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1、生命大分子物质的制备 2022/10/71现在学习的是第1页，共63页生化分离制备方法基本原理生化分离制备方法基本原理n用于生化分离的制备技术，大多根据混合物中的用于生化分离的制备技术，大多根据混合物中的不同组分分配率的差别将它们分配于可用于机械不同组分分配率的差别将它们分配于可用于机械方法分离的两个或几个物象中（如有机溶剂抽提、方法分离的两个或几个物象中（如有机溶剂抽提、盐析、结晶等）。或者将混合物置于某一物相中盐析、结晶等）。或者将混合物置于某一物相中（固相或液相）外加一定的作用力，使各种成份（固相或液相）外加一定的作用力，使各种成份分配于不同区域，达到分离目的。分配于不同区域，达到分离目
2、的。2022/10/72现在学习的是第2页，共63页生化分离制备方法的特点生化分离制备方法的特点1.1.生物材料存在的状态多样性：结合态、混合物、游离形式、生物材料存在的状态多样性：结合态、混合物、游离形式、分泌型；分泌型；2.2.生物材料组成非常复杂，不断代谢变化；生物材料组成非常复杂，不断代谢变化；3.3.有效成份在材料中含量极微；有效成份在材料中含量极微；4.4.生物材料离体后丧失生理活性；生物材料离体后丧失生理活性；5.5.分离制备的溶液各种参数难以控制；分离制备的溶液各种参数难以控制；6.6.一般采用温和的，多阶式程序；一般采用温和的，多阶式程序；7.7.材料来源、含量、存在状态、稳
3、定性的差异，制备方法材料来源、含量、存在状态、稳定性的差异，制备方法的通用性差；的通用性差；8.8.生化分离方法的最后均一性与化学中的纯度的概念上的生化分离方法的最后均一性与化学中的纯度的概念上的差异。差异。2022/10/73现在学习的是第3页，共63页生物物质制备的基本过程生物物质制备的基本过程n材料的选择与处理材料的选择与处理n确定测定方法确定测定方法n有效成份的抽提有效成份的抽提n粗制品的纯化粗制品的纯化n纯化产品的分析与鉴定纯化产品的分析与鉴定（定性与定量）（定性与定量）2022/10/74现在学习的是第4页，共63页内容提要内容提要 第一节第一节 材料的选择和处理材料的选择和处理
4、第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定 第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提 第五节第五节 有效成分的浓缩有效成分的浓缩 第六节第六节 有效成分纯化方案的设计和评价有效成分纯化方案的设计和评价 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析 第八节第八节 应用实例应用实例2022/10/75现在学习的是第5页，共63页第一节第一节 材料的选择与处理材料的选择与处理一、一、有效成份：有效成份：是指欲纯化的某种单一的生命大分子物是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。质。二、二、选材的原则：选材的原则：遵循有效成份含量多，对环境适应遵循有效成
5、份含量多，对环境适应性强、稳定性好，来源丰富，提取工艺简单，并有性强、稳定性好，来源丰富，提取工艺简单，并有综合利用等原则。综合利用等原则。三、三、材料的处理：材料的处理：目的是如何保持材料的活力，保持提目的是如何保持材料的活力，保持提取率高，去除影响有效成份中杂混的物质。取率高，去除影响有效成份中杂混的物质。2022/10/76现在学习的是第6页，共63页 1 1动物脏器动物脏器（1 1）冰冻：）冰冻：去除脂肪及结缔组织，迅速冰冻；去除脂肪及结缔组织，迅速冰冻；（2 2）干燥：）干燥：经过脱水，干燥条件下保存样品。经过脱水，干燥条件下保存样品。材料的处理材料的处理2.2.植物组织：植物组织：
6、除蜡去油脂，低温储藏除蜡去油脂，低温储藏4 43030。3.3.微生物：微生物：离心法收集菌体后，再进行后续处理。胞外离心法收集菌体后，再进行后续处理。胞外酶则离心弃菌体。酶则离心弃菌体。2022/10/77现在学习的是第7页，共63页内容提要内容提要 第一节第一节 材料的选择和处理材料的选择和处理 第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定 第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提 第五节第五节 有效成分的浓缩有效成分的浓缩 第六节第六节 有效成分纯化方案的设计和评价有效成分纯化方案的设计和评价 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析
