《2022年SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理和操作步骤.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理和操作步骤.docx（5页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE 实验原理和操作步骤试验原理：SDS-PAGE 是对蛋白质进行量化, 比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法； 该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分别的；SDS 是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折 叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中；SDS 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比；在样品介质和凝胶中加入强仍原剂和去污剂后, 电荷因素可被忽视； 蛋白亚基的迁移率取决 于亚基分子量；试剂和器材：试 剂 ： 1. 5x样 品 缓 冲 液
2、（ 10ml ） :0.6ml 1mol/L的Tris-HClpH6.8,5ml 50%甘油, 2ml 10% 的 SDS ,0.5ml 巯基乙醇, 1ml 1% 溴酚蓝, 0.9ml 蒸馏水；可在 4储存数周,或在20储存数月；2. 凝胶贮液： 在通风橱中, 称取丙烯酰胺 30g ,甲叉双丙烯酰胺 0.8g ,加重蒸水溶解后, 定容到 100ml ；过滤后置棕色瓶中, 4储存,一般可放置 1个月；3. pH8.9 分别胶缓冲液：Tris 36.3g ,加 1mol/L HCl 48ml, 第 1 页,共 4 页 细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - -
3、- - - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -加重蒸水 80ml 使其溶解,调 pH8.9 ,定容至 100ml , 4储存；4. pH6.7 浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ,加 1mol/L HCl 48ml,加重蒸水 80ml 使其溶解,调 pH6.7 ,定容至 100ml , 4储存；5. TEMED （四乙基乙二胺）原液 6.10% 过硫酸铵（用重蒸水新奇配制）7. pH8.3 Tris- 甘氨酸电极缓冲液： 称取 Tris 6.0g ,甘氨酸 28.8g ,加蒸馏水约 900ml ,调 pH8.
4、3 后,用蒸馏水定容至 1000ml ；置4储存,临用前稀释 10倍；8. 考马斯亮蓝G250 染色液：称 100mg考马斯亮蓝G250 ,溶于200ml 蒸馏水中, 渐渐加入 7.5ml 70% 的过氯酸, 最终补足水 到250ml ,搅拌 1小时,小孔滤纸过滤；器材：电泳仪,电泳槽,水浴锅,摇床；试验操作细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 2 页,共 4 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -（一）样品制备将蛋白质样品与 5X 样品缓冲液 （20u
5、l 5ul ）在一个 Eppendorf管中混合；放入 100 加热510min ,取上清点样；（二）分别胶及浓缩胶的制备 1 将玻璃板、样品梳、Spacer 用洗涤剂洗净,用 ddH2O 冲洗数次,再用乙醇擦拭,晾干；2 将两块洗净的玻璃板之间加入 Spacer ,根据 Bio-Rad Mini /说明书提示装好玻璃板；3 按如下体积配制 10分别胶 8.0 ml ,混匀；ddH2O 3.0 ml 1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml 30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul 10%AP 56 ul TEMED 6 ul 4 向玻璃板间灌制分
6、别胶,立刻覆一层重蒸水,大约 20 min 后胶即可聚合；5 按 如 下 体 积 配 制 6 浓 缩 胶 3.0 ml , 混 匀 ； ddH2O 1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 30% Acr-Bis 2.0 ml 400 ul 600 ul 10% SDS 10% AP TEMED 36ul 24ul 4ul 6 将上层重蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳；细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 3 页,共 4 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -7 装好电泳系统,加入电极缓冲液,上样 20 l; 8 稳压 200V ,溴酚蓝刚跑出分别胶时, 停止电泳, 约需 45 min 1hr. 9 卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色12 hr ；加入脱色液,置于 80 rpm 脱色摇床上 ,每20 min 更换一次脱色液 （10 ml 冰乙酸； 45 ml 乙醇； 45 ml 蒸馏水）至完全脱净；细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 4 页,共 4 页 - - - - - - - - -