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1、关于基因工程重组DNA导入受体细胞第一页，讲稿共九十一页哦1 1、转化概念、转化概念转转化化 ：DNA DNA 重重组组分分子子在在体体外外构构建建完完成成后后，必必须须导导入入特特定定的的受受体体细细胞胞，使使之之无无性性繁繁殖殖并并高高效效表表达达外外源源基基因因或或直直接接改改变变其其遗遗传传性性状状，这这个个导导入入过过程程及及操操作作统统称称为为重重组组 DNA DNA 分分子子的的转转化化（TransformationTransformation）。）。重重组组DNA DNA 人人工工导导入入受受体体细细胞胞有有许许多多方方法法，包包括括转转化化、转转染染、接接合合以以及及其其它它
2、物物理理手手段段，如如受受体体细细胞胞的的电电穿穿孔孔和和显显微微注注射射等等，这些导入方法在这些导入方法在 DNA DNA 重组技术中统称为转化操作。重组技术中统称为转化操作。一、重组一、重组DNADNA转化转化第二页，讲稿共九十一页哦感感受受态态：受受体体细细胞胞最最易易接接受受外外源源 DNA DNA 片片段段而而实实现现转转化化的的一一种种特特殊殊生生理理状状态态。处处于于感感受受态态的的受受体体细细菌菌，其其吸吸收收转转化化因因子子的的能能力力为为一一般般细细菌菌生生理理状状态态的的千千倍倍以以上上，而而且且不不同同细细菌菌间间的的感感受受态态差差异异往往往往受受自自身身的的遗遗传传
3、特特性性、菌菌龄龄、生生理理培培养养条条件件等诸多因素的影响。等诸多因素的影响。第三页，讲稿共九十一页哦2 2、细菌转化的步骤：、细菌转化的步骤：感感受受态态的的形形成成。感感受受态态时时细细胞胞表表面面出出现现各各种种蛋蛋白白质质和和酶酶类类，负负责责转转化化因因子子的的结结合合、切切割割及及加加工工。感感受受态态细细胞胞能能分分泌泌一一种种小小分分子子量量的的激激活活蛋蛋白白或或感感受受因因子子，其其功功能能是是与与细细胞胞表表面面受受体体结结合合，诱诱导导某某些些与与感感受受态态有有关关的的特特征征性性蛋蛋白白质质（如如细细菌菌溶溶素素）的的合合成成，使使细细菌菌胞胞壁壁部部分分溶溶解解
4、，局局部部暴暴露露出细胞膜上的出细胞膜上的 DNA DNA 结合蛋白和核酸酶等。结合蛋白和核酸酶等。转转化化因因子子的的结结合合。受受体体菌菌细细胞胞膜膜上上的的DNADNA结结合合蛋蛋白白可可与与转转化化因因子子的的双双链链DNADNA结结构构特特异异性性结结合合，单单链链DNADNA或或RNARNA双双链链RNARNA以及以及DNA/RNADNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。杂合双链都不能结合在膜上。第四页，讲稿共九十一页哦转转化化因因子子的的吸吸收收。双双链链 DNA DNA 分分子子与与结结合合蛋蛋白白作作用用后后，激激活活邻邻近近的的核核酸酸酶酶，一一条条链链被被降降解解，而而另
5、另一一条条链链则则被被吸吸收到受体菌中。收到受体菌中。整整合合复复合合物物前前体体的的形形成成。进进入入受受体体细细胞胞的的单单链链 DNA DNA 与与另另一一种种游游离离的的蛋蛋白白因因子子结结合合，形形成成整整合合复复合合物物前前体体结结构构，它它能能有有效效地地保保护护单单链链DNADNA免免受受各各种种胞胞内内核核酸酸酶酶的降解，并将其引导至受体菌染色体的降解，并将其引导至受体菌染色体DNADNA处。处。转转化化因因子子单单链链DNADNA的的整整合合。供供体体单单链链DNADNA片片段段通通过过同同源源重重组组，置置换换受受体体染染色色体体DNADNA的的同同源源区区域域，形形成成
6、异异源源杂合双链杂合双链 DNADNA结构。结构。第五页，讲稿共九十一页哦第六页，讲稿共九十一页哦二、受体细胞二、受体细胞受体细胞受体细胞(receptor cell)：又称为宿主细胞又称为宿主细胞(host cell)，是指能摄取外源，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞并使其稳定维持的细胞感受态感受态(competence)：是指细菌吸收外源是指细菌吸收外源DNA的的生理状态。生理状态。感受态细胞感受态细胞(competence cell)：是指具有接受外是指具有接受外源源DNA能力的细胞。能力的细胞。第七页，讲稿共九十一页哦1 1、原核生物细胞的优点、原核生物细胞的优点大部分原核生物
7、细胞没有纤维素组成的坚硬细大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源胞壁，便于外源DNADNA的进入。的进入。没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNADNA没有固定结合的蛋白质，没有固定结合的蛋白质，这为外源这为外源DNADNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNADNA重组减少了麻烦重组减少了麻烦基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。对引入的外源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周的实验材料，并且培养简单，繁殖迅
