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1、鱼类线粒体第1页，共20页，编辑于2022年，星期三阅读文献uu鱼类线粒体鱼类线粒体鱼类线粒体鱼类线粒体DNADNA研究新进展研究新进展研究新进展研究新进展(2004)(2004)(2004)(2004)uu鱼类线粒体鱼类线粒体鱼类线粒体鱼类线粒体DNADNADNADNA及其在分子群体遗传研究中的应用及其在分子群体遗传研究中的应用及其在分子群体遗传研究中的应用及其在分子群体遗传研究中的应用（2008200820082008）uu鱼类线粒体鱼类线粒体鱼类线粒体鱼类线粒体DNADNADNADNA及其研究进展（及其研究进展（2011201120112011）uu鱼类线粒体鱼类线粒体鱼类线粒体鱼类线粒
2、体DNA DNA 的遗传与进化（的遗传与进化（的遗传与进化（的遗传与进化（20002000）uu鱼类鱼类鱼类鱼类mtDNAmtDNAmtDNAmtDNA及其非编码区的研究现状（及其非编码区的研究现状（及其非编码区的研究现状（及其非编码区的研究现状（2009200920092009）uu一种改进的鱼类线粒体一种改进的鱼类线粒体一种改进的鱼类线粒体一种改进的鱼类线粒体DNADNADNADNA的快速的快速的快速的快速 制备方法（制备方法（制备方法（制备方法（1997199719971997）uu 两种获取鱼类线粒体两种获取鱼类线粒体两种获取鱼类线粒体两种获取鱼类线粒体DNADNADNADNA的方法比
3、较（的方法比较（的方法比较（的方法比较（20002000）第2页，共20页，编辑于2022年，星期三线粒体DNA特点提取方法研究方法及其局限性应用前景第3页，共20页，编辑于2022年，星期三一 鱼类mtDNA的特点n1 分子较小且存在长度多态分子较小且存在长度多态性性 鱼类mtDNA分子大小范围一般在1520 kb之间，约占总DNA的1。鱼类mtDNA的分子大小在种间存在差异，但这种长度差异并非源于基因数目，主要由于串联重复序列的存在。第4页，共20页，编辑于2022年，星期三n2 编码效率高编码效率高 同核DNA相比，mtDNA上的基因排列极其紧凑，且无内含子，编码效率较高。此外，部分mt
4、DNA的密码子不同于基因组DNA，且缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。第5页，共20页，编辑于2022年，星期三n3 拷贝数多拷贝数多 鱼类每个细胞中有100010000个线粒体DNA拷贝，容易从组织中分离纯化。n4 进化速度快进化速度快 鱼类mtDNA的突变率高于核中DNA，为基因组DNA的5一10倍，并且缺乏有效的DNA损伤修复机制，修复效率低。第6页，共20页，编辑于2022年，星期三n5 解码体系简单解码体系简单 鱼类鱼类mtDNAmtDNA的解码的解码由一个很小的由一个很小的tRNAtRNA体系完成，而不像在核基体系完成，而不像在核基因组摆动假说中所要求的需要在因组摆动假说中所要求的
5、需要在3232个个tRNAtRNA反反密码子上的摆动。密码子上的摆动。n6 遗传的相对独立性遗传的相对独立性 mtDNAmtDNA能以自身为模板进行复制，能转录生成信使RNA(mRNA)、转运、转运RNA(tNA)RNA(tNA)和核糖体和核糖体RNA(rRNA)RNA(rRNA)，也能编码合成一些维持自身结构，也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。同和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立性。同时，线粒体的遗传行为受到核基因的调控，这种时，线粒体的遗传行为受到核基因的调控，这种调控主要是通过向线粒体输入核调控主要是通过向线粒体输入核DNADNA编码蛋白编码蛋白质和一