7、 第八节第八节 应用实例应用实例2022/10/78现在学习的是第8页，共63页第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定一、目的和要求一、目的和要求-纯化的对象（有效成分）纯化的对象（有效成分）追踪有效成份的去向追踪有效成份的去向n必须建立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。此必须建立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。此外，重复性好、经济、能在小体积进行操作、尽量外，重复性好、经济、能在小体积进行操作、尽量不需用昂贵的仪器。不需用昂贵的仪器。2022/10/79现在学习的是第9页，共63页二、方法二、方法 定性和定量定性和定量 或是求得更多更纯的产品，或是为了获得新的物或是求得更多更纯的产品，
8、或是为了获得新的物质。质。1.1.生物测定方法生物测定方法：全面涉及生物学各科的实验内容；：全面涉及生物学各科的实验内容；2 2.理化测定方法：理化测定方法：色谱法、光谱法、电泳法、电化学法；色谱法、光谱法、电泳法、电化学法；3 3.生化测定方法：生化测定方法：生物学与物理化学方法二者结合使用。生物学与物理化学方法二者结合使用。鉴定方法应是：鉴定方法应是：特异性强、重现性好、准确度大、灵特异性强、重现性好、准确度大、灵敏度高、手续简便。敏度高、手续简便。2022/10/710现在学习的是第10页，共63页常用的测定方法常用的测定方法1.1.光谱法光谱法图：紫外可见分光光度计图：紫外可见分光光度
9、计（1 1）吸收光谱法）吸收光谱法 当一种酶反应的底物或产物有当一种酶反应的底物或产物有一个明显的吸收光谱时，可测定一个明显的吸收光谱时，可测定发色团的产生和消失来确定酶存发色团的产生和消失来确定酶存在的数量。在的数量。n直接测定法：直接测定法：n核酸含量的测定核酸含量的测定n蛋白质含量和纯度的测定蛋白质含量和纯度的测定n比色法比色法2022/10/711现在学习的是第11页，共63页细胞色素细胞色素b b（红色链孢酶）（红色链孢酶）563 563 532 532 429 429细胞色素细胞色素a a，a a3 3（牛心）（牛心）600 600 439 439细胞色素细胞色素c c（马心）（马
10、心）550 550 521 521 415 415d 326d 326典型的典型的a,a,b,c b,c型型细胞色素细胞色素光谱特征光谱特征2022/10/712现在学习的是第12页，共63页1A260un of olidonucleotide=30g/ml 样品的纯度可根据不同吸收值的样品的纯度可根据不同吸收值的比例进行判断。蛋白质的吸收峰比例进行判断。蛋白质的吸收峰A A280280，纯净纯净DNADNA的在中性及稍碱性的的在中性及稍碱性的pHpH时时A A260260/A/A2802801.81.8，纯，纯RNARNA的比例的比例2.02.0。372022/10/713现在学习的是第13
11、页，共63页例：酶活性的测定（胰蛋白酶）例：酶活性的测定（胰蛋白酶）240 250 260 270 2800.80.60.40.22022/10/714现在学习的是第14页，共63页图：荧光分光光度计图：荧光分光光度计(2)(2)荧光法荧光法 荧光分析法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法荧光分析法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。好。当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光分析法可以求得满意结果。分析法可以求得满意结果。(3)(3)浊度法浊度法 极稀的悬浮液可采用极稀的悬浮液可采用此法测定，即测定悬浮液此法测定，即测定悬浮液在不被