8、速，实验周期短，重复实验快。期短，重复实验快。第八页，讲稿共九十一页哦原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也多是无特异性空间结构的多肽链。多是无特异性空间结构的多肽链。原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。链的糖基化或磷酸化等修饰作用。原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正原核生物细胞内源性蛋白酶
9、易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。2 2、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：第九页，讲稿共九十一页哦3、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。菌、蓝细菌等。大肠杆菌受体细胞大肠杆菌受体细胞大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载是基因工程研究和应用中发展最为完善
10、和成熟的载体受体系统。体受体系统。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素可导致人体热原反应。可导致人体热原反应。第十页，讲稿共九十一页哦枯草杆菌受体细胞枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：优点：枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处
11、理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。程菌。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。遗传学背景清楚等优点。应用：已成功的用于表达人的应用：已成功的用于表达人的干扰素、白细胞
12、介素乙型干扰素、白细胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPIVPI抗原等。抗原等。第十一页，讲稿共九十一页哦蓝细菌（蓝藻）蓝细菌（蓝藻）蓝藻蓝藻又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(a(缺乏叶绿素缺乏叶绿素b)b)和藻胆素，具有光合系统和藻胆素，具有光合系统(PS)(PS)和光合系统和光合系统(PS)(PS)、能进行光合作用，但它又、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。蓝藻作为表达
13、外源基因的受体菌兼具微生物和植蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：物的优点，具体表现在：基因组为原核型，除了裸露的染色体基因组为原核型，除了裸露的染色体DNADNA外，不外，不含叶绿体含叶绿体DNADNA和线粒体和线粒体DNADNA，遗传背景简单，便于，遗传背景简单，便于基因操作和外源基因操作和外源DNADNA的检测。的检测。第十二页，讲稿共九十一页哦细细胞胞壁壁属属G G-，主主要要由由肽肽聚聚糖糖组组成成，便便于于外外源源DNADNA的转化。的转化。营营光光合合自自养养生生长长，培培养养条条件件简简单单，只只需需光光、CO2CO2、无无机盐、水和适宜的温度就能满
14、足生长需要。机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。多多种种蓝蓝藻藻含含内内源源质质粒粒，为为构构建建蓝蓝藻藻质质粒粒载载体体提提供供了了极极好的条件。好的条件。蓝蓝藻藻富富含含蛋蛋白白质质，并并且且多多数数蓝蓝藻藻无无毒毒，早早已已用用作作食食物物或或保保健健品品，在在此此基基础础上上采采用用转转基基因因技技术术，把把一一些些重重要要药药物物的的基基因因转转入入无无毒毒蓝蓝藻藻，就就可可达达到到锦锦上上添添花花的的效效果。果。第十三页，讲稿共九十一页哦4 4、真核生物细胞、真核生物细胞真菌受体细胞真菌受体细胞真真菌菌是是低低等等的的真真核核生生物物，其其基基因因结结构构、表表达达调调控控机机制
15、制以以及及蛋蛋白白质质的的加加工工与与分分泌泌都都具具有有真真核核生生物物的的特特征征，因因此此利利用用真真菌菌细细胞胞表表达达高高等等动动植植物物基基因因具具有有原原核核生生物物细细胞胞无无法法比比拟拟的的优优点。点。第十四页，讲稿共九十一页哦酵母菌酵母菌酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点酵酵母母菌菌是是结结构构最最为为简简单单的的真真核核生生物物之之一一,其其基基因因表表达达调调控控机机理理比较清楚比较清楚,遗传操作相对较为简单。遗传操作相对较为简单。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。不不含含有有特特异异性性的的病
