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1、抗体的纯化抗体的纯化 -杨成遇 甘志雪现在学习的是第1页，共74页纯化步骤现在学习的是第2页，共74页抗体 纯化的步骤现在学习的是第3页，共74页一 饱和硫酸铵沉淀法 饱和硫酸氨沉淀是从溶液中分离蛋白质的常用方法。这是一种比较原始，非特异性分离技术。饱和硫酸氨沉淀法难以得到高纯度的抗体。其它大分子蛋白和混入絮状沉淀中的蛋白会造成对抗体的污染。因此把它作为抗体纯化的第一步。现在学习的是第4页，共74页1，基本原理 高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
2、这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。现在学习的是第5页，共74页2，操作步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33%50%（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS）1.将 767g（NH 4）2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0。此即饱和度为 100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L,25 C）.。2.其它不同饱和度铵溶液的配制。现在学习的是第6页，共74页（二）沉淀 1.样品（如
3、腹水）20 000 g 离心 30 min，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1：1 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（4 C），使蛋白质充分沉淀。现在学习的是第7页，共74页（三）透析1.蛋白质溶液 10 000 g 离心 30 min（4 C）。弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS-0.2g/L 叠氮钠透析 24-48 小时（4 C），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。现
4、在学习的是第8页，共74页Protein A/G亲和层析亲和层析 亲和层析是一种快速有效的生物活性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂贵,使用成本较高,限制了它的运用现在学习的是第9页，共74页Protein A A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分子量为42 KD,有6 个不同的IgG结合位点。其中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但IgA,IgM,IgE 也可能结合在配体上,当达到饱和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分子。A 蛋白
5、对IgG有高亲和力和特异性,这一特点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上清中的单克隆抗体现在学习的是第10页，共74页Protein G G蛋白是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，一种三型Fc受体。其通过类似于A蛋白的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像A蛋白一样，G蛋白与IgG 的Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose 还可以特异性低亲和地与重链的CH1及轻链的C 结合而用于纯化Fab 及F(ab)2。另外，ProteinG可以广泛、更强地结合许多类型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配体脱落也相对更低。现在学习的是第11页，共
6、74页Protein A-Sep harose CL2-4B 亲和层析柱分离提纯IgG Protein A-Sepharose CL24B 亲和层析法的原理是,A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地结合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合力,结合的强弱程度依次是:IgG2a IgG2b IgG3 IgG1。A 蛋白的这种结合也是具有p H 依赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯化与其结合较弱的IgG1。现在学习的是第12页，共74页方法1腹水的处理取腹水,在4,12 000g 条件下离心15min,以除去较大的凝块。2装柱将1.5g Protein A-Sep harose CL-4B
7、 干粉用67ml 三蒸水溶解,再用0.02M,p H 7.4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液)浸泡15min,然后装入层析柱中。3平衡用10 倍柱床体积的上样缓冲液过柱,流速为1ml/min,p H 试纸测试流出液体的p H 为7.4。现在学习的是第13页，共74页4上样取预处理过的腹水5ml,用上样缓冲液稀释至50ml,用0.45m 的滤膜过滤,上样,流速为1ml/min。5洗脱用上样缓冲液进行流洗,10 倍柱床体积,流速为1ml/min。随后用0.02M,p H 4.0 的柠檬酸缓冲液洗脱抗体,同时应用A KTA explorer100 进行监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时,取干净的
8、4ml 离心管收集,每收集3ml 后,立即用1M,p H 9.0 的TRis2Hcl 缓冲液调整p H 值至7.0。现在学习的是第14页，共74页6平衡收集洗脱液至洗脱峰回到基线后,继续用上样缓冲液平衡510 倍柱床体积,流速调至1ml/min。再用三蒸水平衡10 倍柱床体积。7 电泳鉴定 采用SDS 不连续丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE),浓缩胶和分离胶浓度分别为120g/L 和50g/L,每槽加样10l,考马斯亮蓝R250 染色。现在学习的是第15页，共74页层析图及电泳结果现在学习的是第16页，共74页MabSelect 系列大规模抗体纯化亲和层析介质MabSelect 是一系列最
9、新的大规模纯化抗体的亲和层析介质。它们的特点包括：1.更高的流速和动态载量2.更低的宿主杂蛋白吸附，抗体纯度更高3.更低的蛋白A脱落4.更易于工艺的线性放大5.MabSelect易于清洗与除菌，寿命更长、更经济6.生产过程无动物血清成分现在学习的是第17页，共74页精度纯化目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对潜在的污染物，如宿主细胞蛋白(HCP)、免疫球蛋白、宿主DNA；对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的蛋白A配基)进行去除；并能有效的去除/灭活病毒。现在学习的是第18页，共74页建议的工艺首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行澄清
10、(Cell removal)；然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0病毒灭活；澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere；这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求现在学习的是第19页，共74页中空纤维膜技术进行澄清对于动物细胞培养液，可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45m)进行澄清，而无需事先经过离心和预过滤，步骤少，速度快，收率高，成本低。和离心机比较，具有极高的澄清度，因此中空纤维澄清后的
11、细胞培养液可直接进蛋白A亲和层析进行纯化。现在学习的是第20页，共74页层析精细纯化技术：目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集体和变体等。常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、疏水层析等。现在学习的是第21页，共74页CaptoAdhere目的：使抗体分子流穿而聚集体、宿主蛋白、脱落的蛋白A配基等杂质结合在Adhere柱上加以去除去。原理：Capto Adhere介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基(N-Benzyl-N-methylethanolamine）综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚集体具有非常独特而高效的去除能力；此外，通过
12、有效的实验设计(Design of Experiment，DoE)，Capto Adhere介质还可以同时有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主蛋白、核酸、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体的两步层析纯化工艺成为现实步骤：首先，需要优化抗体在Capto Adhere上的结合条件。（确定的主要影响因素和实验设计范围为：电导：2-15mS/cm，每毫升凝胶上样载量为75-300mg/ml(流穿模式)，pH范围需要做起始结合条件确定：通常在低电导条件下(如2mS/cm时)样品完全不结合到有少量样品结合的pH条件）现在学习的是第22页，共74页CaptoAdhere其次（HTPD
