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1、青霉素发发酵效价价的生物物学测定定一、实验验目的1、了解解青霉素素作用的的机理2、了解解青霉素素效价的的生物学学测定的的原理3、掌握握管碟法法测量抗抗生素效效价的方方法4、掌握握青霉素素摇瓶培培养的操操作流程程二、实验验原理（一）、青青霉素及及作用的的机理1. 抗生素：是某些些微生物物在其代代谢过程程中所产产生的，能能抑制或或杀灭其其他病原原微生物物的化学学物质；是细菌菌、真菌菌、放线线菌等微微生物的的代谢产产物。主主要从微微生物的的培养液液中提取取，能杀杀死或抑抑制其他他病原微微生物。n 在低浓度度即可对对某些生生物的生生命活动动有特异异一直作作用的化化学物质质的总称称。2. 青青霉素n 天
2、然青霉霉素系从从青霉菌菌的培养养液中提提取获得得，主要要含有：青霉素素F、GG、X、KK和双氢氢F五种种。其中中以青霉霉素G(又名苄苄青霉素素)的作作用最强强，性质质较稳定定，产量量亦较高高。青霉素GG的结构构：青霉素钾钾、钠的的结构：青霉素钾钾盐、钠钠盐的性性质：n 遇酸、碱碱或氧化化剂等迅迅速失效效。有引引湿性；在水中中极易溶溶解，乙乙醇中溶溶解，在在脂肪油油或液状状石蜡中中不溶。n 水溶液在在室温放放置易失失效；220万IU/ml青青霉素溶溶液于330 放置244h，效效价下降降 566%，青青霉烯酸酸含量增增加2000倍，临临床应用用时要新新鲜配制制。（所所以只有有粉制剂剂，没有有注射
3、液液，用时时用注射射用水稀稀释；如如使用不不完，放放置不要要过久）。3. 青青霉素作作用机理理 使细菌细细胞壁缺缺损(黏黏肽)，菌菌体内的的高渗透透压使细细胞外面面的水分分不断地地渗入菌菌体内，引引起菌体体膨胀变变形，加加上激活活自溶酶酶，使细细菌裂解解而死亡亡.G+(二)青青霉素效效价的生生物学测测定的原原理1.效价价:是评评价抗生生素效能能的标准准，也是是衡量抗抗生素活活性成分分含量的的尺度微生物鉴鉴定法：以抗生生素对微微生物的的杀伤力力或抑制制程度为指指标来衡衡量抗生生素效价价的方法法理化方法法：根据据抗生素素的结构构特点，利利用其特特有的化化学或物理理性质及及反应而而进行的的抗生素活活
4、性表示示方法：抗生素素的活性性以效价价单位来来表示;每mll或每mmg中含含有某种种抗生素素的有效效成分的的多少，用用单位uu表示一个青霉霉素效价价单位：能在550mLL肉汤培培养基中中完全抑抑制金黄黄色葡萄萄球菌发发育的最最小青霉霉素剂量量;以IU表示示1mg青青霉素GG钠盐定定为16667单单位；11mg青青霉素GG钾盐为为15995单位位(三) 管碟法法测量抗抗生素效效价的方方法1.利用用抗生素素在培养养基内的的扩散渗渗透作用用，将已已知效价价的标准准品溶液液与未知知效价的的被检品品溶液在在同样条条件下加加入已放放置在含含有高度度敏感性性的试验验菌的培培养基上上的小管管内2.培养养后，在
5、在抗生素素扩散到到达的适适当范围围内，产产生了透透明的抑抑菌圈。不不同浓度度的抗生生素，抑抑菌圈的的大小不不同；比比较标准准品与检检品的抑抑菌圈大大小，利利用不同同的计算算原理，就就可以推推算出此此抗菌素素的效价价(四)青青霉素摇摇瓶培养养的操作作流程1.菌种种活化:从保藏藏菌种接接种到灭灭菌的斜斜面培养养基中,25培养66-7天天;待斜斜面上长长满菌苔苔后作为为以及菌菌种制备备的起始始菌株2.一级级斜面菌菌种制作作:从起起始菌株株斜面接接种到灭灭菌的斜斜面培养养基, 25培养66-7天天,如无无杂菌污污染及为为一级斜斜面菌种种3.摇瓶瓶培养:从一级级斜面菌菌株接种种到三角角瓶液体体培养基基,
6、 225、2000rppm培养养6-77天,可可进行青青霉素的的效价测测定等4.发酵酵罐培养养:流程：冷冷冻管 斜面母母瓶（11）大米孢孢子（2）一级种种子罐（3 ） 二级级种子罐罐（4） 发酵酵罐（5）放罐 至提提炼各步所需需培养条条件：1. 225，677天；2. 225，677天；3. 225，400455h，11：2VVVM(每分钟钟通气体体积比) 4. 225， 113115h，1：1.5VVVM;5. 222-226，677天，11：10.88VVMM。三. 实实验材料料1.菌种种n 产黄青霉霉菌(PPenttcillliuum cchryysoggenuum)n 金黄色葡葡萄球菌
