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1、基因工程的基本操作程序课件新人教选修第一页，讲稿共四十六页哦基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定第二页，讲稿共四十六页哦一、目的基因的获取一、目的基因的获取(一一)、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2
2、 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段第三页，讲稿共四十六页哦1.目的基因的获取目的基因的获取（1 1）直直接接从从生生物物体体中中提提取取总总DNADNA，构构建建基基 因因 组组 DNADNA文文 库库(genomic(genomic DNA DNA library)library)，从中调用目的基因；，从中调用目的基因；第四页，讲稿共四十六页哦 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建 将将总总DNADNA经经过过酶酶解解，分分离离不不同同长长短短的的DNADNA片片段段。包包含含的的基基因因组组片片段段分分
3、别别克克隆隆在在质质粒粒或或噬噬菌菌体体载载体体上上，转转染染细细菌菌或或体体外外包包装装到到噬噬菌菌体体颗颗粒粒上上便便构构成成了了该该生生物物的的基基因因组组文库。文库。第五页，讲稿共四十六页哦基因组文库的构建基因组文库的构建（2 2）.基因文库的构建方法基因文库的构建方法通过对受通过对受体菌的培体菌的培养而储存养而储存基因基因第六页，讲稿共四十六页哦 cDNA文库的构建文库的构建-反转录法：反转录法：以目的基因转录以目的基因转录成的信使成的信使RNARNA为模板，为模板，反转录成互补的单反转录成互补的单链链DNADNA，然后在酶的，然后在酶的作用下合成双链作用下合成双链DNADNA，从而
4、获得所需的基，从而获得所需的基因。因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(目的基因目的基因)第七页，讲稿共四十六页哦第八页，讲稿共四十六页哦cDNA(cDNA(互补互补DNA)DNA)：是由生物的某一特定器官或特是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体经体外反转录后形成的互补外反转录后形成的互补DNADNA片片段，与载体连接后储存在一段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的群就叫做这种生物的cDNAcDNA文文库库 2)c
5、DNA2)cDNA文库文库 (cDNA library(cDNA library)基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA第九页，讲稿共四十六页哦1 1、原核细胞的基因结构、原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位，有了它才能，有了它才能驱动基因驱动基因转录出转录出mRNAmRNA，最
6、终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录的转录第十页，讲稿共四十六页哦不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基基因结因结构构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列苷酸序列.包括启动子和终止子包括启动子和终止子非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动
7、子启动子终止子终止子第十一页，讲稿共四十六页哦2 2、真核细胞的基因结构、真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：第十二页，讲稿共四十六页哦原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由
8、能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的3 3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第十三页，讲稿共四十六页哦基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较第十四页，讲稿共四十六页哦怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢?第十五页，讲稿共四十六页哦依据：目的基因的有关信息。依据：目的基
9、因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中得到目的基因的方法从基因文库中得到目的基因的方法第十六页，讲稿共四十六页哦2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第十七页，讲稿共四十六页哦 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_、_ _、_等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（
10、n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）第十八页，讲稿共四十六页哦过程：过程：a a、高温变性、高温变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（
11、复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链第十九页，讲稿共四十六页哦第二十页，讲稿共四十六页哦3、人工合成法：、人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以基因较小，核苷酸序列已知，可以利用利用DNA合成仪人工合成合成仪人工合成第二十一页，讲稿共四十六页哦二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建4 4、切割质粒和目的基因的限制性内切
12、酶、切割质粒和目的基因的限制性内切酶 是否要求一样？为什么是否要求一样？为什么？2 2、表达载体至少带有哪些结构？各有什、表达载体至少带有哪些结构？各有什 么作用？么作用？思考：思考：3 3、构建表达载体时需要哪些工具？、构建表达载体时需要哪些工具？1 1、这步是基因工程的核心，构建基因、这步是基因工程的核心，构建基因 表达载体的目的是什么？表达载体的目的是什么？核心核心第二十二页，讲稿共四十六页哦二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：所需物质：所需物质：使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定稳定存在，并存在，并且可以且可以遗传遗
13、传给下一代，同时使目的基因给下一代，同时使目的基因能够能够表达表达和和发挥发挥作用。作用。它们各自的它们各自的作用是什么作用是什么?第二十三页，讲稿共四十六页哦n启动子启动子：位于基因首端，：位于基因首端，nRNA聚合酶识别和结合聚合酶识别和结合 部位，启动转录部位，启动转录n终止子终止子：位于基因尾端，：位于基因尾端，终止转录终止转录n标记基因标记基因：鉴别受体细胞：鉴别受体细胞 内是否含目的基因，内是否含目的基因，从而将有目的基因从而将有目的基因 的细胞筛选出来的细胞筛选出来n目的基因目的基因：外源：外源DNA分子的有效分子的有效片段。片段。第二十四页，讲稿共四十六页哦1.1.用一定的用一
14、定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同(二二).).过程过程第二十五页，讲稿共四十六页哦载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分制原点两部