13、 Predictor）：确定好实验条件后，可以同时平行做所有不同的结合条件，将试验结果相应于响应因子进行统计学分析 合并分析结果可以得到满足实验目标的操作范围。结果和优势：流穿模式的Capto Adhere将宿主蛋白、脱落的蛋白A和聚集体降低到很低的水平，载量可达100-200mg/ml介质，单步收率90%。此外，Capto Adhere还具有很强的病毒去除的能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。现在学习的是第23页，共74页将Mabselect SuRe和Capto Adhere相结合进行两步层析纯化。Mabselect SuRe可以达到99%的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto
14、adhere的流穿模式进行精纯:使抗体分子流穿而聚集体、宿主蛋白、脱落的蛋白A配基等杂质结合在Adhere柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。两步层析工艺现在学习的是第24页，共74页 完善工艺整合中的其它问题1，核酸和内毒素的去除。2，脱落亲和配基(蛋白A)的去除。a,阴离子交换层析是去除蛋白A-IgG复合物。b,阳离子交换层析也可以去除蛋白A配基。3,抗体制品的病毒去除/灭活及验证。低pH孵育、加热、S/D(溶剂/去污剂)、纳滤等现在学习的是第25页，共74页1，核酸和内毒素的去除。现
15、在学习的是第26页，共74页2，脱落亲和配基(蛋白A)的去除。a,阴离子交换层析是去除蛋白A-IgG复合物。b,阳离子交换层析也可以去除蛋白A配基。3,抗体制品的病毒去除/灭活及验证。低pH孵育、加热、S/D(溶剂/去污剂)、纳滤等现在学习的是第27页，共74页特异杂质含量验证DNA含量：DNA分子杂交法测定。（100pg/一剂量）热原（内毒素）：家兔法等试剂。（5EU/Kg）病毒含量：Scale-down。（工艺除病毒能力需达到10log以上）现在学习的是第28页，共74页单克隆抗体的浓缩目的方法：冻融浓缩法原理：冻融处理后的样品，其溶质集中在浓缩管的下端，越近管底浓度越高现在学习的是第29
16、页，共74页ELISA ELISA-徐顺 胡坚 李静一现在学习的是第30页，共74页1.ELISA的原理的原理2.ELISA的类型的类型3.试剂准备试剂准备：免疫吸附剂免疫吸附剂 结合物结合物 酶底物的准备酶底物的准备 4.对照设定对照设定5.标本的采取和保存标本的采取和保存6.结果判断结果判断 现在学习的是第31页，共74页 ELISA ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)是一种免疫是一种免疫测定定试验 。基基础:抗抗原原或或抗抗体体的的固固相相化化及及抗抗原原或或抗抗体体的的酶标
17、记。加加入入酶反反应的的底底物物后后，底底物物被被酶催催化化成成为有有色色产物物，产物物的的量量与与标本本中中受受检物物质的的量量直直接接相相关关，由由此此进行行定定性性或或定定量量分分析。析。1.ELISA的原理的原理现在学习的是第32页，共74页酶免疫测定类型酶免疫测定类型 这种固相种固相酶免疫免疫测定方法在定方法在19711971年最初建立年最初建立时称称为酶联免疫吸附免疫吸附剂测定，定，简称称ELISAELISA。酶免疫技免疫技术酶免疫免疫组化化酶免疫免疫测定定均相均相酶免疫免疫测定定非均相非均相酶免疫免疫测定定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相液相酶免疫免疫测定定现在学习的是第33页，
18、共74页1.11.1抗原抗体反应抗原抗体反应 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原与抗体抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的合形成抗原抗体复合物的过程是一种程是一种动态平衡，平衡，其反其反应式式为：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体的抗体的亲和力（和力（affinityaffinity），可以用平衡常数），可以用平衡常数K K表示：表示：K=AgK=AgAbAbAgAb,AgAgAb,AgAbAb的解离程度与的解离程度与K K值有关。有关。高高亲和力抗体的抗原和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适构型上非常适合，两者合，两者结合牢固，不易解离。合牢固
19、，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保解离后的抗原或抗体均能保持原有的持原有的结构和活性。构和活性。现在学习的是第34页，共74页1.1.21.1.2特异性特异性 抗原抗体的抗原抗体的结合合发生在抗原的决定簇与抗体的生在抗原的决定簇与抗体的结合位合位点之点之间。化学。化学结构和空构和空间构型互构型互补关系，具有高度的特异关系，具有高度的特异性。性。测定某一特定的物定某一特定的物质，而不需先分离待，而不需先分离待检物。物。现在学习的是第35页，共74页1.1.31.1.3最适比例最适比例 现在学习的是第36页，共74页1.1.41.1.4敏感性敏感性化学比色法的敏感度化学比色法的敏感度为mg/ml