16、病毒毒，不不产产生生毒毒素素，有有些些酵酵母母菌菌属属(如如酿酿酒酒酵酵母母)在在仪仪器器工工业业中中有有着着几几百百年年的的应应用用历历史史，属属于于安安全全型型基因工程受体系统。基因工程受体系统。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。能能将将外外源源基基因因表表达达产产物物分分泌泌至至培培养养基基中中，便便于于产产物物的的提提取和加工等。取和加工等。第十五页，讲稿共九十一页哦动物细胞动物细胞常用的动物受体细胞有常用的动物受体细胞有HelaHela细胞、猴肾细胞和细胞、猴肾细胞和中国仓鼠巢细胞中国仓鼠巢细胞(CHO)(CHO)等。等。哺乳动物细胞作为
17、受体细胞的优点是：哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的加工成成熟的RNARNA。真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰饰,产物具有较好的蛋白质免疫原性产物具有较好的蛋白质免疫原性,约为酵母细约为酵母细胞胞16-2016-20倍。倍。第十六页，讲稿共九十一页哦易被重组易被重组DNADNA质粒转染质粒转染,具有遗传稳定性和可重具有遗传稳定性和可重复性。复性。经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。中
18、，便于提纯和加工，成本低。缺点是缺点是:组织培养技术要求高，如培养和筛选组织培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的转化子一个高度扩增的转化子CHOCHO细胞，通常需要数月细胞，通常需要数月之久之久,难度较大。难度较大。第十七页，讲稿共九十一页哦目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。因治疗等。
19、常用的动物受体细胞有小鼠常用的动物受体细胞有小鼠L L细胞、细胞、HeleHele细胞细胞猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(CHO)等。以动物等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点第十八页，讲稿共九十一页哦植物受体细胞植物受体细胞优点：全能性，优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。的植株或品系。缺点：缺
20、点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组利于摄取重组DNADNA分子。分子。现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。第十九页，讲稿共九十一页哦5 5、选择受体细胞的基本原则、选择受体细胞的基本原则便于重组便于重组DNADNA分子的导入。分子的导入。便便于于重重组组体体的的筛筛选选。根根据据所所用用的的表表达达载载体体所所含含的的选选择择性性标标记记与与受受体体细细胞胞基基因因是是否否相相匹匹配配，从从而而易易
21、于对重组体进行筛选。于对重组体进行筛选。遗遗传传稳稳定定性性高高，易易于于进进行行扩扩大大培培养养或或易易于于进进行行高高密密度度发发酵酵而而不不影影响响外外源源基基因因的的表表达达效效率率。对对动动物物细细胞胞而而言言，所所选选用用的的受受体体细细胞胞具具有有对对培培养养的的适适应应性性强强，可可以以进进行行贴贴壁壁或或悬悬浮浮培培养养，可可以以在在无无血血清清培培养养基基中中进行培养。进行培养。第二十页，讲稿共九十一页哦受受体体细细胞胞内内内内源源蛋蛋白白水水解解酶酶基基因因缺缺失失或或蛋蛋白白酶酶含含量量低低，利利于于外外源源蛋蛋白白表表达达产产物物在在细细胞胞内内积积累累，可可促进外源
22、基因高效分泌表达促进外源基因高效分泌表达。安安全全性性高高，无无致致病病性性，不不会会对对外外界界环环境境造造成成生生物物污污染染。一一般般选选用用致致病病缺缺陷陷型型的的细细胞胞或或营营养养缺缺陷陷型型细胞作为受体细胞。细胞作为受体细胞。第二十一页，讲稿共九十一页哦能能使使重重组组DNADNA分分子子稳稳定定存存在在于于细细胞胞中中。从从受受体体细细胞胞的的角角度度出出发发，通通常常的的做做法法是是对对其其作作适适当当的的修修饰饰改改造造，如如选选用用某某些些限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶缺缺陷陷型型的的受受体体细细胞胞就就可以避免其对重组可以避免其对重组DNADNA分子的降解破坏作用。分
