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1、实验篇实验一 细胞胞的形态态观察及及其大小小测量【实验目目的】1、通过过对原核核和真核核各种形形态细胞胞的光学学显微镜镜观察，了了解细胞胞的形态态及其显显微结构构；2、学习习显微测测量的方方法，对对细胞的的大小有有一直观观认识。【实验用用品】普通光学学显微镜镜;目镜镜测微尺尺;镜台台测微尺尺;载玻玻片;盖盖玻片等等。【实验材材料】小白鼠肝肝细胞切切片;鸡鸡血红细细胞;蚕蚕豆叶片片横切片片;洋葱葱。【实验内内容和方方法】(一)细细胞形态态观察l、动物物细胞的的观察（1）人人肝细胞胞切片：在显微微镜下仔仔细观察察肝细胞胞的形态态构造。注注意肝细细胞之间间的界限限、细胞胞的形状状、细胞胞核的形形状和
2、数数量、核核仁的形形状和数数量、细细胞质的的形态构构造以及及细胞质质和细胞胞核染色色的区别别。（2）鸡鸡血细胞胞涂片的的观察：注意观观察血细细胞的组组成；红红细胞、白白细胞、血血小板的的形态特特点。2、植物物细胞的的观察（1）取取蚕豆叶叶片横切切片的观观察：注注意表皮皮细胞和和叶肉细细胞的基基本结构构。（2）洋洋葱表皮皮细胞的的形态观观察：用用镊子撕撕取洋葱葱表皮，滴滴一滴蒸蒸馏水，盖盖上盖玻玻片。在在显微镜镜下观察察的形态态和结构构。（二）细细胞的大大小和测测量1、测微微尺的使使用目镜测微微尺是一一块圆形形玻片，中中心刻有有一尺，长长5110mmm，分成成501000格。每每格的实实际长度度
3、因不同同物镜的的放大率率和不同同镜筒长长度而异异。镜台台测微尺尺是在一一块载玻玻片中央央，用树树胶封固固一圆形形的测微微尺，长长1mmm或2mmm，分成成1000格或2200格格，每格格的实际际长度00.011mm(10m)。当当用目镜镜测微尺尺来测量量细胞的的大小时时，必须须先用镜镜台测微微尺核实实目镜测测微尺每每一格的的长度。方方法如下下：(1)卸卸下目镜镜的上透透镜，将将目镜测测微尺刻刻度向下下装在目目镜的焦焦平面上上，再旋旋上目镜镜的上透透镜。(2)将将镜台测测微尺刻刻度向上上放在镜镜台上夹夹好，使使测微尺尺分度位位于视野野中央。调调焦至能能看清镜镜台测微微尺的分分度。(3)小小心移动
4、动镜台测测微尺和和转动目目镜测微微尺(如如目镜测测微尺分分度模糊糊，可转转动目镜镜上透镜镜进行调调焦)，使使两尺左左边的一一直线重重合，然然后由左左向右找找出两尺尺另一次次重合的的直线(如图所所示)。(4)记记录两条条重合线线间目镜镜测微尺尺和镜台台测微尺尺的格数数。按下下式计算算目镜测测微尺每每格等于于多少m： 0123测定目镜镜测微尺尺每格实实长的图图解上尺：目目镜测微微尺；下下尺：镜镜台测微微尺镜台测微微尺的格格数 目镜镜测微尺尺每格的的微米数数= 10 目目镜测微微尺的格格数例如，图图中镜台台测微尺尺1格=目镜测测微尺66格，代代入公式式得：目镜测微微尺每格格=1610m=11.666
5、m (5)取下镜镜台测微微尺，换换上需要要测量的的玻片标标本，用用目镜测测微尺测测量标本本。2、计算算：根据据测量结结果计算算各种细细胞及细细胞核的的体积。椭球形：V=44ab223 a-长长半径 b-短半径径圆球形：V=443r3 r-半径圆柱形：V=r2hh rr-半径径 h-高【作业与与思考】1、血细细胞分为为哪几大大类？分分别描述述你看到到的不同同血细胞胞的形态态，并阐阐述其功功能。绘绘图。2、任意意选择你你所看到到的动物物细胞和和植物细细胞各一一个，绘绘图并进进行适当当标注，测测量其大大小，并并比较动动植物细细胞大小小的差异异。3、在不不同的放放大倍数数下，所所测得的的细胞大大小一致
6、致吗？你你认为在在哪个放放大倍数数下测定定得比较较准确？为什么么？实验二 PAAS（Perrioddic Aciid SSchiiff）反应显示糖原和其它多多糖物质质【实验目目的】1、熟悉悉PASS法原理理及操作作步骤；2、观察察PASS反应的的染色结结果，并并观察多多糖在组组织细胞胞中的分分布。【实验原原理】多糖(ppolyysaccchaaridde)是是由多个个单糖分分子缩合合脱水而而生成的的化合物物。广泛泛分布于于动、植植物界。一一些不溶溶性的多多糖构成成植物和和动物的的骨架，如如植物的的纤维素素和动物物的甲壳壳素，一一般称为为结构多多糖。另另一些多多糖在生生物体内内作为能能量贮存存，
