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1、关于基因工程重组DNA导入受体细胞现在学习的是第1页，共91页1 1、转化概念、转化概念转化转化 ：DNA DNA 重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA DNA 分子的转化（分子的转化（TransformationTransformation）。）。重组重组DNA DNA 人工导入受体细胞有许多方法，包括人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转转化、转染、接合染、接
2、合以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔和显以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔和显微注射等，这些导入方法在微注射等，这些导入方法在 DNA DNA 重组技术中统称为转化重组技术中统称为转化操作。操作。一、重组一、重组DNADNA转化转化现在学习的是第2页，共91页感受态：感受态：受体细胞最易接受外源受体细胞最易接受外源 DNA DNA 片段而实现转化的一片段而实现转化的一种特殊生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因种特殊生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的
3、间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养遗传特性、菌龄、生理培养条件条件等诸多因素的影响。等诸多因素的影响。现在学习的是第3页，共91页2 2、细菌转化的步骤：、细菌转化的步骤：感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，受态有关的特征性蛋白
4、质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的 DNA DNA 结合蛋白和核酸酶等。结合蛋白和核酸酶等。转化因子的结合。受体菌细胞膜上的转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNADNA结合蛋白可与结合蛋白可与转化因子的双链转化因子的双链DNADNA结构特异性结合，单链结构特异性结合，单链DNADNA或或RNARNA双双链链RNARNA以及以及DNA/RNADNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。杂合双链都不能结合在膜上。现在学习的是第4页，共91页转化因子的吸收。双链转化因子的吸收。双链 DNA DNA 分子与结合蛋白作用分子与结合蛋白作用
5、后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中。则被吸收到受体菌中。整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链体结构，它能有效地保护单链DNADNA免受各种胞内核免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNADNA处。处。转化因子单链转化因子单链DNADNA的整合。供体单链的整合。供体单链DNADNA片段通过同片段通过
6、同源重组，置换受体染色体源重组，置换受体染色体DNADNA的同源区域，形成异源杂的同源区域，形成异源杂合双链合双链 DNADNA结构。结构。现在学习的是第5页，共91页现在学习的是第6页，共91页二、受体细胞二、受体细胞受体细胞受体细胞(receptor cell)：又称为宿主细胞又称为宿主细胞 (host cell)，是指能摄取外源，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞并使其稳定维持的细胞感受态感受态(competence)：是指细菌吸收外源是指细菌吸收外源DNA的的生理状态。生理状态。感受态细胞感受态细胞(competence cell)：是指具有接受外是指具有接受外源源DNA能力的细
7、胞。能力的细胞。现在学习的是第7页，共91页1 1、原核生物细胞的优点、原核生物细胞的优点大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源胞壁，便于外源DNADNA的进入。的进入。没有核膜，染色体没有核膜，染色体DNADNA没有固定结合的蛋白质，没有固定结合的蛋白质，这为外源这为外源DNADNA与裸露的染色体与裸露的染色体DNADNA重组减少了麻烦重组减少了麻烦基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。对引入的外源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性原核生物多
8、数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。期短，重复实验快。现在学习的是第8页，共91页原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也多是无特异性空间结构的多肽链。多是无特异性空间结构的多肽链。原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化
9、等修饰作用。链的糖基化或磷酸化等修饰作用。原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。2 2、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：现在学习的是第9页，共91页3、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。菌、蓝细菌等。大肠杆菌受体细胞大肠杆菌受体细胞大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也最为详尽、