20、mg/ml水平水平酶反反应测定法的敏感度定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫免疫测定中凝胶定中凝胶扩散法和散法和浊度法的敏感度与度法的敏感度与酶反反应法相仿法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可达，其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。现在学习的是第37页，共74页2.1 2.1 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原用特异性抗原进行包被和制行包被和制备酶结合物。此法中受合物。此法中受检标本不需稀本不需稀释，可直接用于，可直接用于测定，因此其敏感度相定，因此其
21、敏感度相对高高于于间接法。乙肝接法。乙肝标志物中抗志物中抗HBsAgHBsAg的的检测常采用本法。本常采用本法。本法关法关键在于在于酶标抗原的制抗原的制备，应根据抗原根据抗原结构的不同，构的不同，寻找找合适的合适的标记方法。方法。2 2ELISAELISA的类型的类型现在学习的是第38页，共74页2.2 2.2 间接法接法测抗体抗体 传染病的染病的诊断。断。间接法的接法的优点是只要点是只要变换包被抗原就可利用包被抗原就可利用同同一一酶标抗抗体抗抗体建立建立检测相相应抗体的方法。抗体的方法。现在学习的是第39页，共74页2.3 2.3 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干当抗原材料中的干扰
22、物物质不易除去，或不易得到足不易除去，或不易得到足够的的纯化化抗原抗原时，可用此法，可用此法检测特异性抗体。特异性抗体。现在学习的是第40页，共74页2.4 2.4 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgMIgM的的检测常用于常用于传染病的染病的诊断。用抗人断。用抗人IgMIgM抗体包被固相，抗体包被固相，以捕以捕获血清血清标本中的本中的IgMIgM（其中包括（其中包括针对抗原的特异性抗原的特异性IgMIgM抗抗体和非特异性的体和非特异性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒性感染的早期此法常用于病毒性感染的早期诊断。断。现在学习的是第41页，共74页3.ELISA3.ELISA的试剂的试剂(A(
23、A、B B、C C三部分三部分)ELISA ELISA中有三个必要的中有三个必要的试剂：免疫吸附：免疫吸附剂、结合物和合物和酶的底的底物。物。（1 1）已包被抗原或抗体的固相已包被抗原或抗体的固相载体体（免疫吸附（免疫吸附剂）；）；（2 2）酶标记的抗原或抗体的抗原或抗体（结合物）；合物）；（3 3）酶的底物的底物；（4 4）阴性）阴性对照品和阳性照品和阳性对照品，参考照品，参考标准品；准品；（5 5）结合物及合物及标本的稀本的稀释液；液；（6 6）洗）洗涤液；液；（7 7）酶反反应终止液止液现在学习的是第42页，共74页ELISAELISA的试剂准备的试剂准备A A 固相固相载体体 聚苯乙聚
24、苯乙烯具有具有较强的吸附蛋白的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚聚氯乙乙烯。聚。聚氯乙乙烯对蛋白蛋白质的吸附性能比聚苯乙的吸附性能比聚苯乙烯高，但高，但空白空白值也略高。也略高。良好的良好的ELISAELISA板板应该是是吸附性能好吸附性能好，空白空白值低低，孔底透明度孔底透明度高高，各板之，各板之间、同一板各孔之、同一板各孔之间、同一板各孔之、同一板各孔之间性能相近性能相近。现在学习的是第43页，共74页现在学习的是第44页，共74页3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在将抗
25、原或抗体固定在过程称程称为包被包被(coating)(coating)。蛋白蛋白质与聚苯乙与聚苯乙烯固相固相载体是通体是通过物理吸附物理吸附结合的，靠的合的，靠的是蛋白是蛋白质分子分子结构上的疏水基构上的疏水基团与固相与固相载体表面的疏水基体表面的疏水基团间的作用。的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等的分子量、等电点、点、浓度等的影响。大分子蛋白度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白小分子蛋白质通常含有通常含有更多的更多的疏水基疏水基团，故更易吸附到固相，故更易吸附到固相载体表面。体表面。现在学习的是第45页，共74页现在学习的是第46页，共74页
26、3.1.3 3.1.3 包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙聚苯乙烯有有强吸附力，其吸附力，其联结发生在生在FcFc段上，抗体段上，抗体结合点合点暴露于外。暴露于外。取材于抗血清或含取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液克隆抗体的培养液.须除去除去杂抗体后才能用抗体后才能用于于ELISAELISA，以保，以保证试验的特异性。的特异性。腹水中腹水中单抗的抗的浓度度较高，特异性亦高，特异性亦较强，因此不需要作吸，因此不需要作吸收收层析析处理，直接包被。在某些情况下，用多种理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合抗混合包被，可取得更好的效果。包被，可取得更好的效果。现在学习的是第47页，共74页3