7、如淀淀粉（植植物）和和糖元（动动物），在在需要时时可以通通过生物物体内酶酶系统的的作用分分解，释释放出单单糖。还还有许多多多糖具具有更复复杂多样样的生理理功能，如如粘多糖糖、血型型物质等等，它们们在生物物体内起起着重要要的作用用。淀粉粉和糖原原均由DD葡萄萄糖的分分支或直直链组成成，过碘碘酸是一一种强氧氧化剂，能能将葡萄萄糖中的的乙二醇醇基(CCHOHH-CHHOH)氧化成成两个游游离的醛醛基(-GHOO)，游游离醛基基与Scchifff试剂剂反应生生成紫红红色产物物。【实验用用品】(一)试试剂：1、过碘碘酸酒精精溶液：取过碘碘酸（HHIO442H2O）0.4g溶溶于355 m11纯酒精精中
8、，加加入5 m1 的0.2M醋醋酸钠（醋醋酸钠22.722g溶于于1000 m11蒸馏水水中），再再加入115mll蒸馏水水。溶液液配好后后保存在在04的冰箱箱内，并并加黑纸纸保存，此此液如显显黄色即即失效。2.Scchifff试剂剂：将00.5 g碱性性品红加加入1000m11煮沸的的蒸馏水水中，时时时摇荡荡玻璃瓶瓶或者搅搅拌，煮煮5miin，使使之充分分溶解；然后冷冷却至550时过滤滤到具有有玻塞的的棕色试试剂瓶，加加入100ml的的lmoolLL的HCCl，冷冷却至225时加入入0.55g偏重重亚硫酸酸钠，在在室温黑黑暗条件件下静置置24hh，其颜颜色呈褐褐色或淡淡黄色，加加活性炭炭0.
9、55g剧烈烈振荡摇摇匀1mmin；过滤，滤滤液为无无色。置置棕色瓶瓶密封，外外包黑纸纸，4保存。本本试剂可可提前一一天准备备，此液液必需保保持清澈澈透明、无无色也无无沉淀，容容器要小小，装满满后仅留留很小的的空隙，其其中不应应有任何何氧化剂剂，不要要过长时时间暴露露在空气气中。如如有白色色沉淀就就不能再再用，如如颜色变变红可以以加入少少许偏重重亚硫酸酸钠，使使其再转转变为无无色就可可以再用用。3、亚硫硫酸水溶溶液：取取10偏重亚亚硫酸钠钠Na22S2O5（或KK2S2O5）200ml、11mmoolL-1 HHCl 20mml和4400mml纯水水混匀即即可。此此液使用用前配制制，否则则会因S
10、SO2逸逸出失效效。（此此液中所所用的偏偏重亚硫硫酸钠或或钾要与与Schhifff试剂中中所用的的相同）：4、苏木木精溶液液常用的的有5种种，其中中德拉菲菲氏苏木木精染液液(Deelaffielld 苏苏木精染染液)配配法如下下:甲液（苏苏木精55g、无无水乙醇醇30mml）乙液（铵铵矾，即即硫酸铝铝铵饱和和水溶液液：比例例为1gg硫酸铝铝：111ml水水，用时时配1110mll,取1100mml）丙液（甘甘油1225mll、甲醇醇1255ml）。配法如下下：1.将甲液液一滴一一滴地加加入乙液液中，并并随时用用玻璃棒棒搅动；2.然然后暴露露于阳光光和空气气中约11周到110天；3.加加入丙液液
11、；4.将混合合液静置置2个月月至颜色色变深为为止（可可过滤），此此液成熟熟后须置置于阴冷冷处塞紧紧瓶口，可可长期保保存使用用，使用用时可将将染剂11份用335份份蒸馏水水稀释，则则染色后后分化更更明显。、梯度度乙醇溶溶液：1100，955，990，880，770，550各各两份。一一份用于于脱腊复复水，一一份用于于脱水。二甲甲苯7、1000%乙乙醇+二二甲苯（11：1）（二)）用具：载玻片 、盖玻玻片、染染色缸、显显微镜 、小烧烧杯、胶胶头滴管管、镊子子、刀片片 （三）材材料：土豆；小小鼠肝细细胞石蜡蜡切片【实验步步骤】（一）土土豆切片片的观察察制作土豆豆徒手切切片 过碘碘酸处理理1530mm
