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1、细胞培养技术实验篇四第1页，此课件共29页哦实验四一、一、VSV TCID50滴定滴定二、干扰素效价测定（一二、干扰素效价测定（一）三、中和试验（一）三、中和试验（一）第2页，此课件共29页哦一、一、VSV TCID50滴定滴定第3页，此课件共29页哦实验目的v掌握病毒掌握病毒TCID50滴定的基本原理和计算方法滴定的基本原理和计算方法v熟悉病毒熟悉病毒TCID50的应用的应用第4页，此课件共29页哦实验原理v多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解、细胞肿大或脱落等，这种改变称为病毒如细胞团缩、裂解、细胞肿大或脱
2、落等，这种改变称为病毒的致的致细胞病变效应（细胞病变效应（CPE)。vTCID50（50%tissue culture infectious dose)是病毒毒力的是病毒毒力的传统表示法，传统表示法，即能在即能在50%组织细胞培养孔或试管内引起组织细胞培养孔或试管内引起细胞病变所需的病毒最高稀释度。细胞病变所需的病毒最高稀释度。第5页，此课件共29页哦vTCID50滴定法是滴定法是50%（50%endpoint)终点法测定病毒滴终点法测定病毒滴度的方法之一，是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至度的方法之一，是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至培养成的单层细胞，将每个稀释度造成的细胞病变做成曲培
3、养成的单层细胞，将每个稀释度造成的细胞病变做成曲线，找出造成线，找出造成50%细胞病变的终点稀释度。细胞病变的终点稀释度。第6页，此课件共29页哦实验材料v细胞：Hep-2细胞株细胞株v病毒：水泡性口炎病毒（：水泡性口炎病毒（VSV)v试剂：DMEM培养液培养液(或或RPMI1640)，小牛血清，小牛血清，PBS，VTPv材料：细胞板，微量移液器，：细胞板，微量移液器，tip头头第7页，此课件共29页哦实验步骤v细胞的制备与培养细胞的制备与培养(已完成）已完成）v病毒的稀释与接种病毒的稀释与接种v结果观察与计算结果观察与计算:结果的记录时间为感染细胞的病变不再进展为止，不同的病结果的记录时间为
4、感染细胞的病变不再进展为止，不同的病毒不一样，本实验所用的水泡性口炎病毒（毒不一样，本实验所用的水泡性口炎病毒（VSV)增殖较快，增殖较快，一般一般48小时左右即可观察染色。小时左右即可观察染色。计算方法常用的有计算方法常用的有Reed-Muench法。法。第8页，此课件共29页哦v制备细胞(已经完成已经完成）：按传代细胞培养的方法制备：按传代细胞培养的方法制备Hep-2细胞悬细胞悬液，细胞浓度约为液，细胞浓度约为1 106/ml。用微量移液器将细胞悬液加入。用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔板微孔中，每孔孔中，每孔100l，37，5%CO2培养箱中培养培养箱中培养24h，形成良好的，形成
5、良好的单层。单层。v病毒稀释：用含：用含3%小牛血清的小牛血清的DMEM(或或RPMI1640）维持液）维持液将待将待测病毒测病毒VSV作连续作连续10倍稀释，依次为倍稀释，依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。第9页，此课件共29页哦12345671.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml10-110-210-310-410-510-610-7稀释病毒液稀释病毒液待测VSVDMEM维持液管号稀释度第10页，此课件共29页哦v病毒接种：将长好单层细胞的培养板各
6、孔培养液：将长好单层细胞的培养板各孔培养液全部全部倾弃倾弃，用微量加样器将各稀释度，用微量加样器将各稀释度VSV病毒液加入相应孔病毒液加入相应孔中，中，每孔每孔100l，每个稀释度加，每个稀释度加2孔孔。同时设。同时设细胞对照孔细胞对照孔，不加病毒液，只加维持液。不加病毒液，只加维持液。37，5%CO2培养箱中培培养箱中培养。养。100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l100l10-110-210-310-410-510-610-71 2 3 4 5 6 7 8 9 C DMEM维持
