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1、蛋白质的结构与功能,第 一 章,Structure and Function of Protein,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,二、蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物 体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储（贮存，转运）5）运动与支持作用（运动，受
2、体，支架）6）参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,3. 氧化供能,蛋 白 质 的 分 子 组 成The Molecular Component of Protein,第 一 节, 组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % )= 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%, 蛋白质元素组成的特点,一、氨基酸
3、组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,氨基酸的结构通式,不同的侧链基团，不同的理化性质,生物化学,2. 氨基酸的构型,L-丙氨酸,D-丙氨酸,L-()甘油醛,D-()甘油醛,都有 D-型和 L-型 2 种立体异构体,生物化学,除了甘氨酸，均至少含有一个不对称碳原子，因此除甘氨 酸以外的常见的蛋白质氨基酸都具有手性性质。如果以L型甘 油醛为参照物，具有不对称碳原子的氨基酸就有D型和L型两 种对映异构体。实验证明，蛋白质分子中的不对称氨基酸都是L型。D型氨 基酸仅存在于一些特殊的抗菌肽和某些细菌的细胞壁成分之
4、 中，它们不能参入到在核糖体上合成的多肽或蛋白质分子之 中。,氨基酸的构型与氨基酸的旋光方向没有必然的联系。,生物化学,根据来源分：内源氨基酸和外源氨基酸从营养学角度分：必需氨基酸和非必需氨基酸这些体内需要而又不能自身合成，必须由食物供应的氨基酸，称为营养必需氨基酸。人体必需氨基酸有八种：,Met TrpLysValIle “假设来 借一,LeuPheThr两本书”,半必需氮基酸：组氨酸、精氨酸根据是否组成蛋白质来分：蛋白质中常见氨基酸、蛋白质中稀有氨基酸和非蛋白氨基酸,3、氨基酸的种类,脂肪族芳香族杂环族极性/不带电荷碱性/酸性,疏水：非极性R基团,亲水：极性的R基团（电中性、带负电荷、带正
5、电荷）,氨基酸的分类,R基团的化学结构,亲水氨基酸，即极性氨基酸，其R基团呈极性，一般能和水分子形成氢键，故对水分子具有一定的亲和性。它们包括：Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Arg、Lys、His；疏水氨基酸，即非极性氨基酸，其R基团呈非极性，对水分子的亲和性不高或者极低，但对脂溶性物质的亲和性较高。它们包括：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp。,亲水氨基酸VS疏水氨基酸,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leuci
6、ne Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,目 录,色氨酸 tryptophan Trp W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,甲硫氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine T
7、hr T 5.60,2. 极性中性氨基酸,目 录,非极性,非极性,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,目 录,几种特殊氨基酸,脯氨酸（亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,几种重要的不常见氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基
8、赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。,含硒半胱氨酸只存在于含硒蛋白之中，而吡咯赖氨酸仅存在于一些原核生物体内，作为与产甲烷代谢有关的某些酶的组分。,几种非蛋白质氨基酸,H2N-CH2-CH2-COOH H2N-CH2-CH2-CH2-COOH,-丙氨酸,-氨基丁酸,生物化学,1）物理性质氨基酸的旋光性及立体异构除甘氨酸外，氨基酸含有一个手性-碳原子，因此都 具有旋光性。左旋（-）或右旋（+）比旋光度是氨基酸的 重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。,4、氨基酸的理化性质,生物化学,氨基酸的光吸收,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸
9、收，在紫外 区只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max275nm，苯丙氨酸的max257nm，色氨酸的max280nm由于蛋白质中含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，所以也有紫外 吸收能力，一般最大光吸收在280nm波长处。可以利用紫外分光光度法进行定量。,生物化学,100,10,200,250Wave阳ath. nm,单色透镜| |,样品,|,检测器,分光光度法测定原理,A 或D=光吸收或光密度；=摩尔消光系数；C=摩尔浓度；L=吸收杯的内径长度（cm);I0=入射光强度；I =透射光强度,Lambert Beer 定律：,T=透光率（transmittancy, = I/I0)