23、子的降解破坏作用。受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。具具有有较较好好的的转转译译后后加加工工机机制制等等，便便于于真真核核目目的的基基因的高效表达。因的高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。第二十二页，讲稿共九十一页哦6 6、受体细胞应具备的条件、受体细胞应具备的条件野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行
24、因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株通常应从以下几个方面加以考虑：通常应从以下几个方面加以考虑：从安全性考虑，应具备以下条件：从安全性考虑，应具备以下条件：不适合在人体内生存不适合在人体内生存不适合在非培养条件下生存不适合在非培养条件下生存在非培养条件下，其在非培养条件下，其DNADNA容易解体容易解体它的它的DNADNA不易转移不易转移它的质粒只在这一宿主由复制它的质粒只在这一宿主由复制便于检测便于检测 第二十三页，讲稿共九十一页哦从遗传性考虑：从遗传性考虑：从遗传性考虑：从遗传性考虑：重重
25、重重组组组组缺缺缺缺陷陷陷陷型型型型recArecArecArecA，用用用用于于于于基基基基因因因因扩扩扩扩增增增增或或或或高高高高效效效效表表表表达达达达的的的的受受受受体细胞（体细胞（体细胞（体细胞（recArecArecArecA-）限限限限制制制制系系系系统统统统的的的的缺缺缺缺陷陷陷陷，或或或或是是是是修修修修饰饰饰饰系系系系统统统统的的的的缺缺缺缺陷陷陷陷。避避避避免免免免对对对对外外外外源源源源DNADNADNADNA的的的的除除除除解解解解。外外外外切切切切酶酶酶酶和和和和内内内内切切切切酶酶酶酶活活活活性性性性缺缺缺缺陷陷陷陷（recBrecBrecBrecB-，recCr
26、ecCrecCrecC-，hsdRhsdRhsdRhsdR-）与与与与重重重重组组组组质质质质粒粒粒粒的的的的遗遗遗遗传传传传性性性性状状状状要要要要有有有有显显显显的的的的差差差差异异异异（具具具具有有有有与与与与载载载载体选择标记互补的表型）体选择标记互补的表型）体选择标记互补的表型）体选择标记互补的表型）具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有较高的转化效率 第二十四页，讲稿共九十一页哦限制缺陷型限制缺陷型这这是是导导致致外外源源重重组组DNADNA转转化化或或转转导导效效率率低低下下的的主主要要原原因因之之一。一。应应选选用用限限制制系系统统缺缺陷陷型型的的突突变变菌
27、菌株株作作为为受受体体细细胞胞，以以提提高高外源外源DNADNA分子的转化或转导效率。分子的转化或转导效率。进进一一步步使使修修饰饰系系统统也也发发生生缺缺陷陷，则则受受体体菌菌细细胞胞既既不不能能修修饰饰，也也不不能能限限制制外外源源DNADNA分分子子，更更便便于于重重组组DNADNA分分子子的的多种基因操作。多种基因操作。大大肠肠杆杆菌菌的的限限制制系系统统主主要要由由 hsdR hsdR 基基因因编编码码，因因此此具具有有 hsdRhsdR-遗遗传传表表型型的的大大肠肠杆杆菌菌各各株株均均丧丧失失了了降降解解外外源源DNADNA的能力，同时大大增加了外源的能力，同时大大增加了外源 DN
28、ADNA的可转化性。的可转化性。第二十五页，讲稿共九十一页哦重组缺陷型重组缺陷型进进入入野野生生型型细细胞胞的的外外源源D DN NA A分分子子能能自自发发地地与与染染色色体体D DN NA A发发 生生 的的 体体 内内 同同 源源 重重 组组 反反 应应 由由r re ec c基基 因因 家家 族族 的的 编编 码码 产产 物物 所所 控控制制。R Re ec cA A蛋蛋 白白 能能 促促 进进D DN NA A分分 子子 之之 间间 的的 同同 源源 联联 会会 和和D DN NA A单单 链链交交换换，r re ec cA A基基因因的的突突变变使使大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞内内的的
29、遗遗传传重重组组频频率降低至率降低至10106 6。大大 肠肠 杆杆 菌菌 的的 r re ec cB B、r re ec cC C 和和 r re ec cD D 基基因因分分别别编编码码不不同同分分子子量量的的多多肽肽链链，三三者者构构成成一一个个在在同同源源重重组组中中的的统统一一功功能能 单单 位位R Re ec cB BC CD D蛋蛋 白白（核核 酸酸 酶酶V V），它它 具具 有有 依依 赖赖 于于A AT TP P的的 双双 链链D D N N A A外外 切切 酶酶 和和 单单 链链 D D N N A A内内 切切 酶酶 双双 重重 活活 性性。r re ec cB B、r
30、 re ec cC C和和r re ec cD D基基因因的的突突变变也也可可以以降降低低遗遗传传重重组组的的发发生生频频率率因因 此此 受受 体体 细细 胞胞 必必 须须 选选 择择 体体 内内 同同 源源 重重 组组 缺缺 陷陷 型型 的的 遗遗 传传 表表 型型基基因因型型为为r re ec cA A-、r re ec cB B-或或r re ec cC C-等等，有有些些大大肠肠杆杆菌菌突突变变体体菌株则将三个基因同时失活。菌株则将三个基因同时失活。第二十六页，讲稿共九十一页哦转化亲和型转化亲和型可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜
31、的特异吸附性，从而提高其通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细胞。细胞的菌株作为受体菌细胞。第二十七页，讲稿共九十一页哦遗传互补型遗传互补型遗遗传传表表型型差差异异大大，可可便便于于重重组组子子的的检检测测。通通常常是是使使受受体体细细胞胞呈呈现现与与载载体体所所携携带带的的选选择择标标记记互互补补的的遗遗传传性状。方能使转化细胞的筛选成为可能。性状。方能使转化细胞的筛选成为可能。如如在在大大肠肠杆杆菌菌系系统统中中，重重组组质质粒粒载载体体上上多多含含有有AMPAMP抗抗性性标标记记基基因因，则
32、则所所选选用用的的受受体体细细胞胞应应对对这这种种抗抗生生素素敏敏感感。当当重重组组DNADNA分分子子转转入入受受体体细细胞胞后后载载体体上上的的标标记记基基因因赋赋予予受受体体细细胞胞抗抗生生素素的的抗抗性性特特征征，据据此此可可以以区区分分转转化化子子与非转化子。与非转化子。如如果果受受体体细细胞胞具具有有与与外外源源基基因因表表达达产产物物活活性性互互补补的的遗遗传传特特征可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。征可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。第二十八页，讲稿共九十一页哦感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有
33、感染和寄生效应，重组感染和寄生效应，重组 DNA DNA 分子导入这些细分子导入这些细 菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生 作用，进入生物体内，并广泛围传播，作用，进入生物体内，并广泛围传播，如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一 场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞 不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手 段制造生物武器不在此例。段制造生物武器不在此例。第二十九页，讲稿共九十一页哦第三十页，讲稿共九十一页哦三、重组三、重
34、组DNADNA导入受体细胞的方法导入受体细胞的方法转转化化(transformation):指指感感受受态态的的大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞捕捕获获质质粒粒DNA或以它为载体构建的重组质粒或以它为载体构建的重组质粒DNA分子的过程。分子的过程。转化子转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞。经转化获得外源遗传物质的细胞。转转染染(transfection):指指感感受受态态的的大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞捕捕获获噬噬菌菌体体或以它为载体构建的重组或以它为载体构建的重组DNA分子的过程分子的过程转转导导(transduction):指指病病毒毒转转移移真真核核细细胞胞DNA的的过
35、过程程或或噬噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。第三十一页，讲稿共九十一页哦基因导入受体细胞方法基因导入受体细胞方法根据转移基因方法特性可分为：根据转移基因方法特性可分为：转化转化(transformation)(transformation)转导转导(transduction)(transduction)转染转染(transfection)(transfection)微注射技术微注射技术(microinjection)(microinjection)电转化法电转化法(electroporation)(electroporation)基因枪技术基因枪技
36、术(geneblaster)(geneblaster)脂质体介导法脂质体介导法(liposome mediated transfer)(liposome mediated transfer)第三十二页，讲稿共九十一页哦根据转移基因载体与受体的特性可分为：根据转移基因载体与受体的特性可分为：质粒载体导入受体细胞的方法：质粒载体导入受体细胞的方法：CaCl2、电转化法等。、电转化法等。噬菌体转染细胞的方法：噬菌体转染细胞的方法：体外包装感染法等。体外包装感染法等。DNA导入酵母菌的方法：导入酵母菌的方法：原生质体转化、电穿孔转原生质体转化、电穿孔转化法等。化法等。DNA导入植物细胞的方法：导入植物
