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1、生化技术课件第一章生化技术课件第一章生化技术课件第一章生化技术课件第一章生命大分子物质的制生命大分子物质的制生命大分子物质的制生命大分子物质的制备备备备现在学习的是第1页，共89页生物大分子生物大分子(biomacromolecule)通常是指动物、植物和微生物在进行新陈代谢时产通常是指动物、植物和微生物在进行新陈代谢时产生生蛋白质和核酸蛋白质和核酸蛋白质和核酸蛋白质和核酸等有机化合物的总称。等有机化合物的总称。特点：具有较大的分子量、由简单的小分子排列组特点：具有较大的分子量、由简单的小分子排列组成、具有复杂的空间结构、生物大分子的生物活性成、具有复杂的空间结构、生物大分子的生物活性由结构决
2、定。由结构决定。阐明生物大分子复杂的结构及结构与功能的关系是阐明生物大分子复杂的结构及结构与功能的关系是生物学的主要任务生物学的主要任务。现在学习的是第2页，共89页在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题。生物大分子结构与功能的研究，中心课题。生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物必须首先解决生物必须首先解决生物必须首先解决生物大分子的制备问题大分子的制备问题大分子的制备问题大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度
3、的生物大分子，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。作。现在学习的是第3页，共89页生物大分子的制备有以下主要特点：生物大分子的制备有以下主要特点：与化学产品的分离制备相比较：与化学产品的分离制备相比较：蛋白质的蛋白质的组成、结构极其复杂，分子差异大组成、结构极其复杂，分子差异大组成、结构极其复杂，分子差异大组成、结构极其复杂，分子差异大导致分离、导致分离、纯化和鉴定有难度和特殊性；核酸较之要简单。纯化和鉴
4、定有难度和特殊性；核酸较之要简单。通常以通常以复合物复合物的形式存在，提取分离困难。的形式存在，提取分离困难。许多生物大分子离开了生物体环境就许多生物大分子离开了生物体环境就极易失活极易失活，因此分，因此分离过程中如何防止其失活，是生物大分子提取制备最困难之离过程中如何防止其失活，是生物大分子提取制备最困难之处。处。现在学习的是第4页，共89页许多生物大分子在生物材料中的许多生物大分子在生物材料中的含量极微含量极微含量极微含量极微，分离纯化，分离纯化的步骤繁多，流程长。的步骤繁多，流程长。生物材料的生物材料的组成极其复杂组成极其复杂组成极其复杂组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化，常常包
5、含有数百种乃至几千种化合物，方法的通用性较差合物，方法的通用性较差。正是这些特点致使蛋白质的分离纯化和分析的难度极大。正是这些特点致使蛋白质的分离纯化和分析的难度极大。正是这些特点致使蛋白质的分离纯化和分析的难度极大。正是这些特点致使蛋白质的分离纯化和分析的难度极大。现在学习的是第5页，共89页生物大分子制备的一般过程：生物大分子制备的一般过程：根据要制备的生物大分子的目的和要求，选择和处理合适根据要制备的生物大分子的目的和要求，选择和处理合适根据要制备的生物大分子的目的和要求，选择和处理合适根据要制备的生物大分子的目的和要求，选择和处理合适的材料。的材料。的材料。的材料。确立可靠的确立可靠的
6、确立可靠的确立可靠的分析测定方法分析测定方法分析测定方法分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。，这是制备生物大分子的关键。，这是制备生物大分子的关键。，这是制备生物大分子的关键。有效成分的抽提。有效成分的抽提。有效成分的抽提。有效成分的抽提。现在学习的是第6页，共89页粗品的纯化。粗品的纯化。纯品的鉴定（纯度、量）。纯品的鉴定（纯度、量）。纯品的鉴定（纯度、量）。纯品的鉴定（纯度、量）。产物的浓缩、干燥和保存。产物的浓缩、干燥和保存。产物的浓缩、干燥和保存。产物的浓缩、干燥和保存。现在学习的是第7页，共89页在水和各种有机溶剂中的在水和各种有机溶剂中的溶解性溶解性。在不同温度、在不同温度、p
7、HpH值和各种缓冲液中生物大分子的值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性稳定性稳定性稳定性。各种各种物理性质物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。料中的分配系数。首要了解生物大分子的理化性质：首要了解生物大分子的理化性质：首要了解生物大分子的理化性质：首要了解生物大分子的理化性质：现在学习的是第8页，共89页固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对