10、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。体受体系统。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素可导致人体热原反应。可导致人体热原反应。现在学习的是第10页，共91页枯草杆菌受体细胞枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：优点：枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有表达的产枯草杆菌具有胞外酶分泌调节基因，能将具有
11、表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。程菌。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调
12、控、分子遗传学背景清楚等优点。遗传学背景清楚等优点。应用：已成功的用于表达人的应用：已成功的用于表达人的干扰素、白细胞介素乙型干扰素、白细胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPIVPI抗原等。抗原等。现在学习的是第11页，共91页蓝细菌（蓝藻）蓝细菌（蓝藻）蓝藻蓝藻又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(a(缺乏叶绿素缺乏叶绿素b)b)和藻胆素，具有光合系统和藻胆素，具有光合系统(PS)(PS) 和光合系统和光合系统(PS)(PS)、能进行光合作用，但它又、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞具有细
13、菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：物的优点，具体表现在：基因组为原核型，除了裸露的染色体基因组为原核型，除了裸露的染色体DNADNA外，不外，不含叶绿体含叶绿体DNADNA和线粒体和线粒体DNADNA，遗传背景简单，便于，遗传背景简单，便于基因操作和外源基因操作和外源DNADNA的检测。的检测。现在学习的是第12页，共91页细胞壁属细胞壁属G G- -，主要由肽聚糖组成，便于外源，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA
14、DNA的转的转化。化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。好的条件。蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。花的效果。现在学习的是第
15、13页，共91页4 4、真核生物细胞、真核生物细胞真菌受体细胞真菌受体细胞真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。点。现在学习的是第14页，共91页酵母菌酵母菌酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点酵母菌作为外源真核基因表达系统的优点酵母菌是结构最为简单的真核生物之一酵母菌是结构最为简单的真核生物之一, ,其基因表达调控机其基因表达
16、调控机理比较清楚理比较清楚, ,遗传操作相对较为简单。遗传操作相对较为简单。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属( (如如酿酒酵母酿酒酵母) )在仪器工业中有着几百年的应用历史，属于安在仪器工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统。全型基因工程受体系统。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工等。和加工等。现在学习
17、的是第15页，共91页动物细胞动物细胞常用的动物受体细胞有常用的动物受体细胞有HelaHela细胞、猴肾细胞和细胞、猴肾细胞和中国仓鼠巢细胞中国仓鼠巢细胞(CHO)(CHO)等。等。哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的加工成成熟的RNARNA。真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修真核基因表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰饰, ,产物具有较好的蛋白质免疫原性产物具有较好的蛋白质免疫原性, ,约为酵母细约为酵母细胞胞16-2016-20倍。倍。现在学习的是第16页，共91
18、页易被重组易被重组DNADNA质粒转染质粒转染, ,具有遗传稳定性和可重具有遗传稳定性和可重复性。复性。经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。中，便于提纯和加工，成本低。缺点是缺点是: :组织培养技术要求高，如培养和筛选组织培养技术要求高，如培养和筛选一个高度扩增的转化子一个高度扩增的转化子CHOCHO细胞，通常需要数月细胞，通常需要数月之久之久, ,难度较大。难度较大。现在学习的是第17页，共91页目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用牛、
19、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。因治疗等。常用的动物受体细胞有小鼠常用的动物受体细胞有小鼠L L细胞、细胞、HeleHele细胞细胞猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(CHO)等。以动物等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点现在学习的是第18页，共91页植物受体细胞植物受体细胞优点：全能性，优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的