27、.1.43.1.4包被的条件包被的条件pH9.6pH9.6碳酸碳酸盐缓冲液冲液pH7.2pH7.2的磷酸的磷酸盐缓冲液冲液pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液。冲液。加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置冰箱中放置过夜，夜，3737中保温中保温2 2小小时。包被。包被浓度随度随载体和包被物的性体和包被物的性质可有很大的可有很大的变化，化，每批材料需通每批材料需通过实验与与酶结合物的合物的浓度度协调选定。一般蛋定。一般蛋白白质的包被的包被浓度度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。现在学习的是第48页，共74页3.1.5 3.1
28、.5 封闭封闭封封闭(blocking)(blocking)是是继包被之后用高包被之后用高浓度的无关蛋白度的无关蛋白质溶溶液再包被的液再包被的过程。封程。封闭就是就是让大量不相关的蛋白大量不相关的蛋白质充填充填这些空隙，从而排斥些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步后的步骤中干中干扰物物质的再吸附。的再吸附。常用封常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA;10%BSA;10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶;脱脱脂奶粉脂奶粉,比比较价廉，可以高价廉，可以高浓度使用（度使用（5%5%）。）。所有的所有的ELISAELISA固相均需封固相均需封闭？现在学习的是第4
29、9页，共74页3.1.6 3.1.6 洗洗涤液液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀中，常用的稀释液液为含含0.05%0.05%吐温吐温2020磷酸磷酸盐缓冲液。冲液。现在学习的是第50页，共74页ELISA的试剂准备的试剂准备B 3.2 3.2 结合物结合物 即即酶标记的抗体（或抗原）是的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关中关键的的试剂 1 1 酶的催化活性的催化活性 2 2抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性 3 3含有或少含有游离的抗体（或抗原）含有或少含有游离的抗体（或抗原）4 4结合物尚要有良好的合物尚要有良好的稳定性。定性。现在学习的是第51页，共74页现
30、在学习的是第52页，共74页3.2.1 3.2.1 结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制制备结合合物物时所所用用纯度度较高高的的IgGIgG，以以免免在在与与酶联结时其其他他杂蛋蛋白白的的干干扰。最最好好用用层析析纯化化的的抗抗体体，这样全全部部酶结合合物物均均具具有有特特异异的的免免疫疫活活性性，可可以以在在高高稀稀释度度进行行反反应，实验结果果本本底底浅浅淡淡。在在ELISAELISA中中用用酶标抗抗原原的的模模式式不不多多，总的的要要求求是是抗抗原原必必须是高是高纯度的。度的。现在学习的是第53页，共74页3.2.23.2.2酶酶纯度高，催化反度高，催化反应的的转化率高，化率高，
31、专一性一性强，性，性质稳定，来源丰富，定，来源丰富，价格不价格不贵，受，受检标本中不存在相同的本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，和保存，价格低廉，有色价格低廉，有色产物易于物易于测定等。定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷半乳糖苷酶和和脲酶等。等。HRPHRP是一种糖蛋白，含糖量是一种糖蛋白，含糖量约为18%18%，分子量，分子量为4400044000，是一种，是一种复合复合酶，由主，由主酶（酶蛋白）和蛋白）和辅基（基（亚铁血血红素）素）结合而合而成
32、，是一种成，是一种卟啉蛋白啉蛋白质。现在学习的是第54页，共74页3.2.3 3.2.3 结合物的制备结合物的制备酶标记抗体的制抗体的制备方法主要有两种，即戊二方法主要有两种，即戊二醛交交联法和法和过碘酸碘酸盐氧化法。氧化法。（1）戊二戊二醛交交联法：戊二法：戊二醛是一种双功能是一种双功能团试剂，可使，可使酶与蛋白与蛋白质的氨基通的氨基通过它而它而联结。有效（。有效（结合率达合率达60%-70%60%-70%）和）和重复性好。重复性好。交交联反反应是随机的，是随机的，结合物的大小也不均一，合物的大小也不均一，酶与与酶，抗体与抗体之抗体与抗体之间也有可能交也有可能交联，影响效果。，影响效果。（2
33、 2）过碘酸氧化法：适用含糖量碘酸氧化法：适用含糖量较高的高的酶。过碘酸碘酸钠将将HRPHRP分子表分子表面的多糖氧化面的多糖氧化为醛基很活基很活泼，可与蛋白，可与蛋白质上的氨基形成上的氨基形成chiffchiff氏碱氏碱而而结合。合。简便有效便有效.现在学习的是第55页，共74页 结合物中混有的游离合物中混有的游离酶一般不影响一般不影响ELISAELISA中最后的中最后的酶活性活性测定。定。但游离的抗体但游离的抗体则会与会与酶标抗体抗体竞争相争相应的固相抗原，因此制的固相抗原，因此制备的的酶结合物合物应予予纯化，去除游离的化，去除游离的酶和抗体后用于和抗体后用于检测，效果，效果更好。更好。制