6、些小的质和一些小的RNARNA，特别是，特别是tRNAtRNA来实现的来实现的 。第7页，共20页，编辑于2022年，星期三n n7 同质性与异质性同质性与异质性 一般情况下，在一种生物机体内一般情况下，在一种生物机体内仅存在一种类型的仅存在一种类型的mtDNAmtDNA分子，但现在大量发现一些个体存在多种分子，但现在大量发现一些个体存在多种类型的类型的mtDNAmtDNA分子，这种特性被称分子，这种特性被称mtDNAmtDNA分子的异质性。分子的异质性。n n8 多态性多态性mtDNA中存在多态现象中存在多态现象 多态性集中在多态性集中在DD环，其他区域则高度保守一。环，其他区域则高度保守一
7、。n n9 母系遗传母系遗传 鳗鱼线粒体为双亲遗传鳗鱼线粒体为双亲遗传第8页，共20页，编辑于2022年，星期三二 鱼类mtDNA的提取方法（1 1）直接从鱼类组织提取线粒体）直接从鱼类组织提取线粒体DNA DNA 从肌肉、肝脏等组织中提取线粒体从肌肉、肝脏等组织中提取线粒体DNA DNA 本实验使用本实验使用常规的碱变性法，将常规的碱变性法，将STESTE液稍加改进作为溶液改进的液稍加改进作为溶液改进的STESTE液为：液为：10 mmol NaC110 mmol NaC1，15 mmol Tris-15 mmol Tris-HC1(pH8.0)HC1(pH8.0)，45 mmol EDTA
8、(pH8.0)45 mmol EDTA(pH8.0)，0.25 mol0.25 mol蔗糖。把提取的线粒体蔗糖。把提取的线粒体DNADNA放人一放人一2020保存备用。该方保存备用。该方法获得的是鱼类的整个法获得的是鱼类的整个mtDNAmtDNA分子。分子。选用的组织不同对应用范围的影响选用的组织不同对应用范围的影响 一般肝细胞、胃壁一般肝细胞、胃壁细胞、肾脏细胞中的线粒体数目较多，直接提取细胞、肾脏细胞中的线粒体数目较多，直接提取mtDNAmtDNA获得纯度和得率可观的获得纯度和得率可观的mtDNAmtDNA用于研究要选取这用于研究要选取这些组织，必须杀死鱼才能得到，研究存在数量多的鱼类些组
9、织，必须杀死鱼才能得到，研究存在数量多的鱼类可以采用该法。可以采用该法。第9页，共20页，编辑于2022年，星期三（2）先提取基因组DNA再用相应引物PCR 扩增所需mtDNA某一区域序列片段。从肌肉、肝脏等组织中提取基因组DNA，PCR扩增出mtDNA 区段根据动物基因组DNA提取的一般方法，将DNA提取缓冲液中各个成分含量进行改进，PCR引物为鲤科鱼类线粒体DNA细胞色素b通用引物。第10页，共20页，编辑于2022年，星期三三 鱼类mtDNA研究的方法1 限制性片段长度多态n nmtDNA由于大小、母系遗传方式、易于提纯和进化上的特点等，成为RFLP的最佳靶序列。但mtDNA进化速率较快
10、，不适合于科以上种间的比较研究。目前该法应用较广泛，主要方法有以下几种。第11页，共20页，编辑于2022年，星期三pp标准标准RFLP 其研究步骤为：其研究步骤为：mtDNAmtDNA样品一样品一RERE消化一电泳一结果检测。该法适合于分析样品中靶序列含量消化一电泳一结果检测。该法适合于分析样品中靶序列含量相对较高的样品，如相对较高的样品，如mtDNAmtDNA和和PCRPCR扩增产物，还可进扩增产物，还可进行位点比较和片段长度比较。行位点比较和片段长度比较。pp探针法探针法 又称杂交法。将基因组又称杂交法。将基因组DNADNA酶切，用酶切，用mtDNAmtDNA探针进行探针进行SouthS