8、各其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。种化学试剂的稳定性。对其他生物分子的特殊亲和力对其他生物分子的特殊亲和力。现在学习的是第9页，共89页蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质蛋白质的两性电离和蛋白质的两性电离和等电点等电点蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收现在学习的是第10页，共89页目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和离心三大技术。电泳、层析和离心三大技术。现在学习的是第11页，共89页材料的选择与处理材料的选择与处理材
9、料的选择与处理材料的选择与处理第一节第一节第一节第一节现在学习的是第12页，共89页 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。所选用的材料主要依据所选用的材料主要依据实验目的实验目的实验目的实验目的来确定。来确定。选择的材料应选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、含量高、来源丰富、制备工艺简单、含量高、来源丰富、制备工艺简单、含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低成本低成本低成本低。一、材料的选择一、材料的选择一、材料的选择一、材料的选择现在学习的是
10、第13页，共89页有效成分有效成分：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。杂质杂质：有效成分以外的其他物质的统称。有效成分以外的其他物质的统称。现在学习的是第14页，共89页例一：例一：胰岛素的提取胰岛素的提取 含量：牛胰腺含量：牛胰腺 猪胰腺猪胰腺 来源：猪来源：猪 牛牛 成本：牛成本：牛 猪猪 综合结果：选用综合结果：选用猪胰腺猪胰腺作为材料。作为材料。现在学习的是第15页，共89页例二：酸性磷酸酶分离纯化与活性测定酸性磷酸酶分离纯化与活性测定含量：小麦的胚芽中含量高含量：小麦的胚芽中含量高现在学习的是第16页，共89页 材料尽可能保持新鲜，尽快加工处理，
11、以防有效成分材料尽可能保持新鲜，尽快加工处理，以防有效成分降解、破坏，必要时可冷冻、干燥处理。降解、破坏，必要时可冷冻、干燥处理。1 1、动物组织、动物组织、动物组织、动物组织 必须选择必须选择有效成份含量丰富有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理后在适当的溶剂中提取，如果所要求的行绞碎、脱脂等处理后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。成分在细胞内，则要先破碎细胞。二、材料的处理二、材料的处理现在学习的是第17页，共89页冰冻冰冻 -70保存备用较好保存备用较好干燥干燥干燥干燥 现在学习的是第18页，共89页2 2、植物材料
12、植物材料植物材料植物材料 必须清洗必须清洗,去壳，脱脂，并注意植物去壳，脱脂，并注意植物品种品种和和生长发生长发育状况育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。另外与季节性关系密切。如如 叶片叶片:直接洗净直接洗净 植物种子植物种子:泡胀或粉碎泡胀或粉碎 现在学习的是第19页，共89页 3 3 3 3、微生物：、微生物：、微生物：、微生物：种类多，繁殖快、培养简便、易诱变、不受种类多，繁殖快、培养简便、易诱变、不受季节的影响，是常用的材料。季节的影响，是常用的材料。应注意它的生长期。在微生物的应注意它的生长期。在微生物的对数生长期对
13、数生长期，酶和核，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况：情况：（1 1）微生物菌体）微生物菌体分泌分泌分泌分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等到培养基中的代谢产物和胞外酶等 （2 2）菌体）菌体含有含有含有含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等现在学习的是第20页，共89页另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保冷冻保存存；对于易分解的生物大分子应选用对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料新鲜材料新鲜材料新鲜材料制备制备；现在学习
14、的是第21页，共89页第二节第二节第二节第二节 确立测定方法确立测定方法确立测定方法确立测定方法现在学习的是第22页，共89页一、目的与要求一、目的与要求生物大分子的两个重要特征：极易失活和含量极微生物大分子的两个重要特征：极易失活和含量极微测定方法应该：测定方法应该：简便、灵敏、准确、快速、专一简便、灵敏、准确、快速、专一现在学习的是第23页，共89页分析测定的方法主要有两类：分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理化学的测定方法。即生物学和物理化学的测定方法。生生物物学学的的测测定定法法主主要要有有：酶酶的的各各种种测测活活方方法法、蛋蛋白白质质含含量量的的各各种种测测定定法法、免免疫疫化
15、化学学方方法法、放放射射性性同同位位素素示示踪法等；踪法等；二、常用的测定方法二、常用的测定方法现在学习的是第24页，共89页l物理、化学方法主要有：物理、化学方法主要有：比色法比色法比色法比色法、气相色谱和液相色谱、气相色谱和液相色谱法、法、光谱法光谱法光谱法光谱法（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法电泳法电泳法电泳法、以及核磁共振等。、以及核磁共振等。l实际操作中尽可能多用实际操作中尽可能多用仪器分析方法仪器分析方法仪器分析方法仪器分析方法，以使分析测定更，以使分析测定更加快速、简便。加快速、简便。现在学习的是第25页，共89页1 1、光谱法、
16、光谱法不同的生命大分子物质与相应波长的光会发生特定的不同的生命大分子物质与相应波长的光会发生特定的作用，依据作用结果可推断出被测物质的含量和部分作用，依据作用结果可推断出被测物质的含量和部分理化性质，这类测定方法为光谱法。理化性质，这类测定方法为光谱法。所需的样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛用于物质所需的样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛用于物质的含量测定。的含量测定。紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法现在学习的是第26页，共89页紫外光谱法紫外光谱法利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性质而建利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性质
17、而建立的一种方法。将一定浓度的待测物溶液，通过某一立的一种方法。将一定浓度的待测物溶液，通过某一特定波长的紫外分光光度计，测定此溶液的消光值即特定波长的紫外分光光度计，测定此溶液的消光值即可换算出待测物的浓度。可换算出待测物的浓度。1.测定核酸含量测定核酸含量2.测定蛋白质的含量及纯度测定蛋白质的含量及纯度现在学习的是第27页，共89页芳芳香香族族氨氨基基酸酸的的紫紫外外吸吸收收现在学习的是第28页，共89页l测定核酸测定核酸 蛋白质的含量蛋白质的含量:ODOD260260=1.0=1.0相当于相当于 5050g/mlg/ml双链双链DNADNA 40 40g/mlg/ml单链单链DNADNA
18、（或（或RNARNA）2020g/mlg/ml寡核苷酸寡核苷酸l测定核酸测定核酸 蛋白质的纯度蛋白质的纯度:DNA DNA纯品纯品:OD:OD260260/OD/OD280280=1.8=1.8 RNA RNA纯品纯品:OD:OD260260/OD/OD280280=2.0=2.0现在学习的是第29页，共89页可见光光谱法可见光光谱法有色物质溶液的颜色与其浓度有关。溶液的浓度越有色物质溶液的颜色与其浓度有关。溶液的浓度越大，颜色越深。利用光学比较溶液颜色的深度，可大，颜色越深。利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定溶液的浓度。以测定溶液的浓度。可见光光谱法是基于可见光光谱法是基于有色溶液对光的选
19、择性吸收有色溶液对光的选择性吸收而建而建立起来的一种分析方法。将待测物与相关试剂或酶作立起来的一种分析方法。将待测物与相关试剂或酶作用后的有色产物置于相应的可见光波长下，即测定其用后的有色产物置于相应的可见光波长下，即测定其消光值消光值。现在学习的是第30页，共89页例如：测定某一蛋白质溶液的浓度例如：测定某一蛋白质溶液的浓度 方法：蛋白质与相关试剂（如方法：蛋白质与相关试剂（如双缩脲试剂双缩脲试剂）作用后产生）作用后产生特定颜色的物质（特定颜色的物质（紫色络合物紫色络合物紫色络合物紫色络合物），紫色络合物颜色的），紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，于波长深浅与蛋白质浓度成正比，于波长5
20、40nm540nm处进行比色测处进行比色测定。定。最后与标准品比对即可计算出该待测蛋白质溶液的浓最后与标准品比对即可计算出该待测蛋白质溶液的浓度度现在学习的是第31页，共89页现在学习的是第32页，共89页 利用有些生命大分利用有些生命大分子物质自身可以吸收特子物质自身可以吸收特定光波的能量后，发出定光波的能量后，发出荧光的特性而建立的一荧光的特性而建立的一种方法。种方法。精确性精确性精确性精确性重复性重复性重复性重复性灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度比吸收光谱法好比吸收光谱法好比吸收光谱法好比吸收光谱法好荧光光谱法荧光光谱法现在学习的是第33页，共89页浊度法浊度法主要用于悬浮液的测定。主要用于悬浮
21、液的测定。测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。不被吸收，主要是不被吸收，主要是散射、反射。散射、反射。现在学习的是第34页，共89页光谱法光谱法电化学法电化学法生物活性检测法生物活性检测法免疫分析法免疫分析法生物传感器生物传感器吸收光谱吸收光谱吸收光谱吸收光谱法法法法荧光法荧光法荧光法荧光法浊度法浊度法浊度法浊度法直接测定法直接测定法直接测定法直接测定法比色法比色法比色法比色法现在学习的是第35页，共89页第三节第三节第三节第三节细胞的破碎细胞的破碎细胞的破碎细胞的破碎现在学习的是第36页，共89页不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其不同
