6.06g, 加水溶解,6mol/L HCl 调 pH6.8 ,并定
7、容到 100mL； 4冰箱储存5 电极缓冲液 pH8.3： SDS lg , Tris 3g, Gly 14.4g ,加双蒸水溶解并定容到 1000mL；4冰箱储存；610 SDS,室温储存7 质量浓度 10过硫酸铵 新奇配制 8 上样缓冲液：0.5mol L Tris-HCl pH6.8 1.25mL,甘油 2mL, 10 SDS 2mL, - 巯基乙醇 1mL, 0.1 溴酚蓝 0.5mL ,加蒸馏水定溶至 10mL；90.25考马斯亮蓝 R-250 染色液：0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R250,加 入 91ml50% 甲 醇 ,9ml 冰 醋 酸10 脱 色 液 ： 50ml 甲 醇
8、 , 75ml 冰 醋 酸 与 875ml 双 蒸 水 混 合11 未知分子量的蛋白质样品 1mg mL 2试验器材1DYCZ-24D 垂直板电泳槽 北京市六一仪器厂 l5cm 2电泳仪3长滴管及微量加样器4烧 杯 250mL 、 500m1 、 量 筒 500mL 、250m1 、 培 养 皿 15cm5注 射 器 等四、试验操作1 装 板将密封用硅胶框放在平玻璃上,然后将凹型玻璃与平玻璃重叠,将两块玻璃立起来使底端接触桌面,用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内,然后插入斜插板到适中程度 , 即可灌胶；细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 2
9、页,共 4 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -2 凝胶的聚合分别胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的次序及比例,配置10的分别胶和4.8 的浓缩胶；试剂名称10%的分别胶5%的浓缩胶Acr/Bis 30%/ml 3.3 0.8 分别胶缓冲液（pH8.9）/ml 3.75 0 浓缩胶缓冲液（pH6.8）0 1.25 10%SDS/ml 0.1 0.1 10%过硫酸铵 /ul 50 25 双蒸水 /ml 4.05 2.92 TEMED/ul 5 5 按上表各液加入混匀后配制成分别胶后,将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板
10、的内面缓缓用滴管滴入,当心不要产愤怒泡；将胶液加到距短玻璃板上沿2cm 处为止 , 约 5mL；然后用细滴管或注射器认真注入少量水, 约 0.5-1mL ；室温放置聚合30-40min ；待分别胶聚合后,用滤纸条轻轻吸去分别胶表面的水分,按上表制备浓缩胶；用长滴管当心加到分别胶的上面,插入样品模子 品模子；3蛋白质样品的处理 梳子 ；待浓缩胶聚合后,当心拔出样如标准蛋白质或欲分别的蛋白质样品是固体,称取 lmg 的样品溶解于 lmL 0.5molL pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；如样品是液体,要测定蛋白质浓度,按 1.0 1.5mg mL溶液比例, 取蛋白质样液与样品处理液等体积混
11、匀；本试验所用样品为 1520 g 的标准蛋白样品溶液,放置在 0.5mL 的离心管中,加入 15 20 l 的样品处理液；在 100水浴中处理 2min ,冷却至室温后备用；吸取未知分子量的蛋白质样品 20 l ,依据标准蛋白的处理方法进行处理；4 加样SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法用手夹住两块玻璃板, 上提斜插板使其松开, 然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框 , 留意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力, 再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽 , 插入斜板, 将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上, 外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可 , 留意防止在电泳槽内显现气泡；加样时可用加样器斜
12、靠在提手边缘的凹槽内,以精确定位加样位置,或用微量注射器依次在各样品槽内加样,各加10 15l 含蛋白质10 15g ,稀溶液可加20 30l 仍要依据胶的厚度敏捷把握 ；5电泳 加样完毕,盖好上盖,连接电泳仪,打开电泳仪开关后,样品进胶前电流掌握 在 15 20mA,大约 15 20min ；样品中的溴酚蓝指示剂到达分别胶之后,电流升到 30 45mA,电泳过程保持电流稳固；当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿 1 2cm 处即停止 电泳,约 1-2 小时；如室温高,打开电泳槽循环水,降低电泳温度；6染色、脱色 电泳终止后,关掉电源,取出玻璃板,在长短两块玻璃板下角间隙内,用刀轻细心整理归纳 精选学习
13、资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 3 页,共 4 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -轻撬动,即将胶面与一块玻璃板分开,然后轻轻将胶片托起,指示剂区带中心插入铜丝作为标志,放入大培育皿中染色,使用0.25 的考马斯亮蓝染液,染色2 4h,必要时可过夜；弃去染色液,用蒸馏水把胶面漂洗几次,然后加入脱色液,进行扩散脱色,经常换脱色液,直至蛋白质带清楚为止；7结果处理1 测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离 的距离 ,测量指示染料迁移的距离； 即蛋白质带中心到加样孔
14、2 按以下公式运算蛋白质样品的相对迁移率 Rm 相对迁移率样品迁移距离 cm 染料迁移距离 cm 3 标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标,蛋白质分子量的对数为 纵坐标在半对数坐标纸上做图,得到一条标准曲线；4 测定蛋白质样品的分子量：依据待测蛋白质样品的相对迁移率,从标准曲线上查 得该蛋白质的分子量；五、摸索题1 聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？2 电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？3 电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？4 上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？5 贮液配制及贮存应留意什么？6过硫酸铵、 7%乙酸和考马斯亮蓝在试验中有什么作用？附：不同分
15、别胶的配制方法分别胶的浓度20% 15% 12% 10% 7.5% 第 4 页,共 4 页 双蒸水 /ml 0.75 2.35 3.35 4.05 4.85 1.5mol/L 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Tris-HclpH8.8/ml 10%SDS/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 凝胶储备液6.6 5.0 4.0 3.3 2.5 （ Acr/Bis ）/ml 10%过硫酸铵 /ul 50 50 50 50 50 TEMED/ul 5 5 5 5 5 总体积 /ml 10 10 10 10 10 细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -