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1、第一章 实实验基本本操作一、要求求1熟悉悉实验室室规则及及常用生生化仪器器2清点点洗刷实实验用具具。3掌握握各种仪仪器的正正规操作作及维护护二、常用用生化仪仪器 烧杯试管刻度吸量量管离心管滴管搅棒枪式移液液器及其其配适吸吸头混匀器恒温水浴浴箱离心机分光光度度计，电泳仪点收仪器器；根据仪器器清单，逐逐项查点点是否完完好(如如有缺损损向教师师声明及及时补充充更换)。本套仪器器由本人人使用保保管至全全部实验验课程结结束。三、基本本操作1玻璃璃仪器的的洗涤(1)洗洗涤液：洗洁精精，肥皂皂水，洗洗衣粉。玻璃仪仪器专用用洗涤液液：主要要成份为为中性稀稀氯氧化化剂，上上海日化化研究所所出品(2)洗洗涤的要要
2、求与步步骤：要求：洁洁净的玻玻璃器皿皿表面应应不挂任任何水滴滴。步骤： 不净净的器皿皿洗衣粉或或肥皂水水刷洗自来水冲冲净达到要求求？ 是是 浸浸入洗液液(数小小时至过过夜) 自来来水冲净净 蒸馏水水涮洗223次(其目的的是去除除自来水水中的杂杂质，故故应少量量多次，全全面充分分)烤干或晾晾干、备备用 对使用用过的仪仪器应养养成及时时清洗的的习惯，特特别是血血液分析析时用以以吸取血血液样本本的吸管管，用过过后应当当立即用用水将所所沾的血血液冲去去，否则则放置过过久，血血液干燥燥硬结，就就很不容容易清除除。 (3)玻璃仪仪器的干干燥 一般般的玻璃璃仪器均均可洗净净后倒置置架上，让让其水分分蒸发自自
3、然干燥燥，如需需迅速干干燥者应应按仪器器的不同同类型按按下述不不同方法法处理： 试管、离离心管、烧烧杯、烧烧瓶等普普通玻璃璃器皿可可置烤箱箱中10001055烘烤少量仪仪器如需需急用也也可在电电炉上或或酒精灯灯上烘烤烤。烘烤烤时应将将器皿时时时转动动，务使使受热缓缓慢且均均匀，并并将管口口(或杯杯口)倾倾斜向下下，以便便水蒸气气冷凝成成水滴，顺顺口流出出，不致致使水滴滴接触烘烘热了的的器壁而而使仪器器爆裂。使用电电吹风干干燥一般般玻璃仪仪器也很很便利常常用。下列玻玻璃仪器器应避免免烘烤：吸管：容易造造成器壁壁变形而而致容量量不准。比色杯杯：易在在烘烤时时发生破破裂。2移液液操作(1)吸吸量管的
4、的使用吸量管管的选择择：在一次完完成转移移的前提提下，应应选用容容量较小小的吸量量管。对于同同一次实实验中同同一种试试剂的移移取，应应选用同同一支吸吸量管操作(见图111) 用洗耳耳球将液液体吸至至超过标标线移开洗洗耳球，迅迅速用食食指压紧紧管口必要时时将管尖尖端外围围拭净调液面面至标线线放开食食指，使使液体流流入容器器将最后后液滴沿沿器壁而而下或吹吹出读数(见图112)吸量管管保持垂垂直视线与与液面应应水平管中液液面与刻刻度线应应呈切线线注：对于于刻度由由上至下下的吸量量管应尽尽量使用用上端刻刻度管尖尖残液是是否需吹吹出，看看清标记记。弯(2)枪枪式移液液器的使使用抢式移移液器的的结构(见图
5、33) 1. 液液体吸放放钮2体积积选取钮钮3. 体体积、显显示4枪头头排放钮钮5. 枪枪头排放放器6枪头头接嘴其内部柱柱塞分22段行程程，第11档为吸吸液，第第2档为为放液，手手感十分分清楚。操作(见图114)调体积积选取钮钮至所需需值套上枪枪头，旋旋紧垂直持持握枪式式移液器器外壳，按按下大拇拇指至第第1档将枪头头插入溶溶液，徐徐徐松开开大拇指指，使其其复原排放时时，重新新将大拇拇指按下下，至第第1档后后，继续续按至第第2档以以排空注：移取取过程中中应控制制速度，力力度如需移取取另一样样品，按按枪头排排放钮，更更换枪头头3混匀匀(1)旋旋转法：手持容容器，使使溶液作作离心旋旋转(2)指指弹法
6、：一手执执试管上上端，另另一手轻轻弹试管管下部，：使其中中液体作作涡旋运运动。(3)搅搅动法：使用玻玻璃棒搅搅边；多多用于溶溶解烧杯杯中的固固体。(4)混混匀器法法：将试试管置于于混匀器器的振动动盘上，逐逐渐用力力下压，使使内容物物旋转。(5)倒倒转混匀匀：适用用于具塞塞的容器器，如容容量瓶、具具塞量筒筒及具塞塞离心管管等。操操作时，将将容器反反复倒转转。试管管内的液液量太多多，也可可利用倒倒转混匀匀法，外外面包以以玻璃纸纸塞住管管口，然然后用手手指按住住橡皮塞塞将试管管反复倒倒转，溶溶液即可可充分混混匀。(6)吸吸管混匀匀法：用用吸管将将溶液反反复吸吹吹数次，以以达到混混匀的目目的。4加热热