7、维持液液复孔试验孔第11页，此课件共29页哦v结果观察：于培养后的不同时间，：于培养后的不同时间，18h、24h、48h在倒置显微镜在倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病变不再发展时记录结果，细胞病变程下观察细胞病变情况，当病变不再发展时记录结果，细胞病变程度表示法如下：度表示法如下：-：表示无细胞病变：表示无细胞病变 +：表示：表示1%25%的细胞有病变的细胞有病变 +：表示：表示26%50%的细胞有病变的细胞有病变 +：表示：表示51%75%的细胞有病变的细胞有病变 +：表示：表示76%100%的细胞有病变的细胞有病变第12页，此课件共29页哦vReed-Muench法计算法计算TCID50
8、，举例如下：，举例如下：病毒稀释度病变数/接种数累积数（孔）累计病变细胞孔有病变无病变比例百分比（%）10-38/818018/1810010-46/810210/128310-54/8464/104010-60/80140/140由上表可知病毒的由上表可知病毒的TCID50介于介于10-4与与10-5两个稀释度之间，两稀释度之间的距离比计两个稀释度之间，两稀释度之间的距离比计算如下：算如下：病毒稀释度10-110-210-310-410-510-610-710-810-9C细胞病变+-细胞病变+-第13页，此课件共29页哦v 高于高于50%病变的百分数病变的百分数-50%v距离比例距离比例=
9、-lg稀释倍数稀释倍数v 高于高于50%病变的百分数病变的百分数-低于低于50%病变的百分数病变的百分数v v 83-50v =-lg10=-0.767v 83-40vlgTCID50=高于高于50%病变的稀释度的对数病变的稀释度的对数+距离比例距离比例v =(-4)+(-0.767)=-4.767v则该病毒的则该病毒的TCID50=10-4.767/0.1ml，即此病毒的，即此病毒的10-4.767的浓度（的浓度（1 63000）0.1ml接种一组细接种一组细胞孔后，可使胞孔后，可使50%的细胞感染病变。的细胞感染病变。v如何计算如何计算200 TCID50？v200 TCID50=6300
10、0/200=315，将病毒作，将病毒作315倍稀释时即得倍稀释时即得200 TCID50的病毒液。的病毒液。第14页，此课件共29页哦注意事项v不同的病毒应选用各自敏感的细胞。不同的病毒应选用各自敏感的细胞。v接种病毒前细胞单层必须良好。接种病毒前细胞单层必须良好。v接种病毒时应从低浓度向高浓度方向加样，防止跳管接种病毒时应从低浓度向高浓度方向加样，防止跳管现象。现象。第15页，此课件共29页哦二、干扰素效价测定（一）二、干扰素效价测定（一）（8组做此实验）组做此实验）第16页，此课件共29页哦实验目的v掌掌握握微量细胞病变抑制法测测定定干干扰扰素素效效价价的的基基本本步步骤骤以及结果分析。以
11、及结果分析。v熟悉常用生物制品生物学活性测定的实际意义。熟悉常用生物制品生物学活性测定的实际意义。v了解影响结果的常见因素。了解影响结果的常见因素。第17页，此课件共29页哦实验原理v何谓干扰素？何谓干扰素？病病毒毒或或其其他他干干扰扰素素诱诱生生剂剂作作用用于于人人或或动动物物的的白白细细胞胞、T T细细胞胞或或成成纤纤维维细细胞胞后后，刺刺激激细细胞胞产产生生的的具具有有抗抗病病毒毒、抗抗肿肿瘤瘤和和调调节节免免疫疫功功能能的的一一类类小小分分子子糖糖肽，统称为干扰素。具有间接的广谱抗病毒作用。肽，统称为干扰素。具有间接的广谱抗病毒作用。第18页，此课件共29页哦v为了进一步确定人工方法制
12、备的干扰素的生物学活为了进一步确定人工方法制备的干扰素的生物学活性，需进行体外抗病毒试验测定，即干扰素效价的性，需进行体外抗病毒试验测定，即干扰素效价的测定。测定。v干扰素效价一般定义为：若干扰素效价一般定义为：若1 1mlml干扰素标本的最高稀释干扰素标本的最高稀释度仍能保护半数细胞（度仍能保护半数细胞（5050）免受）免受“攻击病毒攻击病毒”损害，损害，则该稀释度的倒数即为干扰素的效价，表示为单位则该稀释度的倒数即为干扰素的效价，表示为单位/毫升。毫升。第19页，此课件共29页哦v测定干扰素效价的方法有多种，最常用的是测定干扰素效价的方法有多种，最常用的是“细胞病变抑制法细胞病变抑制法”（
13、Method of Cytopathic effect inhibition assay）。此法的主要优点）。此法的主要优点是操作简便，易于掌握，结果可靠，故已成为目前各实验室的常是操作简便，易于掌握，结果可靠，故已成为目前各实验室的常规。亦可用规。亦可用“放射化学测定法放射化学测定法”、“染料摄入测定法染料摄入测定法”。全量细胞病变抑制测定法全量细胞病变抑制测定法、常规微量细胞病变抑制测定法常规微量细胞病变抑制测定法、微量快速检测法（一步快微量快速检测法（一步快速法速法)第20页，此课件共29页哦实验材料v待测标本：本室制备的动物干扰素：本室制备的动物干扰素v测定细胞：人喉癌上皮细胞（：人喉