12、in 700%乙醇醇 1mmin scchifff试剂剂 155 miin 亚硫硫酸水漂漂洗23次 蒸馏馏水漂洗洗 镜检检（二）小小鼠肝细细胞切片片的观察察取鼠鼠肝石蜡蜡切片 二甲甲苯脱蜡蜡约100minn 二甲甲苯+1100%乙醇（33 miin）梯度乙乙醇脱二二甲苯，在在各浓度度乙醇（1100，955，990，880，770，550）中中约23 mmin 过碘碘酸 氧氧化155300 miin 蒸馏水水漂洗 Scchifff试剂剂1530 minn 亚硫酸酸水漂洗洗233次 蒸馏水水漂洗 苏木木精染色色10 minn 流水水冲洗梯度乙乙醇脱水水（500，770，880，990，995，11
13、00），在在各乙醇醇浓度中中约23 mmin 1000%乙醇醇+二甲甲苯23 mmin二甲苯苯适度透透明 指甲甲油封片片 镜检检【作业与与思考】1、 为为所观察察到的土土豆切片片和鼠肝肝切片绘绘图，标标注其多多糖的位位置，并并描述这这两种细细胞的多多糖分布布特点。2、影响响PASS反应染染色效果果的关键键步骤是是什么？3、如何何制作徒徒手切片片？应注注意什么么才能得得到薄而而均匀的的切片？锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。【注意事事项】1.过碘碘酸氧化化作用时时间稍长长，会使使反应更更加充分分。2.Scchifff试剂剂作用时时间略长长，会使使染色效效果明显显，但过过长将导导致染色色太深
14、，也也不利于于观察。3.二甲甲苯溶解解性很强强，时间间要把握握好，前前者以脱脱蜡为准准，不要要有空气气，后者者以透明明为准。如如果片子子变黑，重重新放回回二甲苯苯，再透透明一次次。4.试剂剂重复使使用后，实实验结果果不明显显（脱蜡蜡不完全全、染色色不好等等），因因此在实实验中要要检查各各试剂是是否干净净，如果果污染严严重，一一定要更更换。实验三 叶绿体体的分离离与荧光光观察【实验目目的】1、通过过植物细细胞叶绿绿体的分分离, 了解细细胞器分分离的一一般原理理和方法法.2、观察叶叶绿体的的自发荧荧光和次次生荧光光,并熟熟悉荧光光显微镜镜的使用用方法.【实验原原理】将组织匀匀浆后悬悬浮在等等渗介质
15、质中进行行差速离离心，是分离离细胞器器的常用用方法。叶绿体体的分离离应在等等渗溶液液(0.35mmol/L氯化化钠或00.4mmol/L蔗糖糖溶液)中进行行,以免免渗透压压的改变变使叶绿绿体到损损伤。将匀浆浆液10000rr/miin的条条件下离离心2mmin,以去除除其中的的组织残残渣和未未被破碎碎的完整整细胞。然后，在30000rr/miin的条条件下离离心5mmin，即可获获得沉淀淀的叶绿绿体(混混有部分分细胞核核)。分离过过程最好好在05的条件件下进行行，如果在在室温下下，要迅速速分离和和观察。 某些些物质在在一定短短波长的的光（如如紫外光光）的照照射下吸吸收光能能进入激激发态，从从激
16、发态态回到基基态时，就就能在极极短的时时间内放放射出比比照射光光波长更更长的光光（如可可见光），这这种光就就称为荧荧光。若若停止供供能，荧荧光现象象立即停停止。有有些生物物体内的的物质受受激发光光照射后后，可直直接发出出荧光（称称为自发发荧光），如如叶绿素素的火红红色荧光光。有的的生物材材料本身身不发荧荧光，但但它吸收收荧光染染料后同同样也能能发出荧荧光（称称为间接接荧光），如如叶绿体体吸附吖吖啶橙后后可发橘橘红色荧荧光。本实验利利用荧光光显微镜镜对发荧荧光的叶叶绿体进进行观察察。利用用荧光显显微镜对对可发荧荧光的物物质进行行检测时时,将受受到许多多因素的的影响,如温度度,光,淬灭剂剂等。因此
17、在在荧光观观察时应应抓紧时时间,有有必要时时立即拍拍照。另外,在制作作荧光显显微标本本时最好好使用无无荧光载载片、盖片和和无荧光光油。【实验用用品】 1.器器材：11）主要要设备:普通离离心机,粗天平平,荧光光显微镜镜；2）小型型器材: 剪刀刀，研钵钵，移液液管，漏漏斗， 滴管, 100ml刻刻度离心心管,纱纱布若干干,无荧荧光载玻玻片和盖盖玻片。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。锲而舍之，朽木不折；锲而不舍，金石可镂。2.材料料： 新新鲜菠菜菜。 3.试试剂： 0.335mool/LL氯化钠钠溶液,0.011%吖啶啶橙(aacriidinne o