12、吸收的波长下表观在不被吸收的波长下表观的消光值（吸光度或光密度的消光值（吸光度或光密度 ）。）。2022/10/715现在学习的是第15页，共63页2 2电化学法电化学法 有些反应过程会放出质子氢（有些反应过程会放出质子氢（H H+），可用灵敏的），可用灵敏的pHpH计或计或NaOHNaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测物的含量溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测物的含量或活力。或活力。3 3生物活性检测法生物活性检测法 大多数生命物质，尤其是一些激素类物质，当把它们注射大多数生命物质，尤其是一些激素类物质，当把它们注射入动物的待定器官时，所属机体将发生相应的变化，并且二者入动物
13、的待定器官时，所属机体将发生相应的变化，并且二者间有一定的相关性。间有一定的相关性。2022/10/716现在学习的是第16页，共63页4.4.免疫分析法免疫分析法 采用抗体与抗原之间发生的特异反应，并结合放射性同位素采用抗体与抗原之间发生的特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，对有关物质进行灵敏的定性或和定量分析。标记或酶标记，对有关物质进行灵敏的定性或和定量分析。5 5生物传感器生物传感器 用生物传感器的敏感膜与待测溶液中的某一物质进行用生物传感器的敏感膜与待测溶液中的某一物质进行反应，即可通过显示器反映出有效成分的数量。反应，即可通过显示器反映出有效成分的数量。2022/10/717
14、现在学习的是第17页，共63页内容提要内容提要 第一节第一节 材料的选择和处理材料的选择和处理 第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定 第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提 第五节第五节 有效成分的浓缩有效成分的浓缩 第六节第六节 有效成分纯化方案的设计和评价有效成分纯化方案的设计和评价 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析 第八节第八节 应用实例应用实例2022/10/718现在学习的是第18页，共63页细胞破碎细胞破碎n定义定义：在不破坏有效成份的条件下，采用适当的：在不破坏有效成份的条件下，采用适当的生物学、化学、物理学
15、的方法，对动物、植物、生物学、化学、物理学的方法，对动物、植物、微生物的组织或细胞结构进行破碎、加工，除去微生物的组织或细胞结构进行破碎、加工，除去任何不想要的组织与成份，以便提取生物活性成任何不想要的组织与成份，以便提取生物活性成份的过程。份的过程。第三节第三节 细胞破碎细胞破碎2022/10/719现在学习的是第19页，共63页 细胞破碎的方法介绍细胞破碎的方法介绍一、机械破碎一、机械破碎 1.1.研磨法研磨法 2 2.组织捣碎器法组织捣碎器法 3 3.压榨法压榨法 4 4.匀浆法匀浆法二、物理法二、物理法 1 1.超声波法超声波法 2 2.反复冻融法反复冻融法 3 3.溶胀，低渗休克溶胀
16、，低渗休克 4 4.急热骤冷法急热骤冷法 三、生物及化学法三、生物及化学法 1 1.酶降解法酶降解法 2 2.自溶法自溶法 3 3.化学溶剂，表面活性剂处理化学溶剂，表面活性剂处理2022/10/720现在学习的是第20页，共63页 一、机械破碎一、机械破碎 通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法。碎的方法。1.1.研磨法研磨法n利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。所产生的剪切力将组织细胞破碎。2.2.组织捣碎器法组织捣碎器法n利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力利用捣