14、癌上皮细胞（Hep-2Hep-2）v攻击病毒：100100TCID50 VSVTCID50 VSVv其它材料：DMEM DMEM 液、液、VTP VTP、小牛血清、双抗、小牛血清、双抗、4040孔细孔细胞培养板、微量移液器、胞培养板、微量移液器、tiptip头、头、1010mlml吸管等。吸管等。第21页，此课件共29页哦实验步骤v稀释待检干扰素稀释待检干扰素：待测干扰素先作稀释后，然后在：待测干扰素先作稀释后，然后在40孔板中作倍比稀释。孔板中作倍比稀释。v微量单层细胞培养微量单层细胞培养：按传代细胞的方法制备：按传代细胞的方法制备4105/ml的的Hep-2细胞悬液，由细胞悬液，由低稀释度
15、向高稀释度的顺序低稀释度向高稀释度的顺序向上向上述各孔加述各孔加100 l细胞悬液，细胞悬液，37，5%CO2培养箱中培培养箱中培养养24h，形成良好的单层。，形成良好的单层。第22页，此课件共29页哦孔号12345678cv营养液（l）100100100100100100100100100100干扰素（l）100100100100100100100100-干扰素稀释度1 21 41 81 161 321 641 1281 256弃去100细胞悬液（l）1001001001001001001001001001003737，5%CO25%CO2，24h 24h 倾弃培养液倾弃培养液100100T
16、CIDTCID5050VSVVSV（l）100100100100100100100100100维持液1003737，5%CO25%CO2继续培养直至细胞病变不再发展继续培养直至细胞病变不再发展第23页，此课件共29页哦三、中和试验（一）三、中和试验（一）（7组做此实验）组做此实验）稀释血清固定病毒法稀释血清固定病毒法第24页，此课件共29页哦实验目的v测定血清中的测定血清中的VSV中和抗体效价中和抗体效价第25页，此课件共29页哦实验原理v特特异异的的抗抗病病毒毒免免疫疫血血清清（中中和和抗抗体体）和和病病毒毒作作用用后后，使使病病毒毒失失去去感感染染的的能能力力，一一种种病病毒毒只只能能被被
17、相相应应的的免免疫疫血血清清所所中中和和，中中和和一一定定量量的的病病毒毒的的感感染力必须有一定效价的中和抗体。染力必须有一定效价的中和抗体。v根根 据据 稀稀 释释 成成 分分 不不 同同 可可 分分 为为 两两 种种 方方 法法。一一 为为固固 定定 病病 毒毒 用用 量量（100TCID50）与与等等量量一一系系列列倍倍比比稀稀释释的的血血清清进进行行中中和和试试验验，以以血血清清中中和和抗抗体体滴滴度度表表示示。二二为为固固定定血血清清用用量量与与等等量量一一系系列列对对数数稀稀释释的的病病毒进行中和试验。结果以中和指数表示。毒进行中和试验。结果以中和指数表示。第26页，此课件共29页
18、哦实验材料vVSV免疫动物血清：S1、S2v100TCID50 VSV病毒悬液v稀释液、稀释液、40孔平底细胞板、孔平底细胞板、Hep-2细胞一瓶、细胞一瓶、吸管、加样器等。吸管、加样器等。第27页，此课件共29页哦实验步骤（1）v1、40孔板每孔加孔板每孔加稀释液（稀释液（DMEM）50l，作好标记。每块板做，作好标记。每块板做2个血清标本：个血清标本：S1、S2。v2、取灭活血清，第一孔加入、取灭活血清，第一孔加入50l，吹吸三次后吸出，吹吸三次后吸出50l加入第二孔，吹吸三次加入第二孔，吹吸三次吸出吸出50l加入第三孔，依次直至第八孔，吸出加入第三孔，依次直至第八孔，吸出50l弃去。第九
19、孔细胞对照，第十孔弃去。第九孔细胞对照，第十孔病毒对照均不加血清。病毒对照均不加血清。第28页，此课件共29页哦12345678CV0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.1ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml1/21/41/81/161/321/641/1281/2560.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml0.05ml37 作用作用1小时小时0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml稀释血清稀释血清血清S1稀释液管号稀释度弃弃0.05ml100TCID50 VSVS2操作同上操作同上Hep-2细胞第29页，此课件共29页哦