11、outh杂交来识别杂交来识别DNADNA上的上的mtDNAmtDNA谱谱带，通过自显影检测印迹。带，通过自显影检测印迹。ppPCRRFLP法法 从细胞总从细胞总DNADNA中，用扩增中，用扩增mtDNAmtDNA某一序列的引物作某一序列的引物作PCRPCR，RERE消化，溴化乙锭消化，溴化乙锭染色，电泳检测。这一技术可直接酶切小于染色，电泳检测。这一技术可直接酶切小于5002 5002 000 bp000 bp的短小片段。的短小片段。第12页，共20页，编辑于2022年，星期三n n2 测序法 直接测定mtDNA的全序列或特定片段的序列。这种方法可获得大量直接可靠的数据，但受技术条件和经费限制
12、，难以适应大群体、大样本的分析。目前，结合PCR技术，可扩增特定基因片段作测序分析，在一定程度上扩展了测序法的应用范围。第13页，共20页，编辑于2022年，星期三mtDNA的研究方法存在局限性n n PCR-RFLPPCR-RFLP法方便、快捷，对样品数量和质量法方便、快捷，对样品数量和质量的要求低，费用和时间消耗少，但终究只是对的要求低，费用和时间消耗少，但终究只是对DNADNA序列的间接反映：而测序法虽可获得大量的序列的间接反映：而测序法虽可获得大量的较为可靠的数据，但由于技术限制和费用巨大，较为可靠的数据，但由于技术限制和费用巨大，难以用于大群体和大样本的遗传和进化研究。而难以用于大群
13、体和大样本的遗传和进化研究。而且，在实际研究中，由于统计学的缘故，基于且，在实际研究中，由于统计学的缘故，基于DNADNA水平计算的群体基因突变率往往高于真实的水平计算的群体基因突变率往往高于真实的情况。因而在进行鱼类分子群体遗传研究时，应情况。因而在进行鱼类分子群体遗传研究时，应将遗传结构的分析结果与生物的形态结构、生理将遗传结构的分析结果与生物的形态结构、生理特征和生态环境等因素综合考虑，从更多的方面特征和生态环境等因素综合考虑，从更多的方面寻找更多的证据，从而得出一个更加客观、系统寻找更多的证据，从而得出一个更加客观、系统而深入的认识。而深入的认识。第14页，共20页，编辑于2022年，
14、星期三四 鱼类mtDNA研究的应用前景n1 保护濒危鱼种的遗传多样性。保护生物学的中心议题是保护生物的遗传多样性。mtDNA多态分析可用来检测濒危物种的多样性程度，是对物种是否濒危及其可能的演变趋势的一种有效评估方式，在鱼类濒危物种的保护和恢复方面将发挥巨大的作用。第15页，共20页，编辑于2022年，星期三n2 由于mtDNA母系遗传的特性，利用其母系遗传规律研究单性鱼类的来源，使得鱼类mtDNA多态分析在杂交带遗传渐渗研究中具有巨大潜力，并在进行杂种分析、揭示杂种来源方面发挥巨大作用。第16页，共20页，编辑于2022年，星期三n3 利用鱼类mtDNARFLP分析，研究个体间的遗传多态和群
15、体间的遗传歧异，阐明种群的遗传结构，揭示物种多样性概况，从而为解决渔政管理的核心问题 遗传多样性保护提供理论依据。第17页，共20页，编辑于2022年，星期三n n4 利用mtDNARFLP分析，可以评估渔业活动对鱼类遗传资源结构的影响，检测引入种和驯化种对野生资源的影响、养殖种群对野生种群的影响及引种过程中遗传多样性的改变，从而加强对渔业活动的指导，提供科学有效的管理手段和模式。渔业活动如果是选择性的，对其中某些组分的过分捕捞势必改变整个种群的遗传结构，是造成资源衰退的一个重要原因。第18页，共20页，编辑于2022年，星期三n n5 利用mtDNA分析种内多态性，可揭示原始种群的遗传分化情况以及与地理分布的关系，这也是分子动物地理学研究的核心内容。n n6 mtDNA种间多态比较分析，可作为了解物种起源与分化、明确种问系统发生关系的分子标记。n n7 利用mtDNA多态分析，可计算物种或种群的分离时间，有助于解决分类中的疑难问题。第19页，共20页，编辑于2022年，星期三谢谢第20页，共20页，编辑于2022年，星期三