17、碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。将组织细胞破碎。2022/10/721现在学习的是第21页，共63页3.3.压榨法压榨法此法是一种温和、彻底的细胞破碎方法。用此法是一种温和、彻底的细胞破碎方法。用1.77 x 101.77 x 108 83.54 x 103.54 x 108 8 Pa Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过的压力迫使几十毫升细胞悬液通过个小孔个小孔（细胞直径的孔），致使其被挤破、压碎。细胞直径的孔），致使其被挤破、压碎。4.4.匀浆法匀浆法n利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎。利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎。n匀浆器由一个内壁经磨砂的管和一根表面经磨砂的研
18、杆组成。匀浆器由一个内壁经磨砂的管和一根表面经磨砂的研杆组成。必须配套使用。研杆与管壁之间仅有几百微米的间隙。必须配套使用。研杆与管壁之间仅有几百微米的间隙。2022/10/722现在学习的是第22页，共63页实验室电动组织匀浆器实验室电动组织匀浆器2022/10/723现在学习的是第23页，共63页二、物理法二、物理法n通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。破碎的方法。1.1.超声波法超声波法n是利用超声波（是利用超声波（101025kHz25kHz）的机械振动，产生空化作用导）的机械振动，产生空化作用导致液体局部
19、、瞬间的压力变化，从而引起液体内部发生流动、致液体局部、瞬间的压力变化，从而引起液体内部发生流动、旋滑生成与消失时产生巨大的拉力，使液体拉伸、破裂并出旋滑生成与消失时产生巨大的拉力，使液体拉伸、破裂并出现切变力而促进细胞破裂。现切变力而促进细胞破裂。n为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行操作。低温度的方法进行操作。2022/10/724现在学习的是第24页，共63页破碎细胞的工具破碎细胞的工具2022/10/725现在学习的是第25页，共63页2.2.冻融法冻融法将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室
20、温下将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或（或40 40 左右），迅速融化；如此反复冻融多次，细胞可左右），迅速融化；如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生肿胀、破碎。在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生肿胀、破碎。3.3.溶胀溶胀n细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象。胀破的现象。2022/10/726现在学习的是第26页，共63页4 4.急热骤冷法急热骤冷法n
21、利用温度的突然变化。利用温度的突然变化。n细胞由于热胀冷缩的作用而破碎。细胞由于热胀冷缩的作用而破碎。2022/10/727现在学习的是第27页，共63页三、化学处理三、化学处理用脂溶性的溶剂，如丙酮、氯仿、甲苯或表面活用脂溶性的溶剂，如丙酮、氯仿、甲苯或表面活性剂（性剂（SDSSDS、TweenTween、TritonTriton）处理细胞时，可把细）处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或各种酶类或DNADNA等物质，并导致整个细胞破碎。等物质，并导致整个细胞破碎。2022/10/728现在学习的是第28页，共63
22、页四、生物法四、生物法1.1.自溶自溶n细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称为用下，发生溶解的现象称为自溶。自溶。2.2.酶解法酶解法n用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶（如蛋白酶、脂肪酶、用外源的溶菌酶或细胞壁分解酶（如蛋白酶、脂肪酶、透明质酸酶等），在一定条件下作用于细胞而使细胞壁透明质酸酶等），在一定条件下作用于细胞而使细胞壁破碎。破碎。n细胞壁消解，随之是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最细胞壁消解，随之是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后细胞完全破碎。后细胞完全破碎。2022/10/729现在学习的是第29页，