34、得制得结合物，最适的工作合物，最适的工作浓度就是指度就是指结合物稀合物稀释至至这一一浓度度时，能，能维护一个低的本底，并一个低的本底，并获得得测定的最佳灵敏度，达定的最佳灵敏度，达到最合适的到最合适的测定条件和定条件和测定定费用的用的节省。省。现在学习的是第56页，共74页3.2.43.2.4结合物的保存结合物的保存 酶和抗体均和抗体均为生物活性物生物活性物质，易失活。高，易失活。高浓度度较为稳定，定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液合物溶液中加入等体中加入等体积的甘油，加入蛋白保的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗。另外再加入抗生素（例如生素（例如
35、庆大霉素）和防腐大霉素）和防腐剂（HRPHRP结合物加硫柳合物加硫柳泵，APAP结合物可加叠氮合物可加叠氮钠）。）。现在学习的是第57页，共74页3.2.5 3.2.5 结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀用于稀释高高浓度的度的结合物以配成工作液。合物以配成工作液。为避免避免结合物合物在反在反应中直接吸附在固相中直接吸附在固相载体上：体上：0.1%0.1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，0.05%0.05%吐温吐温20 20。试剂盒均已用合适的盒均已用合适的缓冲液配成工作液，冲液配成工作液，使用使用时不需再行稀不需再行稀释，在，在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个月。个月。现在学习的是第58
36、页，共74页试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物现在学习的是第59页，共74页现在学习的是第60页，共74页3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的氧化后的产物呈橙物呈橙红色，用酸色，用酸终止止酶反反应后，在后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结合物最常用的合物最常用的底物。底物。DH2+H2O2 D+2H2O 上式中，上式中，DH2为供氧体，供氧体，H2O2为受受氢体。体。DH2一般一般为无色化合物，无色化合物，经酶作用后成作用后成为有色的有色的产物。物。
37、DH2如：如：邻苯二胺苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基四甲基联苯胺苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS。E现在学习的是第61页，共74页TMBTMB经HRPHRP作用后共作用后共产物物显蓝色。色。TMBTMB性性质较稳定，可配成溶液定，可配成溶液试剂，只需与只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成溶液混和即成应用液。用液。酶反反应终止后，止后，TMBTMB产物由物由蓝色呈黄色，可在比色色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波中定量，最适吸收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白敏感，但空白值极低，也极低，也为一些一些试剂盒盒所
38、采用。所采用。HRPHRP对氢受体的受体的专一性很高，一性很高，仅作用于作用于H2O2H2O2、小分醇的、小分醇的过氧氧化物和尿素化物和尿素过氧化物氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。现在学习的是第62页，共74页APAP的底物的底物为磷酸磷酸酯酶，一般采用，一般采用对硝基苯磷酸硝基苯磷酸酯作作为底物。底物。产物物为黄色的黄色的对硝基酚，在硝基酚，在405nm405nm波波长处有吸收峰。有吸收峰。用用NaOHNaOH终止止酶反反应后，黄色可后，黄色可稳定一定一时间。APAP也有也有发荧光底物（磷酸光底物（磷酸4-4-甲基甲基伞酮），可用于），可用于ELISAEL
39、ISA作作荧光光测定，敏感度定，敏感度较高于用高于用显色底物的比色法。色底物的比色法。现在学习的是第63页，共74页3.5 3.5 酶反应终止液酶反应终止液常用的常用的HRPHRP反反应终止液止液为硫酸，其硫酸，其浓度按度按加量及比色液的最加量及比色液的最终体体积而异，在板式而异，在板式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。现在学习的是第64页，共74页4 4 对照设定对照设定 阳性阳性对照品照品(positive control)(positive control)和阴性和阴性对照品照品(negative(negative control)control)是是检验