7、与保温温(1)加加热(2)保保温使用恒恒温水浴浴箱，调调节温度度设定钮钮至需要要的温度度。水浴箱箱中水要要足量。实验过过程中应应随时监监测温度度，并及及时调节节。5离心心(1)离离心沉淀淀法：当颗粒小小而不均均一，沉沉淀粘稠稠或容积积小又需需精确定定量时，往往往采用用离心沉沉降法。(2)离离心前检检查：取出所所有套管管，起动动空载的的离心机机，看是是否转动动平稳。检查套套管有无无软垫，是是否完好好，内部部有无异异物。离心管管与套管管是否匹匹配。 (3)平平衡： 将一对对离心管管放入套套管，置置于天平平两侧，用用滴管较较轻一侧侧的离心心管与套套管之间间加水至至两侧平平衡(离离心管及及其内溶溶液量
8、不不能差别别过大) (4)离心： 将等重重的两管管置于离离心机中中的对称称位置，调调转速调调节钮，逐逐渐增加加转速至至所需值值，计时时，离心心结束后后，将套套管中的的水倒净净，所有有套管放放回离心心机中。 四、血血液样品品的制备备： 1采采取血液液样品的的注意事事项： (1)空腹采采血： 血液中中不少化化学成份份可受饮饮食影响响，一般般需在早早晨空腹腹或禁食食6小时时以上采采取血液液。 (2)防止酶酶的分解解作用： 血液内内若干化化学成份份在离体体后继续续分解。如如血糖被被红细胞胞糖酵解解酶系统统分解而而降低；为防止止酶分解解作用可可用氟化化钠、碘碘乙酸等等保存剂剂，或将将血液立立即制成成无蛋
9、白白血滤液液。(3)防防止溶血血：红细胞与与血浆中中成分与与含量皆皆有显著著的差别别，因此此溶血可可影响一一些血清清或血浆浆生化检检验的结结果。为为防止溶溶血，抽抽血用具具必须干干燥清洁洁，避免免剧烈振振摇，防防止污染染。 2抗凝凝剂：根据所测测定血液液成份不不同，标标本可应应用血清清、血浆浆或全血血。若需需血浆或或全血应应加抗凝凝剂。 (1)草草酸钾 为最最常用的的抗凝剂剂，02m88可使11nd血血液不凝凝固。它它与血液液内钙离离子形成成草酸钙钙使血液液不再凝凝固，但但不能用用于钾、钙钙测定。(2)草草酸钾一一草酸铵铵混合剂剂(3：2) 铵盐盐使红细细胞膨胀胀，钾盐盐使之皱皱缩，故故两者混
10、混合能保保持红细细胞体积积不变。(3)柠柠檬酸盐盐 与与钙离子子混合成成可溶性性钠络合合物，从从而防止止血液凝凝固。比比草酸钾钾较少产产生溶血血，故用用于红细细胞沉降降率测定定及输血血。但抗抗凝能力力较弱，一一般不作作生化检检验抗凝凝剂用。(4)氟氟化钠 有弱弱抗凝作作用，但但能抑制制糖酵解解和一些些水解酶酶类。草草酸钾-氟化化钠(33：1)、氟化化钠-麝香草草酚(110：11)是测测定血糖糖、尿酸酸、肌酐酐、无机机磷等的的良好抗抗凝剂。(5)肝肝素 能抑制制凝血酶酶原转化化为凝血血酶而抗抗凝血。抗抗凝能力力强，001022mg或或20单单位可使使1m11血液不不凝固，且且较少产产生溶血血。五
11、、实验验预习，实实验记录录，实验验报告1实验验预习实验前应应认真预预习，弄弄清实验验目的、原原理、操操作概要要、各步步操作的的意义及及注意事事项。2实验验记录准备一个个记录本本，在实实验时记记录实验验现象、实实验结果果和实验验数据。3. 实实验报告告每个同学学均应准准备一个个练习本本，以备备实验结结束后及及时整理理和总结结实验结结果，写写出实验验报告：实验报报告应包包括以下下项目：(1)实实验名称称(2)目目的和要要求(3)原原理(简简述实验验的基本本原理)(4)操操作(可可以采用用流程图图的方式式或以表表格方式式表示)(5)结结果与讨讨论 描述实实验出现现的现象象和结果果，分析析它们所所说明
12、的的问题，探探讨实验验成败的的关键。阐阐述对实实验设计计的改进进意见等等。对于于定量实实验列出出算式进进行计算算并对实实验结果果进行必必要的说说明和分分析。(6)思思考题(徐 洪)第二章 生物物化学实实验常用用方法第一节分分光光度度法 光线的的本质是是一种电电磁波，有有与电磁磁波和XX线类同同的性质质。光线线有不同同的波长长，肉眼眼可见彩彩色光称称之可见见光，波波长范围围在40007500nm，小小于4000nmm的光线线称为紫紫外线，大大于7550nmm的光线线称之红红外线。如如图所示示(表221)当光线通通过透明明溶液介介质时，其其幅射能能量有部部分被溶溶液吸收收，一部部分透过过，所以以光
13、线射射出溶液液介质之之后光能能被减少少。对溶溶液来说说，溶液液呈现不不同的颜颜色，是是由于溶溶液中的的质点(分子或或离子)选择性性地吸收收某种颜颜色的光光所引起起的。如如果各种种颜色的的透过程程度相同同，这种种物质就就是无色色透明的的，若只只让一部部分波长长的光透透过，其其它波长长的光被被吸收，则则溶液就就呈现出出透过光光的颜色色，并与与被吸收收的光的的颜色完完全互补补。任何何一种溶溶液，对对不同波波长的光光的吸收收程度是是不相等等的，一一些有色色物质可可以选择择性地吸吸收一部部分可见见光区的的光的能能量而呈呈现不同同颜色，一一些物质质却能特特征性地地选择吸吸收紫外外线的能能量。物物质吸收收由
14、光源源发出的的某些波波长的光光可形成成特定的的吸收光光谱。由由于物质质的吸收收光谱与与物质的的分子结结构有关关，而且且在一定定条件下下其吸收收程度与与该物质质的浓度度成正比比，所以以可利用用物质的的特定吸吸收光谱谱对其进进行定性性和定量量分析。分分光光度度法是利利用各种种物质所所具有的的这种吸吸收特征征所建立立起来的的分析方方法。 一、分分光光度度分析法法的基本本定律 劳伯比尔定定律(LLambbertt-Beeerllaw)是讨论论吸收光光能与溶溶液浓度度和溶质质层厚度度之间关关系的基基本定律律，是分分光分析析的理论论基础。 劳伯比尔定定律适用用于可见见光、紫紫外光、红红外光和和均匀非非散射
15、的的液体 (一) Laambeert氏氏定律 一束束单色光光通过透透明溶液液介质时时，光能能被吸收收一部分分，被吸吸收光能能的量与与溶液介介质厚度度有一定定比例关关系(见见图21)。表达式为为 这里里I0为入射射光强度度 I为为通过溶溶液介质质后的光光强度 L为为溶液介介质的径径长(ppathh leengtth) k为为吸光系系数(aabsoorpttionn cooeffficiientt)(ggcm-11) (二二)Beeer氏氏定律 以溶溶液介质质浓度变变化代替替溶液介介质厚度度的改变变，光能能的吸收收与浓度度改变有有类同的的关系，即即一束单单色光通通过溶液液介质时时，光能能被溶液液介
16、质吸吸收一部部分，吸吸收多少少与溶液液介质浓浓度有一一定的比比例关系系。得出下式式： 这里C(Conncenntraatioon)为为溶液介介质的浓浓度(ggL-1)将Lammbennt氏定定律和BBeerr氏定律律合并，即即(1)和(22)合并并为式中A(Abssorbbancce)为为吸光度度 T(TTrannsmiittaancee)为透透光度(4)式式也可表表达为 A=Cb.(55)式中(epssiloon)称称之摩尔尔吸光率率(Moolarr abbsorrptiivitty)(mollL-1cmm-1) C(cconccenttrattionn)浓度度(moolLL) b(ppat
17、hh leengtth)溶溶液样品品的长度度cm(或比色色皿内径径长cmm) (5)式为llambberttBeeer定律律的物理理表示式式，其含含义为一一束单色色光通过过溶液介介质后，光光能被吸吸收一部部分，吸吸收多少少与溶液液的浓度度和厚度度成正比比。此式式为分光光分析法法的基本本计算式式。 如果实实验中溶溶液厚度度b=llcm则则A=C图222表明，在在溶液介介质厚度度一定的的情况下下，吸光光度(AA)、透透光度(T)和和溶液介介质浓度度(C)之间的的关系。摩尔吸光光率()实际际上是物物质在单单位浓变变和单位位厚度下下对入射射光的吸吸光度，在在一定波波长下，越大表示物质对光的吸收越强。二
18、、定量量的分光光光度法法分析许多对光光有吸收收的物质质可以直直接用分分光光度度法进行行定量分分析：一一些对光光，包括括紫外、可可见或近近红外都都无吸收收的物质质亦可通通过和某某些化学学试剂作作用而呈呈色，在在一定的的反应条条件下和和一定的的浓度范范围内，溶溶液颜色色的深浅浅(对光光吸收的的程度)和该溶溶液中显显色物质质的浓度度呈正比比。(一)测测定波长长的选择择使用分光光法测定定溶液中中物质的的含量，首首先要选选择最适适单色波波长，因因为只有有以能被被溶液吸吸收的光光束作为为入射光光才能符符合LaambeertBeeer定律律。测定定有色物物质时，不不同颜色色的待测测溶液，则则应选择择不同波波
19、长的单单色光束束。在分分光光度度计上，单单色光波波长的选选择原则则一般是是使被测测溶液的的单位浓浓度的吸吸光度变变化最大大，同时时还要具具有最小小的空白白及干扰扰读数，借借以获得得最高的的灵敏度度和正确确性。最最理想的的办法是是对每种种物质的的测定都都应先傲傲它的光光谱吸收收曲线及及有关干干扰物的的吸收曲曲线，根根据这些些光谱吸吸收曲线线来选择择最佳测测定波长长。表222可供供波长选选择的参参考。(二)利利用标准准管计算算测定物物含量最适波长长选定以以后可进进行溶液液物质含含量的测测定。通通常都采采用对比比测定法法，即以以巳知精精确含量量的待测测物质的的溶液作作为参考考标准物物(Css)和未未
20、知待测测样品(Cx)用同一一方法，在在同一条条件下、同同时进行行测定，读读取标准准物质的的吸光度度(Ass)和未未知含量量的样品品吸光度度(Axx)，由由于标准准物质和和未知物物质是同同一物质质，其摩摩尔吸光光率(巨巨)相同同和进行行测定用用的比色色皿内径径长(bb)相同同即bss=bxx，根据据A=Cb式式，可得得到 As=Cs 换算成成下式 Ax=Cx 式中CCs是标标准管中中物质的的实际含含量，是是标准液液的浓度度与实际际用量的的乘积；Cx是是测定管管中物质质的实际际含量。还还应换写写到法定定单位mmmollL、mmgmm1。(三)利利用标准准曲线进进行换算算配制一系系列不同同浓度的的标
21、准的的溶液(至少五五个)按按测定管管同样方方法处理理显色，在在选定的的波长分分别测定定各管的的吸光度度(A)，以吸吸光度为为纵坐标标，标准准溶液的的浓度(C)为为横坐标标，在方方格坐标标纸上作作图，制制作标准准曲线。以以后在同同样条件件下进行行测定时时，测定定被测溶溶液的吸吸光度，从从标准曲曲线上可可找出相相应的浓浓度。根据LaambeertBeeer定律律，标准准液的浓浓度在一一定范围围内与吸吸光度呈呈直线关关系，标标准曲线线是这种种直线关关系的描描述，一一般认为为，标准准曲线范范围在测测定物浓浓度的一一半到二二倍之间间，并使使吸光度度在005100范围内内为宜。 还须注意意：曲线线制作与与
22、测定管管的测定定应在同同一仪器器上进行行，由于于曲线的的建立与与实验室室当时的的条件如如温度，湿湿度和气气压及电电压稳定定性等有有关，因因此标准准曲线常常因各种种变化而而需校正正或重做做。(四)摩摩尔吸光光率求取测测定物浓浓度当浓度为为1ML时，溶溶液厚度度为1ccm，吸吸光率用用表示，在在已知测测定物的的，则可可根据下下式求得得测定物物的物质质浓度。此计算法法常用于于紫外吸吸收，如如核苷酸酸溶液含含量测定定，如UUTP在在2622nm具具有最大大吸收峰峰，利用用已知UUTP在在2622nm时时的摩尔尔吸光率率，读取取待测UUTP溶溶液吸光光度A，即即可求出出该UTTP浓度度。二种以上上被测物
23、物的混合合液，也也可利用用不同进行定定量测定定。例如如a，bb两种物物质在波波长1时，摩摩尔吸光光率分别别为a1和和b1：，在波波长2时摩摩尔吸光光率分别别为a2和和b2，aa和b混混合的溶溶液在1时吸吸光度为为Al，在在2时的的吸光度度为A22(图223)，各各自浓度度分别为为Ca和和Cb，则则 如有三三种以上上成分的的混合液液，也可可通过三三种不同同波长情情况下的的吸光度度，以各各自特有有的值，依依据三元元一次方方程，同同样可求求出未分分离的三三种混合合物的各各自浓度度-三、物质质的定性性分析以不同波波长的单单色光作作为入射射光，测测定某一一溶液的的吸光度度，然后后以入射射光的不不同波长长
24、为横轴轴，各相相应的吸吸光度为为纵轴作作图，可可得到溶溶液的吸吸收光谱谱曲线。吸吸收光谱谱曲线是是物质的的特征性性曲线，它它和分子子结构有有严格的的对应关关系故可可作为定定性分析析的依据据。不同同的物质质，分子子结构不不同，其其吸收光光谱曲线线也有其其特殊形形状(图图24)。在吸收光光谱中，往往往可以以找到一一个或几几个吸收收最大值值，该处处的波长长称为最最大吸收收波长(入maax)。物物质不同同，它们们的波长长(nmm)最大大吸收波波长也往往往不同同，图114为维维生素BB12溶溶液的吸吸收光谱谱曲线。物质用分分光分析析定性主主要依据据吸收光光谱存在在的特征征吸收。1比较较吸收光光谱曲线线，
25、在相相同情况况下，吸吸收光谱谱曲线不不同，表表明物质质的化学学结构不不同，因因为不同同的物质质有各自自的特征征性曲线线。如AATP和和GTPP都属于于核苷酸酸，它们们的溶液液在紫外外光区均均有吸收收，但由由于化学学结构不不很一样样，它们们的吸收收光谱就就有差别别。需要要注意的的是在不不同条件件(如选选择不同同溶剂)下，即即使是同同一物质质也可呈呈现不同同的吸收收光谱。2比较较最大的的吸收波波长。不不同的物物质可有有不同的的最大吸吸收波长长(kmmax)。如AATP、GGTP、CCTP和和UTPP的maxx分别为为2599nm、2253nnm、2271nnm和2262nnm。LLnlaax可作作
26、为物质质定量测测定的最最适波长长，此时时测定灵灵敏度最最高。有有些物质质化学结结构相近近，可产产生相同同的maxx，伹它它们的吸吸收系数数都不一一致，可可据此鉴鉴别之。 3比较较吸光度度比值。可可根据物物质两个个或几个个不同波波长的吸吸光度比比值来鉴鉴别不同同的物质质，同时时也可检检查物质质的纯度度。如DDNA溶溶液kmmax为为2600nm。在在2600nm的的吸收度度和在2280nnm的吸吸收度比比值为118。但但溶液中中混进了了蛋白质质，则比比值会降降低(蛋蛋白质在在2800nm处处有最大大吸收)。四、常用用分光光光度计及及使用介介绍(一)7721型分分光光度度计 该机光光谱范围围在36
27、608000nm(可见光光区)，该该机灵敏敏度较高高，而且且结构简简单，操操作方便便，可用用于有色色物质溶溶液的测测定。17221型分分光光度度计光路路图和外外形图2使用用方法； (1)开开启电源源，指示示灯亮，选选择开关关置于“T”，波长长调置测测试用波波长。仪仪器预热热20分分钟。(2)打打开试样样室盖(光门自自动关闭闭)。调调节“0”旋钮，使使数字显显示为“000”盖上试试样室盖盖，将比比色皿架架处于蒸蒸馏水校校正位置置，使光光电管受受光，调调节透光光率“1000”旋钮，使使数字显显示为“1000.0”。 (3)将将选择开开关置于于“A”。调节节消光零零旋钮，使使得数字字显示为为“000
28、0”，然后后将被测测样品移移入光路路，显示示值即为为被测样样品的吸吸光度的的值。(4)如如果大幅幅度改变变测试波波长时，在在调整“0”和“1000”后稍等等片刻，(因光能能量变化化急剧，光光电管受受光后响响应缓慢慢，需一一段光响响应平衡衡时间)，当稳稳定后，重重新调整整“0”和1000即即可工作作。(5)每每台仪器器所配套套的比色色皿，不不能与其其它仪器器上的比比色皿单单个调换换。(6)换换一波长长测试时时，应将将选择开开关置“T”，重复复(2)和(33)操作作。(7)测测试完毕毕，关闭闭开关，电电源，将将比色皿皿冲洗干干净。 (三)UUV754型紫紫外分光光光度计计1. UUV7544紫外分
29、分光光度度计光路路图：由光源发发出的连连续辐射射光线，经经滤光片片和球面面反射镜镜至单色色器入射射狭缝处处聚焦成成像，光光束通过过入射狭狭缝，经经平面反反射镜到到准直镜镜，产生生平行光光射至光光栅。在在光栅上上色散后后，又经经准直镜镜聚焦在在出射狭狭缝上成成一连续续光谱，由由出射狭狭缝射出出定波波长的单单色光，通通过标准准溶液再再照射到到光电管管上。光源切换换与波长长移动相相对应 200nnm-2900nm需需点亮氘氘灯290nnm一3360nnm需同同时点亮亮氘灯和和钨灯360nnm-8500nm需需点亮钨钨灯单色器采采用自准准式系统统，衍射射光栅使使用该厂厂自制112000条nnm的复复制
30、闪跃跃光栅2测试试准备(1)打打开电源源开关之之前，检检查一下下测试样样品室。(2)试试样槽置置“参考”位置。(3)打打开电源源开关。如果波长长工作在在2000nm一一3000nm时时需按氘氘灯触发发按钮。(4)显显示器显显示7754”后，数数显为“10000”，则表表明仪器器已通过过自检程程序。此此时按AAC键键，仪器器自动进进入“00000吸光值值状态，测测试“连续”及“自动”打印状状态；(5)仪仪器预热热三十分分钟。3测试试(1)数数显“00000稳定后后，即可可把试样样槽置于于“样品”位置进进行测试试(即拉拉一下样样品室滑滑杆)。待待第一个个数据自自动打印印完毕后后，再可可将试样样槽置
31、于于第二个个“样品”位置测测试(即即再拉一一下样品品室滑杆杆)。(2)每每当需要要调换波波长时，必必须把试试样槽置置于“参考”位置，重重新调零零，现将将测试操操作顺序序如下：注意：样样品号超超过999号，打打印数复复位至000继续续计数下下去。(四)分分光光度度计和紫紫外分光光光度计计使用注注意事项项1光度度计的光光电管或或光电池池对不同同浓度的的光敏度度不一样样，应注注意每换换一次波波长，即即应将空空白溶液液的吸光光度调整整到0。2溶液液定量测测定，应应注意吸吸光度在在0005100范围，浓浓度太大大时应该该适当稀稀释。3一般般灵敏度度旋钮调调置“1”档，因因其放大大倍率最最小，较较稳定。(
32、五)双双波长分分光光度度计为了消除除背景吸吸收的影影响，提提高测定定的精确确度，可可采用双双波长分分光光度度法，仪仪器图示示如下：由图25可见见，从光光源发出出的光分分成两束束，分别别经过各各自的单单色器后后，分出出具有任任意波长长l和2的两两束单色色光，由由切光器器(斩波波器或称称扇面镜镜)调制制l和2，以以一定间间隔交替替照射装装有供试试品溶液液的比色色皿，然然后测量量和记录录它们之之间吸收收度的差差值。双波长分分光光度度法是通通过选择择二个适适当的波波长经过过斩波器器或扇面面镜，使使两个波波长分别别交替在在照射于于同一供供试品液液，测量量二个波波长处的的吸收度度之差A(A=AA2A1)，
33、来来消除不不相关吸吸收的方方法。双波长分分光光度度法由于于采用一一个比色色皿和两两道不同同波长的的光束进进行测量量，因而而不用参参比比色色皿，而而只用一一个比色色皿进行行测量，所所以能避避免由于于比色皿皿及样品品溶液和和参比溶溶液之间间的差别别等因素素所引起起的误差差，从而而可提高高测定的的精确度度。(六)荧荧光分光光光度计计 1荧光光分光光光度计种种类很多多，一般般均由激激发光源源、激发发单色器器、样品品皿和检检测器四四部分组组成。(1)光光源 主要用用于激发发荧光物物质产生生激发光光，通常常有汞灯灯和氙弧弧灯。对对光源的的要求是是能够产产生高强强度的，不不随波长长变化的的连续的的光谱。汞汞
34、灯提供供线性光光谱，由由于光强强度随波波长有很很大的变变化，作作为激发发光源有有一定的的局限性性，仅适适用于滤滤光片的的荧光计计的光源源，氙弧弧灯内有有氢气，通通电后氙氙气电离离，同时时产生很很强的光光源，并并提供22506000nm的的连续光光谱，最最高峰值值在4770nmm，适用用于记录录光谱图图。(2)单单色器 采用用滤色片片作单色色器的光光电荧光光计通常常有两个个滤光片片。处于于光源和和样品池池之间的的单色器器叫激发发单色器器；用于于选定不不同的激激发波长长，满足足不同溶溶液的需需要。处处于样品品池与检检测器之之间的单单色器叫叫发射滤滤光片，用用于滤去去样品池池里物质质受激发发后所产产
35、生的不不同波长长的可见见光。若用滤光光片代替替两个单单色器，这这样的仪仪器称为为荧光光光度计或或光电荧荧光计，这这类仪器器虽然结结构简单单，价格格低廉，但但是灵敏敏度低特特异性差差。若采采用棱镜镜或光栅栅作单色色器，这这类仪器器称为荧荧光分光光光度计计，但是是光栅色色散后谱谱线的波波长读数数是线性性的，并并且分辨辨率相同同时，光光栅色散散后得到到谱线强强度高于于棱镜，灵灵敏度高高。(3)样样品皿 大多多由石英英制成，某某些仪器器为了测测定低温温荧光，在在石英皿皿的外周周套上一一个装有有液氮的的透明石石英真空空瓶以降降低温度度。(4)检检测器 大多多数荧光光分光光光度计采采用光电电倍增管管作检测
36、测器。以以后的信信号处理理和显示示部件与与一般的的可见分分光计类类同。2荧光光分析的的应用分子荧光光光谱具具有灵敏敏度高、选选择好、操操作快速速等优点点。可适适用于生生物体内内微量的的有机物物和体内内代谢产产物的监监测与定定量。无机物很很少能发发出荧光光，无机机物的荧荧光分析析依赖于于待测元元素与有有机物形形成配合合物，具具有荧光光的配合合物可用用于荧光光分析，能能进行荧荧光分析析的元素素现已达达几十种种。此外荧光光光谱法法还有测测定葡萄萄糖、胆胆红素、叶叶胆原、胆胆汁酸和和某些激激素，甚甚至还可可借助于于酶的人人工底物物产生的的荧光测测定酶的的活性。(程枫)第二节电电泳法带电粒子子在电场场中
37、向与与自身带带相反电电荷的电电极移动动的现象象称为电电泳(EElecctroophooressis)，电泳泳技术是是生物化化学与分分于生物物学中的的重要研研究方法法之一。利利用电泳泳技术可可分离许许多生物物物质，包包括氨基基酸、多多肽、蛋蛋白质、脂脂类、核核苷、核核苷酸及及核酸等等，并可可用于分分析物质质的纯度度和分子子量的测测定等。电泳按介介质状想想来分，有有自由电电泳和区区带电泳泳两大类类。前者者以溶液液为介质质，在溶溶液中将将蛋白质质分离开开来。两两者相比比较，自自由电泳泳过程中中扩散严严重，分分辨率有有限，而而且设备备昂贵，操操作繁琐琐，现在在已基本本上被区区带电泳泳法所取取代。所所谓
38、区带带电泳法法，就是是在固体体支持物物上所进进行的电电泳。550年代代以来，常常用的固固体支持持物有滤滤纸、醋醋酸纤维维薄膜、淀淀粉凝胶胶、琼脂脂糖凝胶胶和聚丙丙烯酰胺胺凝胶等等等。区区带电泳泳法分辨辨率很高高，而且且设备简简单，操操作方便便，已经经是生物物化学及及分子生生物学领领域中极极为有用用的技术术。 一、电泳泳法的基基本原理理在酸性溶溶液中，蛋蛋白质分分子带正正电，而而在碱性性溶液中中，蛋白白质分子子带负电电。伹是是这并不不是实际际的电动动单位，从从物理化化学的原原理来分分析，带带电分子子的周围围由相反反电荷的的离子形形成扩散散双电层层，它由由紧密层层和扩散散层两部部分构成成。紧密密层
39、中相相反电荷荷的离子子被束缚缚在大分分子周围围，它在在电场中中是随大大分于一一起泳动动的，而而扩散层层中相反反电荷的的离子虽虽然也受受到大分分子的静静电引力力，但在在电场中中却会向向另一极极移动。紧紧密层表表面相对对于溶液液本体的的电位差差称之为为电动电电位即(Zeeta)电位，由由它决定定了蛋白白质分子子在电场场中的运运动速度度。蛋白质泳泳动分子子在电场场中受到到电动力力F的驱驱动，其其大小等等于净电电荷Q和和电场强强度E的的乘积： F=QQE如果假设设泳动分分于为球球体，它它在电场场中泳动动时也受受到一定定的阻力力F，按SStokke定律律，其大大小与球球体半径径r，介介质粒度度刁以及及泳
40、动速速度成正正比： F=6rv当恒速泳泳动时，电电动力FF与阻力力F相等，即即QE=6rv 带电粒子子在单位位电场强强度下的的泳动速速度，称称为迁移移率(mmobiilitty)或或泳动度度，以表示，即：所以可见，一一个带电电粒子的的迁移率率不仅取取决于其其本身所所带的电电荷，还还与带电电粒子的的大小、介介质的粘粘度等多多种因素素有关。在在具体实实验中，式中：vv为粒子子的泳动动速度(厘米秒或分分)，EE为电场场强度或或电势梯梯度(伏伏厘米米)，dd为粒子子移动距距离(厘厘米)，ll为支持持物的有有效长度度(厘米米)，uu为加在在支持物物两端的的实际电电压(伏伏)，11为通电电时间(秒或分分)
