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1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤：目的基因的目的基因的获取获取基因表达载体的基因表达载体的构建构建将目的基因将目的基因导入导入受体细胞受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定限制酶限制酶基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取基因组文库基因组文库（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取1.1.基因文库基因文库基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNA2.2.部分基因文库部分基因文库（二）利用（二）利用PCR
2、扩增目的基因扩增目的基因1 1、过程、过程高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸适温延伸（在在TaqTaq酶酶的作用下合成的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环1 1、过程、过程（二）利用（二）利用PCR扩增目的基因扩增目的基因（二）利用（二）利用PCR扩增目的基因扩增目的基因2 2、条件、条件已知基因的核苷酸序列、已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、引物引物TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地
3、扩增4 4、结果、结果耐高温耐高温3 3、方式：、方式：以以指数指数方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）2 2n n适宜的温度和适宜的温度和PHPH值值思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？以完成任务吗？为什么？2 2、构建过程、构建过程目的基因目的基因目的基因目的基因启动子启动子启动子启动子终止子终止子终止子终止子标记基因标记基因标记基因标记基因复制原点复制原点复制原点复制原点1 1、基因、基因表达载体表达载体的组成的组成想一想：其中有两个想一想：其中有两个DNADNA片段连接形
4、成的的产物有片段连接形成的的产物有几种？几种？1 1、导入植物细胞、导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法:表达载体导入农杆菌，再表达载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞让农杆菌感染植物细胞基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法：将基因表达载体提纯，用显微仪将基因表达载体提纯，用显微仪 注射到注射到受精卵受精卵中中2 2、导入动物细胞、导入动物细胞3 3、导入微生物细胞、导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少细胞、遗传物质少用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合 感受态细
5、胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子方法：方法：1 1、分子水平的检测：分子杂交技术、分子水平的检测：分子杂交技术检测是否插入目的基因检测是否插入目的基因检测是否转录出检测是否转录出mRNAmRNA检测目的基因是否翻译检测目的基因是否翻译 成蛋白质成蛋白质2 2、个体水平的鉴定、个体水平的鉴定DNADNA分子杂交技术分子杂交技术抗体与相应的蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带抗体与相应的蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带分子杂交技术分子杂交技术四、目的基因的检测与鉴定归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCR技术
6、技术2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测测1有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是()A限制酶只在获取目的基因时才用限制酶只在获取目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可以作为运载体质粒都可以作为运载体 D蛋白质的氨基酸
7、排列顺序可以为合成目的基蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基 因提供线索因提供线索练习：练习：2科学家已经能够通过基因工程的方法，能使番茄果肉细胞中含科学家已经能够通过基因工程的方法，能使番茄果肉细胞中含 有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述错误的是（）A.采用反转录的方法得到的目的基因有启动子、终止子采用反转录的方法得到的目的基因有启动子、终止子 B.用同种限制酶处理质粒和含目的基因的用同种限制酶处理质粒和含目的基因的DNA，可产生相同的，可产生相同的 黏性末端而形成重组黏性末端而形成重组DNA分子分子 C.番茄的叶肉细胞可作为受体细胞番茄的叶
8、肉细胞可作为受体细胞 D.启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达是不可缺少启动子对于目的基因在番茄的叶肉细胞中的表达是不可缺少 的的B B复性过程中引物与复性过程中引物与DNADNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原模板链的结合是依靠碱基互补配对原 则完成则完成C C延伸过程中需要延伸过程中需要DNADNA聚合酶、聚合酶、ATPATP、四种核糖核苷酸、四种核糖核苷酸D DPCRPCR与细胞内与细胞内DNADNA复制相比所需要酶的最适温度较高复制相比所需要酶的最适温度较高3 3多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR)(PCR)是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的技术。片段的技术
9、。PCRPCR过程一般经历下述三十多次循环：过程一般经历下述三十多次循环：9595下使模板下使模板DNADNA变性、解变性、解链链5555下复性（引物与下复性（引物与DNADNA模板链结合）模板链结合）7272下引物链延伸下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCRPCR过程的叙述中不正确的过程的叙述中不正确的是是A A变性过程中破坏的是变性过程中破坏的是DNADNA分子内碱基对之间的氢键，也可利分子内碱基对之间的氢键，也可利 用解旋酶实现用解旋酶实现3、假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性、假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切
10、酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有连接酶。连接产物至少有_种种DNA分子，它们分别是分子，它们分别是_。基因工程又叫基因拼接技术。基因工程又叫基因拼接技术。1、在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之、在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的一是：以目的基因转录的_为模板，为模板，_成互补的单链成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合，然后在酶的作用下合成成。求是求是_。2、基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、_。若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要