22、的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。采取专门的细胞破碎方法。现在学习的是第37页，共89页一、机械破碎一、机械破碎1.1.研磨法：研磨法：将剪碎的将剪碎的动物组织置于研钵动物组织置于研钵或匀浆器中，加入或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或少量石英砂研磨或匀浆。匀浆。现在学习的是第38页，共89页2.2.
23、组织捣碎器法：组织捣碎器法：组织捣碎器法：组织捣碎器法：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min10000r/min20000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎机的内刀式组织捣碎机(即高速即高速分散器分散器)将组织的细胞打碎。将组织的细胞打碎。注意注意温度温度的影响的影响现在学习的是第39页，共89页二、物理法：二、物理法：1.1.1.1.超声波法：超声波法：超声波法：超声波法：此法是此法是借助超声波的振动力借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎细
24、胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长久母菌时，时间要长久一些。一些。现在学习的是第40页，共89页2.2.2.2.压榨法：压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在在1.77101.77108 8PaPa3.54103.54108 8Pa Pa 的高压下使细胞悬液的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。现在学习的是第41页，共89页3.3.3.3.冻融法：冻融法：冻融法：冻融法：将待破碎的细胞冷至将待破碎的细胞冷至1515到到2020，然后放，然后放于室温于室
25、温(或或40)40)迅速融化，如此反复冻融多次，由迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。细胞溶胀破碎。现在学习的是第42页，共89页三、化学与生物化学方法：三、化学与生物化学方法：1.1.1.1.自自自自溶溶溶溶法法法法：将将新新鲜鲜的的生生物物材材料料存存放放于于一一定定的的pHpH和和适适当当的的温温度度下下，细细胞胞结结构构在在自自身身所所具具有有的的各各种种水水解解酶酶（如如蛋蛋白白酶酶和和酯酯酶酶等等）的的作作用用下下发发生生溶溶解解，使使细细胞胞内含物释放出来。内含物释放出来。2.2.溶溶
26、溶溶胀胀胀胀法法法法：细细胞胞膜膜为为天天然然的的半半透透膜膜，在在低低渗渗溶溶液液和和低低浓浓度度的的稀稀盐盐溶溶液液中中，由由于于存存在在渗渗透透压压差差，溶溶剂剂分分子子大大量量进进入入细细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。现在学习的是第43页，共89页3.3.3.3.有机溶剂处理法：有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或剂或SDSSDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与
27、研磨法联合使用。使用。4.4.酶解法：酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于酶和酯酶等，于3737，pH8pH8，处理，处理1515分钟，可以专一性地分钟，可以专一性地将细胞壁分解。将细胞壁分解。现在学习的是第44页，共89页第四节第四节第四节第四节抽抽抽抽 提提提提现在学习的是第45页，共89页一、抽提一、抽提抽提：抽提：指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。离出来的过程。是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶
28、剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保保保保持原来的天然状态不丢失生物活性持原来的天然状态不丢失生物活性持原来的天然状态不丢失生物活性持原来的天然状态不丢失生物活性。现在学习的是第46页，共89页提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。持其生物活性。影响提取的因素主要有：影响提取的因素主要有：影响提取的因素主要有：影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；由固相扩散到液相的难易；溶