20、培即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。或品系。 缺点：缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组，不利于摄取重组DNADNA分子。分子。现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。 现在学习的是第19页，共91页5 5、选择受体细胞的基本原则、
21、选择受体细胞的基本原则便于重组便于重组DNADNA分子的导入。分子的导入。便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。行筛选。遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基
22、中进行培养。或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。 现在学习的是第20页，共91页受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达促进外源基因高效分泌表达。安全性高，安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生无致病性，不会对外界环境造成生物污染物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。型细胞作为受体细胞。现在学习的是第21页，共91页能使重组能使重组DNADNA分子稳定存在于细胞中。从受体细胞分
23、子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是对其作适当的修饰改造，的角度出发，通常的做法是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组可以避免其对重组DNADNA分子的降解破坏作用。分子的降解破坏作用。受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的具有较好的转译后加工机制等，便于真核目的基因的高效表达。高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。现在学习的是第22页，共91页
24、6 6、受体细胞应具备的条件、受体细胞应具备的条件野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具野生型的大肠杆菌不是理想的受体细胞，因为自身具有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性有的限制和修饰系统，另外还可能存在潜在的致病性因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行因此必须通过适当的诱变手段对野生型大肠杆菌进行遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株遗传性状改造，以获得适宜作为受体细胞的突变菌株通常应从以下几个方面加以考虑：通常应从以下几个方面加以考虑：从安全性考虑，应具备以下条件：从安全性考虑，应具备以下条件：不适合在人体内生存不适合在人体内生存不适合在非培养条件下生存不
25、适合在非培养条件下生存在非培养条件下，其在非培养条件下，其DNADNA容易解体容易解体它的它的DNADNA不易转移不易转移它的质粒只在这一宿主由复制它的质粒只在这一宿主由复制便于检测便于检测 现在学习的是第23页，共91页从遗传性考虑：从遗传性考虑：重组缺陷型重组缺陷型recArecA，用于基因扩增或高效表达的受体细用于基因扩增或高效表达的受体细胞（胞（recArecA- -）限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源DNADNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷（的除解。外切酶和内切酶活性缺陷（recBrecB- -，recCrecC- -，hs
26、dRhsdR- -） 与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型）择标记互补的表型）具有较高的转化效率具有较高的转化效率 现在学习的是第24页，共91页限制缺陷型限制缺陷型这是导致外源重组这是导致外源重组DNADNA转化或转导效率低下的主要原因转化或转导效率低下的主要原因之一。之一。应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高应选用限制系统缺陷型的突变菌株作为受体细胞，以提高外源外源DNADNA分子的转化或转导效率。分子的转化或转导效率。进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既不进一步使修饰系统也发生缺陷，则受体菌细胞既
27、不能修饰，也不能限制外源能修饰，也不能限制外源DNADNA分子，更便于重组分子，更便于重组DNADNA分子分子的多种基因操作。的多种基因操作。大肠杆菌的限制系统主要由大肠杆菌的限制系统主要由 hsdR hsdR 基因编码，因此具有基因编码，因此具有 hsdRhsdR- - 遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了降解外源遗传表型的大肠杆菌各株均丧失了降解外源DNADNA的能力，同时大大增加了外源的能力，同时大大增加了外源 DNADNA的可转化性。的可转化性。现在学习的是第25页，共91页重组缺陷型重组缺陷型进 入 野 生 型 细 胞 的 外 源进 入 野 生 型 细 胞 的 外 源D N AD N A分
28、 子 能 自 发 地 与 染 色 体分 子 能 自 发 地 与 染 色 体D N AD N A发 生 的 体 内 同 源 重 组 反 应 由发 生 的 体 内 同 源 重 组 反 应 由r e cr e c 基 因 家 族 的 编 码 产 物 所 控基 因 家 族 的 编 码 产 物 所 控制。制。RecARecA蛋白能促进蛋白能促进DNADNA分子之间的同源联会和分子之间的同源联会和DNADNA单链单链交换，交换，recArecA基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频基因的突变使大肠杆菌细胞内的遗传重组频率降低至率降低至10106 6。大肠杆菌的大肠杆菌的 recBrecB、recC rec