40、试验有效性的控制品，同有效性的控制品，同时也作也作为判断判断结果果的的对照。照。阳性阳性对照品的基本照品的基本组成成应尽量与尽量与检测标本的本的组成相一致，多以成相一致，多以含蛋白保含蛋白保护剂的的缓冲液冲液为基基质。加入的量加入的量应与与试剂的敏感度相称；的敏感度相称；在在测定中得到的吸光定中得到的吸光值与受与受检标本吸光本吸光值比比较，可以估，可以估计标本物本物质的量。的量。现在学习的是第65页，共74页参考标准品参考标准品 定量定量测定（如甲胎蛋白定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原，癌胚抗原测定等）定等）应含有制含有制作作标准曲准曲线用的参考用的参考标准品，准品，应包括覆盖可包括覆盖可检测范范围
41、的的4-4-5 5个个浓度，一般均配入含蛋白保度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐及防腐剂的的缓冲液中冲液中.阴性阴性对照品照品须先行先行检测确定不含待确定不含待测物物质。例如。例如HBsAgHBsAg检测的阴性的阴性对照品照品中不可含中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。现在学习的是第66页，共74页5 5 标本的采取和保存标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作体液、分泌物和排泄物等均可作标本以本以测定其中某种抗体定其中某种抗体或抗原成份。或抗原成份。以血清以血清标本本为例：血例：血浆中除尚含有中除尚含有纤维蛋白原蛋白原和和抗凝抗凝剂外，外，其他成份
42、同血清。血其他成份同血清。血浆和血清可同等和血清可同等应用。用。血清血清标本本应避免溶血：避免溶血：红细胞溶解胞溶解时会会释放出具有放出具有过氧化氧化物物酶活性的物活性的物质，以，以HRPHRP为标记的的ELISAELISA测定中，可能会增定中，可能会增加非特异性加非特异性显色。色。现在学习的是第67页，共74页加样加样:在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加次加样步聚，即加步聚，即加标本，加本，加酶结合物，合物，加底物。加加底物。加样时应将所加物加在将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可孔壁上部，并注意不可溅出，不可出，不可产
43、生气泡。生气泡。基本操作注意事项基本操作注意事项现在学习的是第68页，共74页保温保温抗原抗体完成反抗原抗体完成反应的保温的保温过程称程称为温育温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫属固相免疫测定，抗原、抗体的定，抗原、抗体的结合只在固相表面上合只在固相表面上发生。生。为什么什么ELISAELISA反反应总是需要一定是需要一定时间的温育？的温育？温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）等。（冰箱温度）等。3737是是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合
44、合的合适温度。适温度。现在学习的是第69页，共74页洗涤洗涤ELSIAELSIA洗洗涤：达到分离游离的和：达到分离游离的和结合的合的酶标记物的目的。物的目的。清除残留在板孔中游离的物清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干，以及非特异性地吸附的干扰物物质。聚苯乙聚苯乙烯等塑料等塑料对蛋白蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗的吸附是普遍性的，而在洗涤时又又应把把这种非特异种非特异性吸附的干性吸附的干扰物物质洗洗涤下来。下来。现在学习的是第70页，共74页显色显色显色是色是酶催化无色的底物生成有色催化无色的底物生成有色产物的温育反物的温育反应。反。反应的温度和的温度和时间仍是影响仍是影响显色的
45、因素。在一定色的因素。在一定时间内，阴性内，阴性孔可保持无色，而阳性孔孔可保持无色，而阳性孔则随随时间的延的延长而呈色加而呈色加强。适。适当提高温度有助于加速当提高温度有助于加速显色色进行。行。现在学习的是第71页，共74页比色比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色比色仪中。中。结果以光密度（果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），），现按按规定用吸光定用吸光度（度（absorbenceabsorbence，A A），两者含），两者含义相同。相同。现在学习的是第72页，共74页6 6 结果判断结果判断 ROC曲线曲线接收者操作特征接收者操作特征（Receiver operating characteristic）现在学习的是第73页，共74页阳性阳性有有阴性阴性无无定性测定滴度（免疫效价）通过血清学方法能显示一定反应的抗体或抗血清的最高稀释倍数。如终点稀释度为1/100，滴度为100，血清的效价(每1ml的血清中抗体效价)为100抗体单位。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。现在学习的是第74页，共74页