29、剂的溶剂的pHpH值和提取时间等。值和提取时间等。现在学习的是第47页，共89页二、抽提有效成分的影响因子二、抽提有效成分的影响因子稀盐溶液和缓冲液稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。剂。现在学习的是第48页，共89页1)pH1)pH值：值：蛋白质、酶与核酸的蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与溶解度和稳定性与溶解度和稳定性与溶解度和稳定性与pHpH值值有关。过有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=68范围内，范围内，提取溶剂的提取溶剂的pHpH应在蛋白质和酶的
30、稳定范围内，通常选应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。远离等电点的择偏离等电点的两侧。远离等电点的pH值，值，溶解度增溶解度增加。加。通常，碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性通常，碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂。溶剂。现在学习的是第49页，共89页2)2)溶剂的极性和离子强度：溶剂的极性和离子强度：l离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。有些蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中有较大的有些蛋白质和酶，在低
31、离子强度的溶液中有较大的溶解度，溶解度，l如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为时大大增加，称为“盐溶盐溶盐溶盐溶”现象。现象。现在学习的是第50页，共89页为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低；增加离向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低；增加离子强度（如加入子强度（如加入KClKCl、NaClNaCl、NH4ClNH4Cl或或(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4）可以）可以增加溶液的极性。增加溶液的极性。通常，极性物
32、质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于通常，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂。非极性溶剂。相似相溶相似相溶现在学习的是第51页，共89页3)3)水解酶：水解酶：无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少。解，导致天然物质量的减少。加入抑制剂或调节提取液的加入抑制剂或调节提取液的pHpH、离子强度或极性等方法使、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白
33、质、酶及核酸的降解作用。及核酸的降解作用。现在学习的是第52页，共89页 加入二异丙基氟磷酸（加入二异丙基氟磷酸（DFPDFP）可以抑制或减慢自溶作用；）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性；水解酶的活性；加入苯甲磺酰氟化物（加入苯甲磺酰氟化物（PMSFPMSF）也能清除蛋白水解酶活）也能清除蛋白水解酶活力；力；还可通过选择还可通过选择pHpH、温度或离子强度等，使这些条件都、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。要适合于目的物质的提取。现在学习的是第53页，共89页4)4)温度：温度：
34、为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在取时一般在0055的低温操作。的低温操作。温度升高，溶解度加大温度升高，溶解度加大。现在学习的是第54页，共89页5)5)搅拌：搅拌：搅搅拌拌能能促促使使被被提提取取物物的的溶溶解解，一一般般采采用用温温和和搅搅拌拌为为宜宜，速速度度太太快快容容易易产产生生大大量量泡泡沫沫，增增大大了了与与空空气气的的接接触触面面，会引起酶等物质的变性失活。会引起酶等物质的变性失活。现在学习的是第55页，共89页6)6)氧化：氧化：因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常因为一般蛋白质都含有相当数量的巯
35、基，有些巯基常常是活性部位的必需基团。常是活性部位的必需基团。若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止防止巯基氧化巯基氧化巯基氧化巯基氧化。还有金属离子、提取液的比例等因素还有金属离子、提取液的比例等因素现在学习的是第56页，共89页第五节第五节第五节第五节浓浓浓浓 缩缩缩缩现在学习的是第57页，共89页1.1.沉淀法沉淀法:沉淀沉淀是溶液中的溶质由液相变成