18、orannge). 0.011%吖啶啶橙的配配制：称称取0.1g吖吖啶橙加加蒸馏水水1000ml做做干液，贮棕色瓶，置4冰箱保存。放冰箱备用，临用前取1ml母液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9ml稀释。吖啶橙（AAcriidinne OOrannge，AAO）是是一种荧荧光色素素，其激激发滤光光片波长长4888nm。阻阻断滤光光片波长长5155nm。它它与细胞胞中DNNA和RRNA结结合量存存在差别别，可发发出不同同颜色的的荧光（即即着色特特异性），这这是由于于DNAA是个高高度聚合合物，吸吸收荧光光物质的的位置较较少，发发绿色荧荧光，而而RNAA聚合度度低，能能和荧光光物质结结
19、合的位位置多，故故发红色色荧光。【实验方法】1、叶绿绿体的分分离（1）选选取新鲜鲜的菠菜菜嫩叶，洗洗净擦干干后，去除叶叶梗及粗粗脉并剪碎，称称取2g左右，置置于预冷冷的研钵钵;（2）加加10mml的0.335moolL-1NaaCl溶溶液研磨磨匀浆;（3）用用6层纱布布过滤，滤滤液盛于于烧杯中中;（4）取取滤液44ml于于10000rppm离心心2miin，弃弃去沉淀淀;（5）将将上清液液30000rppm离心心5miin，弃弃去上清清液，沉沉淀即为为叶绿体体（混有有部分细细胞核）；（6）沉沉淀用00.355mollL-11NaCCl溶液液悬浮。2、叶绿绿体的观观察 （1）滴滴叶绿体体悬浮液液
20、一滴于于载片上上，加盖盖片；在在普通光光镜下观观察，注注意观察察所分离离的叶绿绿体的形形态以及及其是否否完整。（2）滴滴叶绿体体悬浮液液一滴于于无荧光光载片上上，加无无荧光盖盖片；在在荧光显显微镜下下观察叶叶绿体有有无自发发荧光，其其颜色如如何。（3）滴滴叶绿体体悬浮液液一滴在在无荧光光载片上上，再滴滴加一滴滴0.001吖吖啶橙荧荧光染料料，加无无荧光盖盖片后即即可在荧荧光显微微镜下观观察其次次生荧光光。3. 完完整细胞胞中的叶叶绿体观观察（1）用用镊子撕撕取一片片菠菜叶叶子表皮皮，平铺铺于载玻玻片上，滴滴加一滴滴提取缓缓冲液，加加盖片后后轻压，备备用。（2）用用镊子撕撕去菠菜菜叶子的的表皮，
21、用用刀片刮刮下一些些叶肉细细胞，放放于载玻玻片上，滴滴加一滴滴提取缓缓冲液，加加盖片后后轻压，备备用。（3）将将以上两两种制片片进行一一下三种种方式的的观察：a在普通通光镜下下观察。b在荧光光显微镜镜下观察察。c再滴加加一滴00.011吖啶啶橙荧光光染料，加加无荧光光盖片后后，在荧荧光显微微镜下观观察。【注意事事项】要得到完完整的、有有活性的的叶绿体体，须低低温下迅迅速提取取，涂片片后立即即观察。【作业与与思考】1. 描描述你所所观察到到的实验验现象，自自发荧光光和次生生荧光的的区别？2叶绿绿体分离离的原理理是什么么？操作作过程中中应注意意什么？实验四 吖啶啶橙(aacriidinne oor
22、annge)染色观察口腔腔上皮荧荧光【目的要要求】1、熟悉悉荧光显显微镜的的原理及及使用方方法。2、观察察荧光染染料染色色后结合合物发出出的荧光光。【实验原原理】吖啶橙荧荧光染料料可与细细胞内DDNA和和RNAA结合。其其吸收光光谱4005nmm，发射射的荧光光光谱是是53006440nmm，因此此，吖啶啶橙和不不同的细细胞成分分结合后后，可发发射红橙橙黄绿蓝蓝各色荧荧光。【实验用用品】1器材材：荧光光显徽镜镜、载玻玻片、盖盖玻片、染染色缸、牙牙签；2材料料：口腔腔黏膜上上皮细胞胞临时制制片；3试剂剂:1)0.1mool/LL pHH7.00 PBBS液。A液：NNaH22PO4H20 2.7