41、。故故迁移率率(或泳泳动度)的单位位为厘米米2秒-1伏特-11。假设物质质1和物物质2在在同一电电场中移移动距离离分别为为：经过时间间t之后后，两物物质(带带电粒于于)移动动的距离离之差力力：这就是说说，物质质1和22能否分分离开来来，取决决于两者者的迁移移率。若若它们的的迁移率率相同则则不能分分离，有有差别才才能分离离，差别别越大，分分离越好好。当然然，也与与其它实实验条件件有关。二、影响响电泳的的因素电泳结果果可受到到多种因因素的影影响，但但通常认认为以下下4个方方面更为为重要。(一)电电泳介质质的pHH当氨基酸酸为被分分离物质质时，各各种氨基基酸有不不同的等等电点，当当介质的的pH等等于
42、某氨氨基酸的的等电点点时，则则该氨基基酸处于于等电状状态，即即不向正正极或负负极移动动，当介介质pHH小于等等电点时时，氨基基酸呈阳阳离子状状态、向向负极移移动，反反之当介介质pHH大于等等电点时时，氨基基酸呈阴阴离子状状态，向向正极移移动。当当20种种氨基酸酸的混合合物置于于pH555左左右的介介质中电电泳时，可可以将它它们分离离为三组组。蛋白白质由氨氨基酸组组成，也也具有两两性电离离性质，所所以介质质的pHH值也影影响蛋白白质的电电离情况况，即决决定蛋白白质的带带电量(Q)。为为了保持持介质ppH的稳稳定性，常常用一定定pH的的缓冲液液，如分分离血清清蛋白质质常用ppH86的巴巴比妥缓缓冲
43、液或或三羟甲甲基氨基基甲烷(Triis)缓缓冲液。(二)缓缓冲液的的离子强强度离子强度度如果过过低缓冲冲液的缓缓冲容量量小，不不易维持持pH恒恒定；离离子强度度过高，则则降低蛋蛋白质的的带电量量(压缩缩双电层层降低ZZetaa电势)，使电电泳速度度减慢，所所以常用用离子强强度为00022022之间。溶溶液中离离子强度度的计算算方法如如下： Ci=离子的的摩尔浓浓度 Zi=离子的的价数例1，两两个单价价离子化化合物(如NaaCl)的离子子强度等等于它的的摩尔浓浓度，如如01154mmolL NNaCII溶液的的离子强强度例2，两两个两介介离子化化合物(如ZnnSO44)的离离子强度度等于它它的摩
44、尔尔浓度的的4倍，如如011mollL ZnSSO4溶溶液的离离子强度度由上述例例子中可可以看出出多价离离子会使使离子强强度增高高，所以以电泳缓缓冲液常常用单价价离子的的化合物物配制。(三)电电场强度度实验所用用电场强强度对移移动距离离起正比比作用。电电场强度度以每一一厘米的的电势差差计算，也也称电势势梯度。以以滤纸电电泳为例例，滤纸纸长155厘米，西西端电势势差为1150伏伏特，则则电场强强度为110伏特特厘米米。电场场强度愈愈高，则则带电粒粒子的移移动愈快快。伹电电压愈高高，电流流也随之之增高，产产生的热热量也增增加。所所以在高高压电泳泳(电场场强度大大于500伏特厘米)常需加加用冷却却装
45、置，否否则热量量可引起起蛋白质质等物质质的变性性而不能能分离，还还因发热热引起缓缓冲液中中水分蒸蒸发过多多，使支支持物(滤纸、薄薄膜或凝凝胶等)上离于于强度增增加，以以及引起起虹吸现现象(电电泳缸内内液体被被吸到支支持物上上)等，都都会影响响物质的的分离。(四)电电渗在电场中中，液体体对于固固体的固固定相的的相对移移动，称称为电渗渗（图22-6）。如如滤纸中中含有羟羟基而带带负电荷荷，与纸纸相接触触的水溶溶液带正正电荷，液液体便向向负极移移动。由由于电渗渗现象往往往与电电泳同时时存在，所所以带电电粒子的的移动距距离也受受电渗影影响，如如电泳方方向与电电渗相反反，则实实际电泳泳的距离离等于电电泳
46、距离离减去电电渗的距距离。如如方向相相同，则则实际电电泳距离离等于电电泳距离离加上电电渗的距距离。琼琼脂中含含有琼脂脂果胶(agaaroppetiin)，其其中含有有较多的的硫酸根根，所以以在琼脂脂电泳时时电渗现现象很明明显，许许多球蛋蛋白均向向负极移移动。除除去了琼琼脂果胶胶后的琼琼脂糖用用作凝胶胶电泳时时，电渗渗大为减减弱。电电渗所造造成的移移动距离离可用不不带电的的有色染染料或有有色葡聚聚糖点在在支持物物的中心心，以观观察电渗渗的方向向和距离离。三、区带带电泳的的分类区带电泳泳的形式式繁多，分分类比较较困难，仅仅按某一一特点分分类似乎乎都不全全面。这这里基于于支持物物的物理理性状、装装置形式式、pHH值的连连