36、固相析出的过程。是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉沉淀淀法法（即即溶溶解解度度法法）操操作作简简便便，成成本本低低廉廉，不不仅仅用用于于实实验验室室中中，也也用用于于某某些些生生产产目目的的的的制制备备过过程程，是是分分离离纯纯化化生生物物大大分分子子，特特特特别别别别是是是是制制制制备备备备蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质和和和和酶酶酶酶时时时时最最最最常常常常用用用用的的的的方方方方法法法法。通通过过沉沉淀淀，将将目目的的生生物物大大分分子子转转入入固固相相沉沉淀淀或或留留在在液液相相，而与杂质得到初步的分离。而与杂质得到初步的分离。现在学习的是第58页，共89页2.2.吸咐法吸咐法:通通
37、过过吸吸咐咐剂剂直直接接收收除除去去溶溶液液中中溶溶液液分分子子使使之之浓浓缩缩所所用用的的吸吸咐咐剂剂必必需需与与溶溶液液不不起起化化学学反反应应，对对生生物物大大分分子子不不吸附，易与溶液分开。吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等。凝胶等。现在学习的是第59页，共89页3.3.超滤超滤:超超超超滤滤滤滤法法法法是是使使用用一一种种特特别别的的薄薄膜膜对对溶溶液液中中各各种种溶溶质质分分子子进进行行选选选选择择择择性性性性过过过过滤滤滤滤的的方方法法，液液体体在在一一定定压压力力下下（氮氮气气压压或或真真空空泵泵压
38、压）通通过过膜膜时时，溶溶剂剂和和小小分分子子透透过过，大大分分子子受阻保留。受阻保留。最最适适于于生生物物大大分分子子尤尤其其是是蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质和和和和酶酶酶酶的的的的浓浓浓浓缩缩缩缩或或或或脱脱脱脱盐盐盐盐，并并具具有有成成本本低低，操操作作方方便便，条条件件温温和和，能能较较好好地地保保持持生物大分子的活性，回收率高等优点。生物大分子的活性，回收率高等优点。现在学习的是第60页，共89页 关关键键在在于于膜膜膜膜的的的的选选选选择择择择，不不同同类类型型和和规规格格的的膜膜，水水的的流流速速，分分分分子子子子量量量量截截截截止止止止值值值值（即即大大体体上上能能被被膜膜保保留留
39、分分子子最最小小分分子子量量值值）等等参参数数均均不不同同，必必须须根根据据工工作作需需要来选用。要来选用。现在学习的是第61页，共89页4.4.透析法透析法:在在生生物物大大分分子子的的制制备备过过程程中中，除除盐盐、除除少少量量有有机机溶溶剂剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。等都要用到透析的技术。透析只需要使用透析只需要使用专用的半透膜即可专用的半透膜即可完成。保留在透完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液保留液”，袋（膜），袋（膜）外的溶液称为外的溶液称为“渗出液渗出液”或或“透析液透析液”。截留分子
40、量。截留分子量通常为通常为1 1万左右。万左右。现在学习的是第62页，共89页半半透透膜膜阻阻留留蛋蛋白白质质分分子子，而而让让小小的的溶溶质质分分子子和和水水通通过过，以以达达到到除除去去蛋蛋白白质质溶溶液液中中小小分分子子（盐盐、低低分分子子酸酸等等）。现在学习的是第63页，共89页5.5.蒸馏法蒸馏法:减压加温蒸发浓缩减压加温蒸发浓缩:通过降低液面压力使液体沸点降通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些愈快，此法适用于一些不耐热不耐热不耐热不耐热的生物大分子的浓缩。的生物大分子的浓缩。现在学习
41、的是第64页，共89页6.6.空气流动蒸发浓缩空气流动蒸发浓缩:空气的流动可使液体加速蒸发空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂蒸发，而达到浓缩目的，此法浓吹风，使透过膜外的溶剂蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。现在学习的是第65页，共89页7.7.冰冻干燥法冰冻干燥法:生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于
42、保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻真空干燥常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻真空干燥,适适用于用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存。现在学习的是第66页，共89页 在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类适用于各类生物大分子的干燥保存
43、。生物大分子的干燥保存。现在学习的是第67页，共89页现在学习的是第68页，共89页第六节第六节第六节第六节纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价现在学习的是第69页，共89页由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一不可能有一不可能有一不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，个适合于各类分子的固定的分离程序，个适合于各类分子的固定的分离程序，个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作但多数分离工作关键部分的基本手段是相