23、6gg加蒸馏馏水至1100mml；B液，NNa2HPOO47H20 5.36gg加蒸馏馏水至1100mml；取A液116.55ml、B液333.5mml、NaCCl8.5g用蒸馏馏水稀释释至1000mll。2)0.1吖吖啶橙原原液：00.1g吖啶橙橙加蒸馏馏水至1100mml。临临用时配配制0.01吖啶橙橙染液：将0.1吖吖啶橙原原液用PPH7.0PBSS液稀释释。3）955乙醇醇【方法与与步骤】1用牙牙签刮取取口腔上上皮细胞胞涂在干干净载玻玻片上；2955乙醇醇溶液固固定5mmin；3滴加加0.001吖吖啶橙染染液染色色5miin；4用PPBS缓缓冲液缓缓慢冲洗洗；5加盖盖玻片镜镜检。【观察
24、结结果】描述你所所观察到到的实验验现象，并并绘图，表表明荧光光的颜色色。实验五 植物细细胞骨架架的光学学显微镜镜观察【实验目目的】掌握植物物细胞骨骨架的制制备方法法，并用用光镜观观察洋葱葱内皮细细胞的骨骨架网络络结构。【实验原原理】细胞骨架架(cyytosskelletoon)，是是细胞内内以蛋白白质纤维维为主要要成分的的网络结结构，根根据蛋白白质纤维维的直径径、组成成成分和和组装结结构的不不同可分分为微丝丝、微管管和中等等纤维。细细胞骨架架对于维维持细胞胞的形态态结构及及细胞运运动、物物质运输输、能量量转换、信信号传导导和细胞胞分裂等等有重要要的作用用。本实实验采用用去垢剂剂Triitonn
25、X-1100的缓冲冲液处理理植物材材料时，可可将细胞胞的膜结结构和大大部分蛋蛋白质抽抽提掉，但但细胞骨骨架系统统的蛋白白却被保保存下来来，后者者用考马马斯亮蓝蓝R2550染色，在在光学显显微镜下下可见一一种网状状结构。【实验用用品】1.器材材：显微微镜、载载玻片、盖盖玻片、镊镊子、滴滴管、擦擦镜纸、550mll烧杯；2.实验验材料：洋葱鳞鳞茎；3.试剂剂：1）pHH6.88的磷酸酸缓冲液液；索伦森（SSoreenseen）磷磷酸缓冲冲液溶液A：Na22HPOO42H2O 11.8766g加蒸蒸馏水至至1L溶液B：KH22PO49.008g加加蒸馏水水至1LL对照下表表取一定定体积的的溶液AA，
26、再加加入足够够的溶液液B至总总体积达达1000ml，即即得到所所需pHH的缓冲冲液。溶液ApH溶液ApH溶液ApH0.64.949.226.881.887.42.35.361.227.085.227.54.95.667.007.188.557.612.116.072.667.293.667.826.446.477.777.396.998.02）M-缓冲液液：50mmmoll/L (pHH6.7)咪咪唑、 50mmmoll/L KCll、0.5mmmol/LMggC122 、 1mmmoll/L EGGTA、0.11mmool/LL EDDTA、1mmmoll/L巯巯基乙醇醇、 44mmool/
27、LL甘油、1mool/LLHCCl调调pH至7.22。3）1%TriitonnX-1100：用M-缓冲冲液配制制。4）3%戊二醛醛：用ppH6.8的磷磷酸缓冲冲液配制制。5）0.2%考考马斯亮亮蓝R2250染液：0.88g考马马斯亮蓝蓝R2550、446.55ml甲甲醇、77ml冰冰醋酸、466.5mml蒸馏馏水。6）500，770，995乙乙醇7）叔丁丁醇、正正丁醇、二二甲苯、中中性树胶胶【实验步步骤】1. 取材：撕撕取洋葱葱鳞茎内内表皮00.51cmm2，浸入入装有磷磷酸缓冲冲液（PPH6.8）的的小烧杯杯中，处处理510分分钟。2. 去垢处理理：弃去去PBSS缓冲液液，用吸吸水纸吸吸净剩
28、余余的PBBS，加加适量11%Trritoon XX-1000，使使液体充充分浸泡泡材料，并并立即放放入377恒温箱箱或水浴浴锅中处处理300分钟。3. 冲洗：吸吸去1%Triitonn X-1000，立即即加入MM缓冲液液轻轻冲冲洗3次次，每次次355分钟。4. 固定：用用吸管将将M缓冲冲液吸尽尽，加入入3%戊戊二醛，固固定100200分钟。5. 冲洗：吸吸去3%戊二醛醛固定液液，用磷磷酸缓冲冲液（PPH6.8）冲冲洗3次次，每次次355分钟。6. 染色：吸吸去PBBS缓冲冲液，加加入适量量0.22%考马马斯亮蓝蓝R2550染料料，染色色1020分分钟。7. 制片：吸吸去染料料，用水水冲洗（