29、C 和和 recD recD 基因分别编码不同基因分别编码不同分 子 量 的 多 肽 链 ， 三 者 构 成 一 个 在 同 源 重 组 中 的 统 一 功分 子 量 的 多 肽 链 ， 三 者 构 成 一 个 在 同 源 重 组 中 的 统 一 功能 单 位能 单 位RecBCDRecBCD蛋白（核酸酶蛋白（核酸酶V V），它具有依赖于），它具有依赖于ATPATP的双链的双链DNADNA外切酶和单链外切酶和单链 DNADNA内切酶双重活性。内切酶双重活性。recBrecB、recCrecC和和recDrecD基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率基因的突变也可以降低遗传重组的发生频率因此受体
30、细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型基因型为基因型为recArecA- -、recBrecB- -或或recCrecC- -等，有些大肠杆菌突变体等，有些大肠杆菌突变体菌株则将三个基因同时失活。菌株则将三个基因同时失活。 现在学习的是第26页，共91页转化亲和型转化亲和型可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的可以利用遗传诱变技术改变受体菌细胞壁的通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其通透性及细胞膜的特异吸附性，从而提高其转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态转化效率。还可以选择能够诱导形成感受态细胞的菌株作为受体菌细胞。细胞的菌株作为受体菌细
31、胞。现在学习的是第27页，共91页遗传互补型遗传互补型遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使受体遗传表型差异大，可便于重组子的检测。通常是使受体细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。方细胞呈现与载体所携带的选择标记互补的遗传性状。方能使转化细胞的筛选成为可能。能使转化细胞的筛选成为可能。如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有如在大肠杆菌系统中，重组质粒载体上多含有AMPAMP抗性抗性标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏标记基因，则所选用的受体细胞应对这种抗生素敏感。当重组感。当重组DNADNA分子转入受体细胞后载体上的标记基分子转入受体细胞后载体上的标记基因赋予受体细胞
32、抗生素的抗性特征，据此可以区分转因赋予受体细胞抗生素的抗性特征，据此可以区分转化子与非转化子。化子与非转化子。如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的如果受体细胞具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征可以直接筛选到外源基因表达的转化细遗传特征可以直接筛选到外源基因表达的转化细胞。胞。 现在学习的是第28页，共91页感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有相当多的细菌对其它生物尤其是人和牲畜具有 感染和寄生效应，重组感染和寄生效应，重组 DNA DNA 分子导入这些细分子导入这些细 菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生菌受体中后，极有可能随着受体菌的感染寄生
33、 作用，进入生物体内，并广泛围传播，作用，进入生物体内，并广泛围传播，如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一如果外源基因对人体和牲畜有害，则会导致一 场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞场灾难，因此从安全的角度上考虑，受体细胞 不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手不能具有感染寄生性，当然，利用基因工程手 段制造生物武器不在此例。段制造生物武器不在此例。现在学习的是第29页，共91页现在学习的是第30页，共91页三、重组三、重组DNADNA导入受体细胞的方法导入受体细胞的方法转化转化(transformation):指感受态的大肠杆菌细胞捕获质粒指感受态的大肠杆菌细胞捕获质粒DNA或以
34、它为载体构建的重组质粒或以它为载体构建的重组质粒DNA分子的过程。分子的过程。转化子转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞。经转化获得外源遗传物质的细胞。转染转染(transfection):指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬菌体或以指感受态的大肠杆菌细胞捕获噬菌体或以它为载体构建的重组它为载体构建的重组DNA分子的过程分子的过程转导转导(transduction):指病毒转移真核细胞指病毒转移真核细胞DNA的过程或噬的过程或噬菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。菌体介导的细菌细胞之间基因转移的过程。现在学习的是第31页，共91页基因导入受体细胞方法基因导入受体细胞方法根