15、分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达必需以表达载体的方式携带进去。载体的方式携带进去。注意注意第二十六页，讲稿共四十六页哦三、目
16、的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞1 1、导入植物细胞常用的方法是什么？、导入植物细胞常用的方法是什么？原理是什么？具体过程是怎样的？原理是什么？具体过程是怎样的？3 3、导入大肠杆菌的方法是怎样的？、导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？钙离子有什么作用？2 2、导入动物细胞常用的方法是什么？、导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？基本操作程序是怎样的？第二十七页，讲稿共四十六页哦三将目的基因导入受体细胞三将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：（二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目
17、的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受受体细胞内维持体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达第二十八页，讲稿共四十六页哦1.目的基因导入植物细胞：目的基因导入植物细胞：目的基因进入受体目的基因进入受体细胞内，在受体细胞细胞内，在受体细胞内维持内维持稳定稳定和和表达表达的的过程过程A.转化的概念：转化的概念：B.B.农杆菌的特点农杆菌的特点 农杆菌易感双子叶和裸子植物，对大多数单子叶植物没农杆菌易感双子叶和裸子植物
18、，对大多数单子叶植物没有感染能力有感染能力(1)农杆菌转化法农杆菌转化法C、原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNA上上。第二十九页，讲稿共四十六页哦（2 2）过程）过程目的基因插入到目的基因插入到_,构建构建_,_菌菌 _细胞细胞 整合到整合到 _细胞的细胞的_上上,_.转入转入侵染侵染 优点优点:比较经济和有效比较经济和有效第三十页，讲稿共四十六页哦（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法第三十一页，讲稿共四十六页哦2.目的基因导入动物细胞（）方法（）方法:显微注射技术显微注射技术（
19、）基本操作程序：（）基本操作程序：含有目的基因的表达载体含有目的基因的表达载体_显微注射显微注射受精卵移植到雌性动物体的，受精卵移植到雌性动物体的，输卵管或输卵管或子宫内子宫内提纯提纯取卵取卵（）受精卵受精卵使发育成为具新现状的动物使发育成为具新现状的动物第三十二页，讲稿共四十六页哦3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少()最常用的原核细胞最常用的原核细胞_（）转化方法（）转化方法:第一步：用第一步：用 _处理细胞，使细胞处于一
20、种能吸收处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中周围环境中DNADNA分子的状态（分子的状态（_细胞）细胞）第二步：将溶于第二步：将溶于_缓冲液中与细胞混合，在缓冲液中与细胞混合，在一定温度下促进一定温度下促进_细胞吸收细胞吸收DNADNA分子，完成转化过程分子，完成转化过程表达载体表达载体感受态感受态感受态感受态感受态感受态Ca2+第三十三页，讲稿共四十六页哦方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感
21、受态细胞三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞第三十四页，讲稿共四十六页哦(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插上是否插入了目的基因入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交法分子杂交法 分子杂交技术分子杂交技术抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法分子水平的检测分子水平的检测第三十五页，讲稿共四十六页哦1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的
22、DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作标记作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出若显示出杂交带杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交幻灯幻灯片片 3737（2）过程）过程:第三十六页，讲稿共四十六页哦DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA
23、分子分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。是两条游离的单链。P P1515思考与探究思考与探究第三十七页，讲稿共四十六页哦基因探针（基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交探针）与目的基因杂交，有无杂交带带第三十八页，讲稿共四十六页哦2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、
24、检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出若出现杂交带现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA第三十九页，讲稿共四十六页哦检测二：个体生物学水平的鉴定检测二：个体生物学水平的鉴定 用棉铃饲喂棉铃虫，如用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。入了抗虫基因并得到表达。鉴定鉴
25、定抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等第四十页，讲稿共四十六页哦归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：第四十一页，讲稿共四十六页哦练习练习1：(20
26、08理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的分子所用的限制性内切酶作用于图中的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶连接酶作用于作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”）第四十二页，讲稿共四十六页哦1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （）A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的
27、核核苷苷酸酸序序列列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个个限制酶切点，以便与外源基因连接限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C练习练习第四十五页，讲稿共四十六页哦3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A A练习练习第四十六页，讲稿共四十六页哦