29、注注意不要要将材料料丢失）。将将洋葱表表皮伸展展铺平于于载玻片片上，加加盖盖玻玻片。8. 镜检：将将制好的的片子置置于低倍倍镜下，可可见到规规则排列列的长方方形洋葱葱表皮细细胞轮廓廓，细胞胞质内可可见到被被染成蓝蓝色的粗粗细不等等的分枝枝状结构构，这便便是细胞胞骨架。转转高倍镜镜继续观观察，调调节细螺螺旋可见见到细胞胞骨架的的立体结结构。在有样品品的500ml烧烧杯中，顺顺序通过过如下药药物：550、770、995乙乙醇，995乙乙醇叔叔丁醇（11：1），叔叔丁醇（每每级510mmin）；或正丁丁醇、正正丁醇、二二甲苯、二二甲苯（每每级510分分钟），然然后捞取取样品，平平展于载载玻片上上，经
30、镜镜检，效效果好的的可加一一滴中性性树胶，盖盖上盖玻玻片。【作业与与思考】1. 绘绘出洋葱葱细胞的的骨架网网络分布布。2根据据M-缓缓冲液的的成分，分分析其作作用。3通过过实验过过程，推推测你所所观察到到的细胞胞骨架属属于胞质质骨架中中的哪种种类型，为为什么？实验六 PEGG法诱导导细胞融融合【实验目目的】1. 了了解细胞胞融合的的原理和和过程；2. 初初步掌握握利用PPEG介介导动物物细胞融融合的实实验技术术。【实验原原理】细胞融合合，即在在自然条条件下或或利用人人工法 (生物物的、物物理的、化化学的)，使两两个或两两个以上上的细胞胞合并成成一个具具有双核核或多核核细胞的的过程。由由于不仅仅
31、同种细细胞可以以融合，种种间远缘缘细胞也也能融合合，甚至至于动植植细胞也也能合二二为一，因因此细胞胞融合技技术目前前较广泛泛应用于于细胞生生物学、遗遗传学和和医学研研究等各各个领域域，并且且取得显显著的成成绩。化学融合合方法一一般使用用聚乙二二醇(PPEG)诱导细细胞在体体外进行行融合。商商品PEEG的相对分分子质量量有2000-60000范范围内的的各种规规格，它它们均可可用作细细胞融合合剂。普普遍认为为PEGG分子能能改变各各类细胞胞的膜结结构，使使两细胞胞接触点点处质膜膜的脂类类分子发发生疏散散和重组组，由于于两细胞胞接口处处双分子子层质膜膜的相互互亲和以以及彼此此的表面面张力作作用，从
32、从而使细细胞发生生融合。促促进细胞胞融合的的效力，必必须采用用较高浓浓度的PPEG溶溶液，但但在高浓浓度PEEG溶液液下，细细胞可能能因脱水水而受到到显著的的破坏。因因此，选选择合适适的PEEG分子子量，浓浓度及作作用时间间是PEEG融合合技术的的关键。该方法的优点是：操作简单，容易获得融合体，融合效果好。细胞融合合率是指指在显微微镜的一一个视野野内，已已发生融融合的细细胞核总总数与该该视野内内所有细细胞(包包括已融融合的细细胞)的的细胞核核总数之之比，通通常以百百分比表表示。【实验用用品】1器材材:离心心机、显显微镜、天天平、水水浴锅、滴滴管、离离心管、烧烧杯、盖盖玻片、载载玻片。2材料料：
33、鸡血血悬液；3试剂剂：1）0.85%的生理理盐水；2）GKKN液：8.00g的NNaCll，0.4g50%（mm/V）PPEG（37温浴）：取50gPEG（相对分子质量4000）放入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG冷却至5060，勿让其凝固。加入50ml预热至50的GKN液，混匀，置37备用。3）1%詹那斯斯绿B；4) HHankks溶液液（含NNaCll，KCCl, Na22HPOO4, MMgSOO4, CCaCll2, 葡葡萄糖，酚酚红）Hankks原液液（100）NaCll 800.0ggNa2HHPO4412HH2O 1.22gKCl 44.0ggKH2PPO40.66g