23、共63页酶降解法酶降解法酶作用酶作用 破细胞壁破细胞壁 渗透压改变渗透压改变细胞胀破细胞胀破 细胞破碎细胞破碎 提取有效成份提取有效成份2022/10/730现在学习的是第30页，共63页内容提要内容提要 第一节第一节 材料的选择和处理材料的选择和处理 第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定 第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提 第五节第五节 有效成分的浓缩有效成分的浓缩 第六节第六节 有效成分纯化方案的设计和评价有效成分纯化方案的设计和评价 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析 第八节第八节 应用实例应用实例2022/10/
24、731现在学习的是第31页，共63页第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提n定义：定义：利用适当的方法，适当的溶剂，使有效成份的利用适当的方法，适当的溶剂，使有效成份的溶解度达最大（或杂质的溶解度最大），杂质的溶解溶解度达最大（或杂质的溶解度最大），杂质的溶解度最小（或有效成份的溶解度最小）时，将有效成份度最小（或有效成份的溶解度最小）时，将有效成份最大限度的从原材料中提取、分离出来。最大限度的从原材料中提取、分离出来。2022/10/732现在学习的是第32页，共63页提取溶剂选择原理提取溶剂选择原理n水溶液提取水溶液提取(能溶解于水、稀酸、稀盐、稀碱缓冲能溶解于水、稀酸、稀盐、稀碱缓冲
25、液的蛋白质液的蛋白质)。n有机溶剂提取有机溶剂提取(与脂质结合的、含非极性侧链较多与脂质结合的、含非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水的蛋白质和酶，不溶于水)，利用有机溶解的亲水，利用有机溶解的亲水性和亲脂性提取脂蛋白。性和亲脂性提取脂蛋白。2022/10/733现在学习的是第33页，共63页 影响因子影响因子n缓冲液（缓冲液（buffer)buffer)的的pHpH：提取蛋白质时应远离其提取蛋白质时应远离其 pI pI 的的 pH pH 条件下进行，条件下进行，以不危及蛋白质的化学属以不危及蛋白质的化学属性，并使其有良好的溶解性，并使其有良好的溶解性性。故酸性蛋白选择高故酸性蛋白选择高的的p
26、HpH，碱性蛋白质选择低碱性蛋白质选择低的的pHpH。n离子强度：离子强度：适宜用等渗适宜用等渗溶液；溶液；n金属离子螯合物：金属离子螯合物：EDTAEDTA、EGTAEGTA；n还原剂还原剂：2-2-巯基乙醇、半巯基乙醇、半胱氨酸、还原谷胱甘肽胱氨酸、还原谷胱甘肽、DTTDTT等；等；n蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂：PMSFPMSFn温度：温度：低温操作，利于保低温操作，利于保存、稳定生物活性。存、稳定生物活性。2022/10/734现在学习的是第34页，共63页提取的方法提取的方法1.1.盐溶液提取：盐溶液提取：n低浓度的中性盐可使电解质的溶解度明显增加，这就低浓度的中性盐可使电解质的溶解度
27、明显增加，这就是盐溶。是盐溶。2.2.稀酸、稀碱溶液提取稀酸、稀碱溶液提取npIpI在碱性范围的酶可用稀酸提取；在碱性范围的酶可用稀酸提取；pIpI在酸性范围的酶可在酸性范围的酶可用稀碱提取。用稀碱提取。3.3.有机溶剂提取有机溶剂提取2022/10/735现在学习的是第35页，共63页内容提要内容提要 第一节第一节 材料的选择和处理材料的选择和处理 第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定 第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提 第五节第五节 有效成分的浓缩有效成分的浓缩 第六节第六节 有效成分纯化方案的设计和评价有效成分纯化方案的设计和评价 第七节第七