37、细胞的方法：Ti质粒叶盘法、电穿孔转化质粒叶盘法、电穿孔转化法、基因枪法等。法、基因枪法等。DNA导入昆虫细胞的方法：导入昆虫细胞的方法：杆状病毒感染法等。杆状病毒感染法等。DNA导入哺乳动物细胞的方法：导入哺乳动物细胞的方法：磷酸钙共沉淀法、电穿磷酸钙共沉淀法、电穿孔转化法、脂质体介导法、基因枪法等孔转化法、脂质体介导法、基因枪法等第三十三页，讲稿共九十一页哦1、氯化钙转化法、氯化钙转化法大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在基因工程研究和应用中，转化受
38、体菌细胞的正是在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是根据人们需要构建的外源重组质粒根据人们需要构建的外源重组质粒DNADNA分子而非来自分子而非来自供体菌的游离供体菌的游离DNADNA片段片段(转化因子转化因子)。因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法，因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法之一是进行转化处理，其中代表性的方法之一是CaCa2+2+诱导的大诱导的大肠杆菌转化法。肠杆菌转化法。第三十四页，讲稿共九十一页哦19701970
39、年年M.MandelM.Mandel和和A.HigeA.Hige发现发现,大肠杆菌经过大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后氯化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收便能吸收噬菌体噬菌体DNADNA。19721972年美国斯坦福大学年美国斯坦福大学 S.CohenS.Cohen报道报道,经氯化钙处理大肠杆菌细胞也经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒能摄取质粒DNADNA。第三十五页，讲稿共九十一页哦CaCa2+2+诱导转化原理：诱导转化原理：在在00的的CaclCacl2 2低低渗渗溶溶液液中中，细细菌菌细细胞胞发发生生膨膨胀胀，同同时时CaclCacl2 2使使细细胞胞膜膜磷磷脂脂层层形形
40、成成液液晶晶结结构构促促使使细细胞胞外外膜膜与与内内膜膜间间隙隙中中的的部部分分核核酸酸酶酶解解离离开开来来，诱诱导导大大肠肠杆杆菌菌形形成感受态。成感受态。CaCa2+2+能能与与加加入入的的DNADNA分分子子结结合合，形形成成抗抗DNADNA酶酶(DNase)(DNase)的的羟羟基基-磷磷酸酸钙钙复复合合物物，并并黏黏附附在在细细菌菌细细胞胞膜膜的的外外表表面面上上。当当4242热热刺刺激激短短暂暂处处理理细细菌菌细细胞胞时时，细细胞胞膜膜的的液液晶晶结结构构发发生生剧剧烈烈扰扰动动，并并随随之之出现许多间隙，为出现许多间隙，为DNADNA分子提供了进入细胞的通道。分子提供了进入细胞的
41、通道。第三十六页，讲稿共九十一页哦MgMg2+2+对对DNADNA分分子子有有很很大大的的稳稳定定性性作作用用，因因此此利利用用MgclMgcl2 2与与CaclCacl2 2共共同同处处理理大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞，可可以以提提高高DNADNA的的转转化化效效率率。如如利利用用二二甲甲基基亚亚砜砜(DMSO)(DMSO)和和二二硫硫苏苏糖糖醇醇(DDT)(DDT)等等进进一一步步处处理理细细胞胞，能能诱诱导导高高频频感感受受态态细细胞胞的的形形成成，转转化化效效率率可可提提高高10010010001000倍倍，且且对对大大小小质质粒粒分分子子均均可进行有效的转化。可进行有效的转化。但但该该法
42、法要要求求条条件件高高，对对外外界界污污染染物物极极为为敏敏感感，通通常很少采用。常很少采用。第三十七页，讲稿共九十一页哦该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化如果如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒DNA可得可得51071109个转化子。个转化子。第三十八页，讲稿共九十一页哦大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备：的制备：的制备：100100mlml菌体培养至菌体培养至菌体培养至菌体培养至OD
43、OD600 600=0.5=0.5，离心收集菌体。离心收集菌体。离心收集菌体。离心收集菌体。用用用用10 10 ml ml 冰冰冰冰冷冷冷冷的的的的75 75 mMmM CaClCaCl22溶溶溶溶液液液液悬悬悬悬浮浮浮浮菌菌菌菌体体体体，离离离离心心心心收收收收集菌体。集菌体。集菌体。集菌体。用用用用1 1 ml ml 冰冷的冰冷的冰冷的冰冷的75 75 mMmM CaClCaCl22溶液悬浮菌体。溶液悬浮菌体。溶液悬浮菌体。溶液悬浮菌体。冰浴放置冰浴放置冰浴放置冰浴放置12-2412-24小时，备用小时，备用小时，备用小时，备用 。取取取取100 100 mlml感感感感受受受受态态态态细