34、MgSOO47H2O 2.0g葡萄糖 110.00gCaCll21.44g称取1.4g的的CaCCl2，溶于于3050mml的重重蒸水中中。取110000ml的的烧杯及及容量瓶瓶各一个个，先放放重蒸水水8000ml于于烧杯中中，然后后按照上上述配方方水需，逐逐一称取取药品。必必须在前前一药品品完全溶溶解后，方方可放入入下一药药品，直直到葡萄萄糖完全全溶解后后，再将将已经溶溶解的CCaCll2溶液加入入，最后后加水定定容至110000ml。Hankks液：Hankks原液液 1000ml重蒸水 8966ml0.5酚红 44ml配好的HHankks液，分分装包扎扎好贴上上标签，经经过灭菌菌后，44
35、保存。【实验步步骤】Hannks溶溶液换成成GKNN溶液1.鸡血血红细胞胞悬液的的制备：将抗凝凝剂与鸡鸡血按11:31:44的比例例稀释，制制成鸡血血红细胞胞细胞悬悬液，放放入4冰箱内内可保存存3-4天；2.取鸡鸡血1mml，加加入4mml0.85%的生理理盐水，110000rpmm离心33minn, 弃弃上清液液，重复复上述操操作一次次；3.沉淀淀用适量量Hannks溶溶液重悬悬浮，110000rpmm离心33minn, 弃弃上清液液，用HHankks溶液液稀释沉沉淀，制制成100%左右右的细胞胞悬液，迅迅速在显显微镜下下观察细细胞密度度；4. 取取1mll上述细细胞悬液液，加00.5mml
36、 550% PEGG溶液，37水浴中进行细胞融合（30min左右）；5.缓慢慢加入HHankks溶液液，轻轻轻混匀，终终止PEEG的作作用，使使细胞三三三两两两地分散散开来（镜检），室温静置约20min;6.取11小滴悬悬液于载载玻片上上，加少少量的詹詹那斯绿绿B染液液，染色色5miin左右右；7.镜检检，观察察细胞融融合现象象。【实验结结果】1.绘出出已融合合的细胞胞形态图图，描述述你所观观察到的的细胞融融合现象象。2.计算算细胞融融合率。【作业与与思考】1请分分析Haankss溶液的的作用是是什么（可可以从其其成分的的角度来来回答）？2.PEEG诱导导细胞融融合率受受哪些因因素影响响？3你
37、认认为在进进行细胞胞融合时时，要注注意哪些些问题?实验七 动物骨骨髓细胞胞染色体体标本的的制备与与观察【实验目目的】（1）掌掌握动物物骨髓细细胞染色色体标本本的制备备技术（2）观观察染色色体的数数目以及及形态特特征【实验原原理】骨髓细胞胞具有丰丰富的细细胞质和和高度的的分裂能能力，因因此不必必经体外外培养，也也不需要要植物血血球凝集集素（PPHA）的的刺激，可可以直接接观察到到分裂细细胞。经经过秋水水仙素处处理后，分分裂的骨骨髓细胞胞被阻断断在有丝丝分裂中中期，再再经离心心、低渗渗、固定定、滴片片等步骤骤，便可可制作出出理想的的染色体体标本，是是研究动动物细胞胞遗传学学的好材材料。骨骨髓细胞胞
38、染色体体标本的的制备，具具有取材材容易，方方法简单单易行等等优点，设设备也简简单，在在一般的的实验室室都可进进行。【实验仪仪器、材材料和试试剂】1.仪器器：天平、低低速离心心机、恒恒温水浴浴锅、显显微镜、1ml注射器、解剖盘、解剖剪、刀片。试管架、10ml离心管、吸管烧杯、量筒。酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸2. 材材料小白鼠或或无尾两两栖类青青蛙或蟾蟾蜍3. 试试剂1）Caarnooy固定定液（新新配制的的甲醇：冰醋酸酸3:1）2）0.1秋秋水仙素素：称取取10mmg秋水水仙素，加加入100ml的的0.665生生理盐水水（1mml含有有10000ugg，0.1mll含有1100u
39、ug秋水水仙素）；3）0.85%生理盐盐水；柠柠檬酸钠钠溶液；0.44%KCCl溶液液（0.0755M）4）0.06667mool/LL磷酸缓缓冲液（ppH7.4）A液：110000ml含含Na22HPOO49.4465gg或Na2HPOO42H2O 111.8776g或或Na22HPOO412HH2O23.88ggB液：110000ml含含KH22PO49.007g取A液880mll+B液液20mml混匀匀成pHH7.445）1:10 Gieemsaa磷酸盐盐缓冲液液Giemmsa母母液：GGiemmsa粉粉0.55g，甘甘油（AAR级）333mll，甲醇醇（ARR级）333mll先将少量量