28、节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析 第八节第八节 应用实例应用实例2022/10/736现在学习的是第36页，共63页第五节第五节 样品的浓缩样品的浓缩n定义：定义：当有效成份浓度太低、体积较大时，用适当有效成份浓度太低、体积较大时，用适当的方法，使其浓度加大、体积缩小的过程。当的方法，使其浓度加大、体积缩小的过程。n 中性盐沉淀法中性盐沉淀法n 吸附法吸附法n 超过滤法超过滤法n 透析法透析法n 减压蒸馏法减压蒸馏法n 冰冻干燥法冰冻干燥法n 超离心法超离心法 2022/10/737现在学习的是第37页，共63页对浓缩样品的考虑对浓缩样品的考虑n保护样品的生物活性，因此除了
29、减压蒸馏浓缩法外，其余保护样品的生物活性，因此除了减压蒸馏浓缩法外，其余的浓缩方法均应在的浓缩方法均应在44进行；除特殊的例外。进行；除特殊的例外。n在操作过程中保持样品有相对高的回收率。在操作过程中保持样品有相对高的回收率。n时间的考虑，尽可能短的时间里完成。时间的考虑，尽可能短的时间里完成。n样品的分子量与方法及工具的匹配。样品的分子量与方法及工具的匹配。2022/10/738现在学习的是第38页，共63页一、沉淀法一、沉淀法n 在抽提液中加入适量的中性盐在抽提液中加入适量的中性盐 (NH(NH4 4)2 2SOSO4 4或有机溶剂，或有机溶剂，使有效成分变为沉淀。使有效成分变为沉淀。二、
30、吸附法二、吸附法将干葡聚糖凝胶将干葡聚糖凝胶G25G25加入抽提液中，两者比例为加入抽提液中，两者比例为1:51:5。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右，回收蛋白质量约右，回收蛋白质量约8080。2022/10/739现在学习的是第39页，共63页 三、超过滤法三、超过滤法n把抽提液装入超过滤装置。把抽提液装入超过滤装置。在空气或氮气（在空气或氮气（5.05 5.05 10105 5 Pa Pa）压力下，使小）压力下，使小分子物质（包括水分）分子物质（包括水分）通过半透膜（如硝酸纤通过半透膜（如硝酸纤维素膜），大分子物质维素膜），大分子物质
31、留在膜内。留在膜内。超过滤浓缩装置超过滤浓缩装置1.1.空气入口空气入口 2.2.半透膜半透膜3.3.超过滤液超过滤液 4.4.磁力搅拌磁力搅拌5.5.支架支架2022/10/740现在学习的是第40页，共63页例：蛋白质的浓缩例：蛋白质的浓缩离心柱超滤离心柱超滤是对小体积样品是对小体积样品（2 2mlml）进行快速的浓缩，进行快速的浓缩，回收率达回收率达9090。同时通过。同时通过离心对样品的脱盐也很方离心对样品的脱盐也很方便。便。n选择柱子选择柱子滤膜滤膜的不同型的不同型号而截留大小不等的分子。号而截留大小不等的分子。2022/10/741现在学习的是第41页，共63页四、透析浓缩法四、透
32、析浓缩法n把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇或甘油中，把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇或甘油中，10 ml10 ml抽提液可在抽提液可在1 1小时内浓缩到几乎无水的程度。小时内浓缩到几乎无水的程度。n除此之外，浓缩也可按除此之外，浓缩也可按真空透析浓缩装置真空透析浓缩装置进行。进行。真空透析浓缩装置真空透析浓缩装置1.1.抽气口抽气口 2.2.透析袋透析袋3.3.抽气瓶抽气瓶 磁力搅拌器磁力搅拌器图图 连续透析装置连续透析装置2022/10/742现在学习的是第42页，共63页五、减压蒸馏浓缩法五、减压蒸馏浓缩法 将抽提液装入减压蒸馏将抽提液装入减压蒸馏器的圆底烧瓶中在减压器的圆
33、底烧瓶中在减压真空状态下进行蒸馏（图真空状态下进行蒸馏（图1-1-3 3）。）。当真空度较高时，溶液当真空度较高时，溶液的沸点可控制在的沸点可控制在3030以下，以下，这种方法一般适用于常温这种方法一般适用于常温下稳定性好的物质。下稳定性好的物质。旋转蒸发仪旋转蒸发仪2022/10/743现在学习的是第43页，共63页六、冰冻干燥法六、冰冻干燥法n冰冻的抽提液在真空状态下，冰冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直接变为气体。用可以由固体直接变为气体。用此原理进行浓缩，有效成分几此原理进行浓缩，有效成分几乎不会被破坏。乎不会被破坏。n冻干机主要由低温干燥箱、真冻干机主要由低温干燥箱、真空泵和冷冻机