44、细细细胞胞胞胞，加加加加入入入入相相相相当当当当于于于于50 50 ngng载载载载体体体体的的的的重重重重组组组组DNADNADNADNA连接液，混匀。连接液，混匀。连接液，混匀。连接液，混匀。第三十九页，讲稿共九十一页哦冰浴放置半小时。冰浴放置半小时。冰浴放置半小时。冰浴放置半小时。在在在在42424242保温保温保温保温1.5 1.5 分钟（热脉冲）。分钟（热脉冲）。分钟（热脉冲）。分钟（热脉冲）。快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 1 2 2 分钟。分钟。分钟。分钟。加入加入加入加入1 1 ml m
45、l 新鲜培养基，新鲜培养基，新鲜培养基，新鲜培养基，于于于于3737培养培养培养培养 1 1 小时小时小时小时（扩增）。（扩增）。（扩增）。（扩增）。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。第四十页，讲稿共九十一页哦第四十一页，讲稿共九十一页哦获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在般在A600A600为为0.40.4左右为好。左右为好。制备受体细胞的整个过程要在制
46、备受体细胞的整个过程要在0 044进行，并尽量避进行，并尽量避免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照的受体菌免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。应该在此培养基上不生长。为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如FSBFSB溶液。溶液。第四十二页，讲稿共九十一页哦第四十三页，讲稿共九十一页哦CaCl2CaCl2法制备感受态细胞转化法制备感受态细胞转化DNADNA时，低温的主要目的是时，低温的主要目的是:（1 1）抑制细胞的旺盛生理代谢。）抑制细胞的旺盛生理代谢。（2 2）有助于）有助于DNA-Ca2+DNA-Ca2+吸附
47、于细胞表面。吸附于细胞表面。（3 3）防止）防止DNAaseDNAase降解降解DNADNA。热休克温度是热休克温度是4242。目的是使细胞摄入吸附于其表面的。目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNADNA。第四十四页，讲稿共九十一页哦转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此须设以下几种对照处理：化子的出现，因此须设以下几种对照处理：DNADNA对照处理。转化处理液中用对照处理。转化处理液中用0.2ml0.2ml无菌水代替无菌水代替0.2m10.2m1感受态细胞，检验感受态细胞，检验DNADNA溶液是否染菌。溶液是否染菌。感受态细胞对照处
48、理。转化处理液中用感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE0.1mlNTE缓冲液缓冲液(500mM NaCl(500mM NaCl，10mM Tris-HCl10mM Tris-HCl，1mMEDTA1mMEDTApH8.0)pH8.0)代替代替0.1m1DNA0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染溶液，检验感受态细胞是否染菌。菌。感受态细胞有效性对照处理。在感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml0.2ml感受态细感受态细胞中加入胞中加入0.1ml0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质已知容易转化这种感受态细胞的质粒粒DNADNA。第四十五页，讲稿共九十一页哦2 2、PEGPE
49、G介导的细菌原生质体转化介导的细菌原生质体转化介导的细菌原生质体转化介导的细菌原生质体转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNADNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒
50、或重组质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNADNA分子分子分子分子 。酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化原生质体法进行转化原生质体法进行转化原生质体法进行转化。第四十六页，讲稿共九十一页哦PEGPEG是乙二醇的多聚物是乙二醇的多聚物,存在不同分子量的多聚体存在不同分子量的多聚体,它可它可改变各类细胞的膜结构改变各类细胞的膜结构,使两细胞相互接触部位的膜使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细此时相互接触的两细胞的胞质沟通