40、甘油加加入研钵钵中，将将Gieemsaa粉充分分研细，再再倒入剩剩余甘油油，并在在56温箱中中保温22h，然然后再加加入甲醇醇混匀，储储存在棕棕色瓶中中。【方法与与步骤】1.骨髓髓细胞制制备如下下表步骤小鼠两栖动物物（1）秋秋水仙素素注射按4ugg/g体体重注射射34hh后处死死按30uug/gg注射78hh后处死死（2）取取后肢胫胫骨和股股骨，切切去两端端。（3）取取骨髓细细胞2%柠檬檬酸钠溶溶液1mml1%柠檬檬酸钠溶溶液1mml用1mll注射器器吸取柠柠檬酸钠钠溶液，通通过针头头将溶液液注入骨骨髓腔，冲冲出骨髓髓细胞置置10mml离心心管中（细细胞冲净净后骨髓髓腔由粉粉红变为为白色）；摘
41、掉针针头，用用注射器器筒轻轻轻反复吸吸打，使使分散成成单个细细胞。（4）低低渗处理理预热及低低渗水浴浴温度：37低渗时间间：300minn预热及低低渗水浴浴温度：26低渗时间间：300minn视细胞多多少加入入799ml 预热的的0.44%KCCl溶液液，在水水浴中低低渗处理理。2. 110000rpmm离心88minn。3. 弃弃上清，沿沿离心管管壁缓慢慢加入新新配制的的甲醇：冰醋酸酸（3:1）固固定液55ml，注注意不要要冲动细细胞团块块。加完完后立即即用吸管管将细胞胞轻轻吸吸打均匀匀，静置置固定220miin。如如此反复复固定223次次，每次次20mmin。4 固定定的细胞胞经离心心后，
42、吸吸去上层层固定液液，视管管底的细细胞多寡寡加入少少量新配配制的固固定液，细细胞团块块轻轻吸吸打成悬悬液（注注意：吹吹打不要要过于用用力）。5. 在在干净并并预冷的的载玻片片上滴223滴滴细胞悬悬液，干干燥。（注注意：滴滴片时滴滴管离载载玻片有有一定高高度有助助于染色色体分散散）6. 将将玻片细细胞面朝朝上水平平放置，滴滴加1:10 Gieemsaa磷酸盐盐缓冲液液344ml，染染色100minn。7. 冲冲洗掉染染液，干干燥后镜镜检。【结果分分析】（1）样样品的染染色体数数目是多多少？119对常常染色体体，1对对性染色色体。共共40条条（2）要要成功制制备染色色体标本本，在操操作中应应注意哪
43、哪些问题题？【实验提提示】过去实验验中曾经经出现的的问题（1）染染色后发发现没有有骨髓细细胞原因：未未能将细细胞从骨骨髓腔中中洗出；离心不不慎造成成细胞流流失；低低渗过度度造成细细胞破裂裂，染色色体流失失；冲洗洗不慎等等（2）染染色体分分散不佳佳而造成成无法计计数原因：低低渗控制制不好造造成细胞胞体积过过小；干干燥过度度等注意：随随时镜检检才能确确定各步步骤是否否存在问问题低渗与离离心等步步骤的操操作要轻轻。 观察细胞胞的标准准为：1细胞胞完整，轮轮廓清晰晰，染色色体分布布在同一一水平面面上。2染色色体形态态和分布布良好。3最好好无重叠叠，即使使有个别别重叠，也也要能明明确辩认认，以免免差错。
44、4所观观察的细细胞处于于同一有有丝分裂裂阶段，即即染色体体螺旋化化程度或或染色体体长短大大致一样样。在所观察察的细胞胞周围，没没有离散散的单个个或多个个染色体体存在，以以免影响响计数。 【作业和和思考】选择染色色体清晰晰，分散散度好的的中期分分裂相，计计数染色色体，显显微摄影影，打印印出照片片。在制备小小鼠骨髓髓细胞染染色体时时为什么么要进行行预固定定？因为在之之前你得得到的染染色体都都处于不不同的分分裂期，预预固定是是为了使使这些细细胞及其其染色体体都固定定在当前前所处的的时期，便便于观察察。其实实质就是是把细胞胞杀死，使使其无法法继续进进行有丝丝分裂。天才是由于对事业的热爱而发展起来的。简直可以说，天才就其本质而论只不过是对事业，对工作的热爱而已。综合大实实验：烟草愈伤伤组织细细胞的培培养及细细胞凋亡亡的诱导导和观察察【实验目目的】1. 将将烟草的的悬浮细细胞诱导导发生细细胞凋亡亡。2. 了了解和掌掌握凋亡亡细胞的的琼脂糖糖凝胶电电泳检测测（DNNA梯状状条带）。3. 掌握凋亡亡细胞的的形态学学观察方方法。【实验原原理】细胞凋亡亡被分为为两类：受体介介导的细细胞凋亡亡和线粒粒体介导导的细胞胞凋亡。本本实验主主要涉