34、所构成。空泵和冷冻机所构成。Freeze Dryer Freeze Dryer SystemsSystems 2022/10/744现在学习的是第44页，共63页真空干燥浓缩样品真空干燥浓缩样品2022/10/745现在学习的是第45页，共63页配置配置5050冷阱、防腐蚀冷阱、防腐蚀化学隔膜泵的真空干燥浓化学隔膜泵的真空干燥浓缩仪缩仪8 8个独立控制真空多枝个独立控制真空多枝管，进行带滤盖的大管，进行带滤盖的大小不同的容器小不同的容器2022/10/746现在学习的是第46页，共63页内容提要内容提要 第一节第一节 材料的选择和处理材料的选择和处理 第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定
35、 第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提 第五节第五节 有效成分的浓缩有效成分的浓缩 第六节第六节 有效成分纯化方案的设计和评价有效成分纯化方案的设计和评价 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析 第八节第八节 应用实例应用实例2022/10/747现在学习的是第47页，共63页第六节第六节 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价一一.纯化方案的设计纯化方案的设计 纯化方案是由几种纯化方法组成的，故在设计纯纯化方案是由几种纯化方法组成的，故在设计纯化方案时，首先应确定纯化方法。即根据有效成份和化方案时，首先应确定纯化方法。即根据有效
36、成份和杂质之间理化性质的差异考虑设计分级分离纯化的各杂质之间理化性质的差异考虑设计分级分离纯化的各种方法，依各方面的性质、难易程度、效率的高低、种方法，依各方面的性质、难易程度、效率的高低、分离体积的大小等诸因素的考虑，把各方法排列成序，分离体积的大小等诸因素的考虑，把各方法排列成序，组成纯化有效成份的一套完整方案。组成纯化有效成份的一套完整方案。2022/10/748现在学习的是第48页，共63页2022/10/749现在学习的是第49页，共63页2022/10/750现在学习的是第50页，共63页生物大分子物质制备生物大分子物质制备大肠杆菌碱性磷酸酶的制备纯化步骤大肠杆菌碱性磷酸酶的制备纯
37、化步骤 E.coli E.coli 菌种的培养菌种的培养 渗透压法破细菌渗透压法破细菌 热处理热处理80 1580 15分钟（除变性蛋白）分钟（除变性蛋白）硫酸铵盐析（浓硫酸铵盐析（浓缩蛋白质）缩蛋白质）DEAE-DEAE-纤维素离子交换剂层析（纯化蛋纤维素离子交换剂层析（纯化蛋白质）紫外检测（白质）紫外检测（U.V280nmU.V280nm）合并吸收峰合并吸收峰 凝胶凝胶过滤（除杂蛋白）过滤（除杂蛋白）收集吸收峰（纯化的酶）收集吸收峰（纯化的酶）活力活力（活性）测定（活性）测定2022/10/751现在学习的是第51页，共63页二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价 对纯化方案的评价，实质上是
38、对组成纯化方案的每对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每一个纯化方法的评价。一个纯化方法的评价。评价方法（纯化倍数和得率）评价方法（纯化倍数和得率）：n得率得率 X100%X100%n纯化倍数纯化倍数n比比 活活 力力 X100%X100%每步有效成份的总活力每步有效成份的总活力粗提取液中有效成份的总活力粗提取液中有效成份的总活力 每步有效成份的比活力每步有效成份的比活力粗提取液中有效成份的比活力粗提取液中有效成份的比活力 总活力单位数（总活力单位数（u u）总蛋白量（总蛋白量（mg)mg)2022/10/752现在学习的是第52页，共63页评价纯化方法的可行性原则评价纯化方法的可行性原
39、则n增大纯化倍数增大纯化倍数n提高收得率提高收得率n保持样品的活性保持样品的活性2022/10/753现在学习的是第53页，共63页下面以从赛氏杆菌提取下面以从赛氏杆菌提取L-L-门冬酰胺酶为例，说明纯化方案与门冬酰胺酶为例，说明纯化方案与纯化倍数和收得率的关系纯化倍数和收得率的关系(见表见表1-7)1-7)。2022/10/754现在学习的是第54页，共63页内容提要内容提要 第一节第一节 材料的选择和处理材料的选择和处理 第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定 第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提 第五节第五节 有效成分的浓缩有效成分的浓缩 第六节