35、据转移基因方法特性可分为：根据转移基因方法特性可分为：转化转化(transformation)(transformation)转导转导(transduction)(transduction)转染转染(transfection)(transfection)微注射技术微注射技术(microinjection)(microinjection)电转化法电转化法(electroporation)(electroporation)基因枪技术基因枪技术(geneblaster)(geneblaster)脂质体介导法脂质体介导法(liposome mediated transfer)(liposome med
36、iated transfer)现在学习的是第32页，共91页根据转移基因载体与受体的特性可分为：根据转移基因载体与受体的特性可分为：质粒载体导入受体细胞的方法：质粒载体导入受体细胞的方法：CaCl2、电转化法等。、电转化法等。噬菌体转染细胞的方法：噬菌体转染细胞的方法：体外包装感染法等。体外包装感染法等。DNA导入酵母菌的方法：导入酵母菌的方法：原生质体转化、电穿孔转化法原生质体转化、电穿孔转化法等。等。DNA导入植物细胞的方法：导入植物细胞的方法：Ti质粒叶盘法、电穿孔转质粒叶盘法、电穿孔转化法、基因枪法等。化法、基因枪法等。DNA导入昆虫细胞的方法：导入昆虫细胞的方法：杆状病毒感染法等。杆
37、状病毒感染法等。DNA导入哺乳动物细胞的方法：导入哺乳动物细胞的方法：磷酸钙共沉淀法、电穿磷酸钙共沉淀法、电穿孔转化法、脂质体介导法、基因枪法等孔转化法、脂质体介导法、基因枪法等现在学习的是第33页，共91页1、氯化钙转化法、氯化钙转化法大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在基因工化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是根据人们需要程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是根据人们需要构建的外源重组质粒构建的外源重组质粒DNADNA分子而非来自供体菌的游离分
38、子而非来自供体菌的游离DNADNA片片段段( (转化因子转化因子) )。因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然，通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法之一是后进行转化处理，其中代表性的方法之一是CaCa2+2+诱导的大诱导的大肠杆菌转化法。肠杆菌转化法。现在学习的是第34页，共91页19701970年年M.MandelM.Mandel和和A.HigeA.Hige发现发现, ,大肠杆菌经过大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后氯化钙适当处理
39、及短暂热休克之后, ,便能吸便能吸收收噬菌体噬菌体DNADNA。19721972年美国斯坦福大学年美国斯坦福大学 S.CohenS.Cohen报道报道, ,经氯化钙处理大肠杆菌细胞也经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒能摄取质粒DNADNA。现在学习的是第35页，共91页CaCa2+2+诱导转化原理：诱导转化原理：在在00的的CaclCacl2 2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaclCacl2 2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感膜间隙中的部分核酸酶解离开来
40、，诱导大肠杆菌形成感受态。受态。CaCa2+2+能与加入的能与加入的DNADNA分子结合，形成抗分子结合，形成抗DNADNA酶酶(DNase)(DNase)的羟基的羟基- -磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当表面上。当4242热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为为DNADNA分子提供了进入细胞的通道。分子提供了进入细胞的通道。 现在学习的是第36页，共91页MgMg2+2+对对DNADNA分子有很大的稳定性作用，因此利用分子有很大
41、的稳定性作用，因此利用MgclMgcl2 2与与CaclCacl2 2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNADNA的转化效的转化效率。如利用二甲基亚砜率。如利用二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)和二硫苏糖醇和二硫苏糖醇(DDT)(DDT)等进等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高效率可提高10010010001000倍，且对大小质粒分子均可进行倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。有效的转化。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。采用
42、。 现在学习的是第37页，共91页该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化如果感受如果感受态细胞做得好，每微克超螺旋质粒态细胞做得好，每微克超螺旋质粒DNA可得可得51071109个转化子。个转化子。现在学习的是第38页，共91页大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备：100ml菌体培养至菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体。离心收集菌体。 用用10 ml 冰冷的冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集溶液悬浮菌体，离心收集菌体。菌体。用用1 ml