7、菌(Sttaphhylooco ccuusauuoreeus)2.药品品n 青霉素钠钠n 0.2mmol/L ppH 66.0磷磷酸缓冲冲液n 0.855%生理理盐水n 发酵培养养基n 生物测定定培养基基3.仪器器及器皿皿 移移液枪 无菌枪枪头 接接种环 酒精灯灯 烧杯杯 培养养皿 滴滴管 试试管 超超净工作作台等四. 操操作步骤骤1.发酵酵培养基基的配制制:按照配配方配制制液体培培养基，250ml三角瓶装液量为100ml。2.摇瓶瓶培养:从一级级斜面菌菌株接种种到三角角瓶液体体培养基基, 225、2000rppm培养养6-77天,可可进行青青霉素的的效价测测定3. 青青霉素标标准溶液液的配制
8、制:准确确称取纯纯苄青霉霉素钠00.066g,溶溶解在ppH 66.0的的磷酸缓缓冲液, 配成成1000ml 10000单位位/mll的青霉霉素标准准工作液液.按下下表加入入青霉素素标准溶溶液1mg青青霉素GG钠盐定定为16667单单位10000/16667 mmg = 0. 6mmg 10000单位位100mml 110000单位/mml 1000*00.6mmg=00.066g称取0.06gg苄青霉霉素钠溶溶于1000mll的磷酸酸缓冲液液不同浓度度青霉素素标品溶溶液的配配制试管号青霉素浓浓度(单位/ml) 10000单位/mml青霉霉素溶液液(mll) pH 66.0磷磷酸缓冲冲液(mm
9、l) 1100192200283300374400465500554.金黄黄色葡萄萄球菌菌菌悬液的的制备n 将37培养116-118h的的斜面菌菌种,用用0.885%的的生理盐盐水洗下下,离心心沉淀(30000rppm*55minn),倾倾去上清清液,沉沉淀菌体体再用生生理盐水水离心洗洗涤1-2次n 再将其稀稀释至一一定浓度度(约1109个个/mll，或用用分光光光度计在在波长6650nnm测透透光率为为20%左右即即可)。5、生测测平板的的制备n 配制生测测培养基基5000ml，灭灭菌后冷冷却至550，每110mll加入适适当稀释释的金黄黄色葡萄萄球菌00.3mml（115mll），充充分混
10、匀匀；在超超净台中中倒平板板n 注意：实实验中加加菌体的的量要控控制在使使10单单位/mml青霉霉素溶液液的抑菌菌圈直径径在200244mm之之间。6. 青青霉素标标准曲线线的绘制制n 生测培养养基平板板完全凝凝固后，在在每个琼琼脂平板板上轻轻轻放置牛牛津杯22个，小小杯之间间的距离离要均匀匀。然后后用移液液枪加入入不同浓浓度的青青霉素标标准溶液液，2000ull/牛津津杯。每每个青霉霉素浓度度做3个个平行平平皿n 加入标准准青霉素素溶液后后，将平平皿移至至37培养箱箱中培养养1824hh，移去去牛津杯杯。精确确测定抑抑菌圈的的直径大大小。在坐标纸纸上,以青霉霉素浓度度为纵坐坐标,以抑菌菌圈直
11、径径的校正正值为横横坐标，绘绘制标准准曲线7. 青青霉素发发酵液效效价的测测定n 根据发酵酵时间用用1% pH 6.00的磷酸酸缓冲液液将发酵酵液适当当稀释.每个被被测样品品用3套套平皿进进行测定定.青霉霉素标准准液(11单位/ml)与待测测样品的的稀释液液间隔的的加入小小管内.37培养118-224h后后,量取取抑菌圈圈直径的的大小8.青霉霉素效价价的计算算:n 将青霉素素标准液液(100单位/ml)的抑菌菌圈直径径进行校校正,取取得校正正值;将将此校正正值校正正待测样样品的抑抑菌圈直直径;在在标准曲曲线上根根据校正正后的抑抑菌圈直直径查得得待测稀稀释液的的青霉素素效价;根据稀稀释度得得到发
12、酵酵液的青青霉素效效价五、试验验结果1.不同同浓度青青霉素标标品的抑抑菌圈直直径及相相应的标标准曲线线不同浓度度青霉素素标品的的抑菌圈圈直径青霉素浓浓度（单单位每毫毫升）100200300400500600每组抑菌菌圈平均均直径（毫毫米）15.2216.3317.8818.8819.22202.据上上面标准准曲线的的方程yy=0.00996x+14.5133(R22=0.96775),计算出出发酵液液的青霉霉素效价价为发酵时间间（天）样品稀释释液抑菌菌圈直径径（毫米米）效价（单单位毫升）发酵液稀稀释倍数数发酵液效效价718.444051405715.771131113715.3382182注：由于于实验过过程中使使用的是是原液，因因此稀释释倍数为为一9