40、第六节 有效成分纯化方案的设计和评价有效成分纯化方案的设计和评价 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析 第八节第八节 应用实例应用实例2022/10/755现在学习的是第55页，共63页第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析n常用于鉴定有效成分纯度的方法有：电泳、免疫分析、薄层层常用于鉴定有效成分纯度的方法有：电泳、免疫分析、薄层层析；析；n用于检测其含量和性质的方法有：光谱法、气相层析；用于检测其含量和性质的方法有：光谱法、气相层析；n用于测定其分子质量的方法有：凝胶过滤、电泳；用于测定其分子质量的方法有：凝胶过滤、电泳；n用于测定核酸序列的
41、方法有：化学直接法、酶解直读法、基用于测定核酸序列的方法有：化学直接法、酶解直读法、基因组学方法；因组学方法；n用于测定蛋白质序列的方法有：与用于测定蛋白质序列的方法有：与EdmanEdman降解法相结合的薄膜降解法相结合的薄膜层析、蛋白质组学方法等。层析、蛋白质组学方法等。2022/10/756现在学习的是第56页，共63页内容提要内容提要 第一节第一节 材料的选择和处理材料的选择和处理 第二节第二节 测定方法的确定测定方法的确定 第三节第三节 细胞破碎细胞破碎 第四节第四节 有效成分的抽提有效成分的抽提 第五节第五节 有效成分的浓缩有效成分的浓缩 第六节第六节 有效成分纯化方案的设计和评价
42、有效成分纯化方案的设计和评价 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析 第八节第八节 应用实例应用实例2022/10/757现在学习的是第57页，共63页含含5959FeFe标记的转铁蛋白的人血清样品标记的转铁蛋白的人血清样品DEAE-Sephacel DEAE-Sephacel 层析柱层析柱5959FeFe标记的组分标记的组分该组分的浓缩液（约该组分的浓缩液（约l-2 mll-2 ml）纯的人转铁蛋白（测定放射性强度）纯的人转铁蛋白（测定放射性强度）透析和超过滤处理透析和超过滤处理分离分离PBA-60(PBA-60(苯基硼酸苯基硼酸-琼脂糖琼脂糖)亲和亲和吸附层析柱吸附
43、层析柱第八节第八节 应用实例应用实例一、高纯度人转铁蛋白的制备一、高纯度人转铁蛋白的制备2022/10/758现在学习的是第58页，共63页 0.5 ml 0.5 ml培养培养1515 h h的黄杆菌的黄杆菌菌液（菌液（A A600600=1.8=1.8）菌体菌体缓冲液处理后的菌体缓冲液处理后的菌体裂解液处理后的菌体裂解液处理后的菌体质粒质粒DNADNA粗品粗品加入缓冲液，加入缓冲液，2828，0.5 h0.5 h二、二、细菌质粒细菌质粒DNADNA的提取的提取加入加入0.2 ml裂解液裂解液（0.2 mol/L NaOH 2 SDS，pH12.5），），摇动摇动5 min离心，去掉上清液离心
44、，去掉上清液缓冲液（缓冲液（pH=8.0pH=8.0）：）：25 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L EDTA、2 mg/ml 溶菌酶溶菌酶加入等体积的苯酚加入等体积的苯酚 :氯仿（氯仿（1:11:1）抽提，）抽提，12000 rpm12000 rpm离心离心5 min5 min2022/10/759现在学习的是第59页，共63页2022/10/760现在学习的是第60页，共63页2022/10/761现在学习的是第61页，共63页2022/10/762现在学习的是第62页，共63页本章要点本章要点1.1.建立专一、快速和灵敏的测定方法。建立专一、快速和灵敏的测定方法。2.2.影响抽提有效成分的八大因子。影响抽提有效成分的八大因子。3.3.根据有效成分和杂质理化性质的差异性，设计根据有效成分和杂质理化性质的差异性，设计适当纯化方案并对其进行评价。适当纯化方案并对其进行评价。2022/10/763现在学习的是第63页，共63页