44、同的。关键部分的基本手段是相同的。为为了了避避免免盲盲目目性性，节节省省实实验验探探索索时时间间，要要认认真真参参考考和和借鉴前人的经验，少走弯路。借鉴前人的经验，少走弯路。现在学习的是第70页，共89页1.1.1.1.分离纯化方法的选择分离纯化方法的选择分离纯化方法的选择分离纯化方法的选择 制备生物大分子的方法分类如下：制备生物大分子的方法分类如下：以分子大小和形态的差异为依据的方法：以分子大小和形态的差异为依据的方法：以分子大小和形态的差异为依据的方法：以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。以溶解度的差异
45、为依据的方法：以溶解度的差异为依据的方法：以溶解度的差异为依据的方法：以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。选择性沉淀和结晶等。一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计现在学习的是第71页，共89页以电荷差异为依据的方法：以电荷差异为依据的方法：以电荷差异为依据的方法：以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。吸附层析和离子交换层析等。以生物学功能专一性为依据的方法：以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。亲和层析等。现在学习的是第72页，共89
46、页切忌！切忌！切忌！切忌！重复使用同一种分离纯化方法。重复使用同一种分离纯化方法。重复使用同一种分离纯化方法。重复使用同一种分离纯化方法。现在学习的是第73页，共89页分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。少工序，提高效率。2.2.2.2.分离纯化方法的排布分离纯化方法的排布分离纯化方法的排布分离纯化方法的排布:现在学习的是第74页，共89页早期分离纯化早期分离纯化早期分离纯化早期分离纯化 1)1)特点：特点：粗提取液中物质成份十分复杂粗提取液中物质成份十分复杂;欲制备的生物大分子浓度很稀欲制备的生物大分子浓度很稀;物理化
47、学性质相近的物质很多物理化学性质相近的物质很多;希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质杂质;现在学习的是第75页，共89页2)2)对所选方法的要求：对所选方法的要求：要快速、粗放要快速、粗放;能较大地缩小体积能较大地缩小体积;分辨力不必太高分辨力不必太高;负荷能力要大负荷能力要大;现在学习的是第76页，共89页3)3)可选用的方法：可选用的方法：吸附；吸附；萃取；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸附、胖柱交换）、亲和层析。离子交换（批量吸附、胖柱交换）、亲和层析。现在学
48、习的是第77页，共89页 晚期分离纯化：晚期分离纯化：晚期分离纯化：晚期分离纯化：分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，并尽可能在低温下连续、紧凑，并尽可能在低温下连续、紧凑，并尽可能在低温下连续、紧凑，并尽可能在低温下（如在冷室中）进行。（如在冷室中）进行。现在学习的是第78页，共89页可选用的方法：可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制
49、备等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。等。现在学习的是第79页，共89页每一步都要进行测定每一步都要进行测定 有效成分的含量；有效成分的含量；有效成分的含量；有效成分的含量；比活力；比活力；比活力；比活力；(活力单位数活力单位数/毫克蛋白毫克蛋白)纯化倍数；纯化倍数；(每步的比活力每步的比活力/粗抽提液比活力）粗抽提液比活力）收得率；收得率；收得率；收得率；(每步的总活力每步的总活力/粗抽提液总活力）粗抽提液总活力）二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价现在学习的是第80页，共89页步骤总蛋白/g总活性/U比活性/（U/mg）纯化倍数收得率%1.粗抽体液 30.
50、0 21000 0.7 1.0 100 2.氯化锰处理 7.64 15017 2.0 2.8 723.冰冻融解 5.58 14872 2.7 3.8 71 4.DEAE-纤维素层析 0.113 5025 44.5 63.5 245.硫酸铵盐析 0.048 3367 71.7 102.0 17 6.羟基磷灰石柱层析 0.016 3133 200.0 286.0 15 7.聚丙烯酰胺凝胶电泳 0.012 3100 255.0 365.0 15 现在学习的是第81页，共89页第七节第七节第七节第七节有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析现在学