43、 冰冷的冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体。溶液悬浮菌体。 冰浴放置冰浴放置12 - 24小时，备用小时，备用 。取取100 ml感受态细胞，加入相当于感受态细胞，加入相当于50 ng载体的重组载体的重组DNADNA连接液，混匀。连接液，混匀。现在学习的是第39页，共91页冰浴放置半小时。冰浴放置半小时。 在在4242保温保温1.5 分钟（热脉冲）。分钟（热脉冲）。 快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 2 分钟。分钟。 加入加入1 ml 新鲜培养基，新鲜培养基，于于37培养培养 1 小时（小时（扩增）。扩增）。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。涂在合适的固体
44、培养基平板上进行筛选。 现在学习的是第40页，共91页现在学习的是第41页，共91页获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：获得合格的感受态细胞，要注意以下几点：用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在般在A600A600为为0.40.4左右为好。左右为好。制备受体细胞的整个过程要在制备受体细胞的整个过程要在0 044进行，并尽量避免进行，并尽量避免污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照的受体菌应该在污染。如果用抗生素筛选转化子，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。此培养基上不生长。为了提高转化率，可选用复合氯化钙溶液，如为了提高转化率，可
45、选用复合氯化钙溶液，如FSBFSB溶液。溶液。现在学习的是第42页，共91页现在学习的是第43页，共91页CaCl2CaCl2法制备感受态细胞转化法制备感受态细胞转化DNADNA时，低温的主要目的时，低温的主要目的是是: :（1 1）抑制细胞的旺盛生理代谢。）抑制细胞的旺盛生理代谢。（2 2）有助于）有助于DNA-Ca2+DNA-Ca2+吸附于细胞表面。吸附于细胞表面。（3 3）防止）防止DNAaseDNAase降解降解DNADNA。热休克温度是热休克温度是4242。目的是使细胞摄入吸附于其表面。目的是使细胞摄入吸附于其表面的的DNADNA。现在学习的是第44页，共91页转化处理过程中，可能感
46、染杂菌，导致假阳性转转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此须设以下几种对照处理：化子的出现，因此须设以下几种对照处理：DNADNA对照处理。转化处理液中用对照处理。转化处理液中用0.2ml0.2ml无菌水代替无菌水代替0.2m10.2m1感受态细胞，检验感受态细胞，检验DNADNA溶液是否染菌。溶液是否染菌。感受态细胞对照处理。转化处理液中用感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE0.1mlNTE缓冲液缓冲液(500mM NaCl(500mM NaCl，10mM Tris-HCl10mM Tris-HCl，1mMEDTA1mMEDTApH8.0)pH8.0)代替代
47、替0.1m1DNA0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染溶液，检验感受态细胞是否染菌。菌。感受态细胞有效性对照处理。在感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml0.2ml感受态细感受态细胞中加入胞中加入0.1ml0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质已知容易转化这种感受态细胞的质粒粒DNADNA。 现在学习的是第45页，共91页2、PEG介导的细菌原生质体转化介导的细菌原生质体转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形
48、态）转化的方法转移质粒或重组胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子分子 。酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化原生质体法进行转化。现在学习的是第46页，共91页PEGPEG是乙二醇的多聚物是乙二醇的多聚物, , 存在不同分子量的多聚体存在不同分子量的多聚体, ,它可改它可改变各类细胞的膜结构变各类细胞的膜结构, , 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组脂类分子发生疏散和重组, ,此时相互接触的两细胞的胞质沟通此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能成为可能, ,从而造成细胞之间发生融合。从而造成细
49、胞之间发生融合。现在学习的是第47页，共91页细菌原生质体细菌原生质体的制备：的制备：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在例：细菌需生长在高渗培养基高渗培养基中（如中（如34%的蔗糖溶液）的蔗糖溶液），并加入，并加入甘氨酸甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶的蔗糖等渗溶液液中。与原生质体接触的所有器皿应保持中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂无水无去污剂。 现在学习的是第48页，共91页细菌原生
50、质体细菌原生质体的转化：的转化：取取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（的原生质体悬浮液（10108 8-10-109 9个原生质体），个原生质体），加入加入10 - 20 m ml DNA重组连接液，同时加入含有重组连接液，同时加入含有PEG1000和和Ca2+的等渗溶液，混匀。的等渗溶液，混匀。 细菌原生质体细菌原生质体的再生的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。现在学习的是第49页，共91页3 3、电转化、电转化电转化又称电穿