10、,生物化学, 氨基酸在结晶形态或水溶液中，并不是以游离的羧基或 氨基形式存在，而是离解成两性离子(zwitterion)。在两性 离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解 状态(-COO-)存在。 两性离子：同一个氨基酸分子上带有能放出质子的-NH3+正离子和能接,受质子的-COO-负离子。氨基酸是两性电解质,2）氨基酸的酸碱性质,对于任何一种氨基酸来说，总存在一定的pH值，使其净电荷为零，这时的pH值被称为等电点。pI是一个氨基酸的特征常数。在等电点pH时，氨基酸在电场中，不向两极移动，并且绝大多数处于兼性离子状态，少数可能解离成阳离子和阴离子，但解离成阴、阳离子的趋势和数
11、目相等。,等电点（pI）,生物化学,实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但 也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中 性分子。,当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。,生物化学,+ H3NCH2,COOH,+ H3NCH2+- Gly,COO,-,H NCH,2,2,COO-,Gly+,Gly,-,H,+,K1,H,+,K2,中性氨基酸：以Gly为例,K1=,Gly,Gly+,K2=,Gly- H+,Gly,I时， Gly+ = Gly- ,Gly H+,K1,=,Gly K2 H+,H =K K,+,2,12,
12、pH=（pK1+pK2）/2,pI=（pK1+pK2）/2,pIGly =（2.34+9.60）/2=5.97,氨基酸等电点计算,H+,生物化学,酸性氨基酸，以Asp为例：,生物化学,碱性氨基酸，以Lys为例：,结论： 各种氨基酸的等电点为两性离子两侧两个pKa的平均值,生物化学,2）化学性质,COOH H2NCHR,侧链反应,-氨基参加的反应-羧基参与的反应-氨基和羧基共同参与的反应侧链反应,成盐反应 亚硝酸盐反应 烃基化反应 酰化反应 脱氨基反应 西佛碱反应,成盐成酯反应 成酰氯反应 脱羧基反应 叠氮反应,-氨基参加的反应,（1）成盐作用,（2）与HNO2的反应,反应中生成的N2，只有一半
13、来自氨基酸。另外，除-氨基外，赖氨酸的NH2也能与亚硝酸反应，但速度较慢；而-氨基作用在3-4分钟即可完成。,用途：范斯来克（Van Slyke)法定量测定氨基酸的基本反应。,（3）与甲醛的反应,用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用NaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。氨基酸酸碱滴定的等电点pH过高（12-13）或者过低（1-2），没有适当的指示剂可用。,用途：可以用酚酞作指示剂用NaOH来滴定氨基酸的浓度,（4）酰基化反应,酰氯：,苄氧酰氯（Cbz-Cl）:,对甲苯磺酰氯(Tos-Cl) :,叔丁氧酰氯(Boc-Cl):,酸酐：,邻苯二甲酸酐：
14、,（R酰基）,用途：用于保护氨基以及肽链的氨基端测定等。,（5）烃基化反应, 与2、4一二硝基氟苯的反应,2，4一二硝基氟苯,（R烃基）,DNP-氨基酸（黄色）,DNP-氨基酸为黄色，较为稳定；可以用乙醚抽提后用纸层析来分析N-端氨基酸的种类和数目。用途：是鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法。, 与苯异硫氰酸（酯）的反应,PITC,生物化学,Edman（瑞典）首先使用该反应鉴定多肽或蛋白质的N-端氨基酸。蛋白质多肽链N端氨基酸的-氨基可与PITC反应生成 PTC- 蛋白质, 在酸性溶液中，它释放出未端的 PTH-氨基酸和比原 来少了一个氨基酸残基的多肽链。（故PITC亦 称作Edman试剂）。该反
15、应在多肽和蛋白质的氨基酸序列分析方面占有重要地位多肽顺序自动分析仪 ，一次可连续测出60个以上的氨基 酸顺序。,-羧基参加的反应,（1）成盐和成酯反应,（2）成酰氯反应,用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。,（3）成酰胺反应,体外：,体内：,（4）脱羧基反应,谷氨酸,-氨基丁酸,生物化学,-氨基和-羧基共同参与的反应,（1）与茚三酮反应茚三酮在弱酸溶液中与-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱 氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物（氨和还原茚三酮） 发生作用，生成紫色物质（570nm)，其反应如下：两个亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应形成黄色化合物(440nm)。,+,水合茚三酮(无色),紫色
16、化合物,水合茚三酮,生物化学,(2)成肽反应,一个氨基酸的氨基与另一氨基酸的羧基可以缩 合成肽，其键称肽键。,R,+ H3NCHCOH+,OH2O,1,R,HNCHCOO,2,H,-,R,+H3NCHCNCHCOO,O肽键,1,R,2,H,-,生物化学,（1）-S-S-和-SH的氧化还原反应很容易被氧化形成二硫键（SS）,作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或断裂。,侧链R基参加的反应,生物化学,R-SH：HS-CH2CH2OH 巯基乙醇（mercaptoethanol）HS-CH2COOH巯基乙酸（mercaptoacetic acid）HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖
17、醇（dithiothreitol, DTT）,B. 二硫键与过甲酸反应,磺基丙氨酸残基,生物化学,（2）苯环的黄色反应,Tyr,or,Trp,+ 浓HNO3,黄色,he+少量浓H2SO4+浓HNO3,黄色,用于鉴定带 苯环的氨基酸,（3）酚基的Millon反应（米伦氏反应） HgNO3,Tyr+,Hg(NO3)2,红色,HNO3,供测酪氨酸用,蛋白质定性测定,生物化学,（4）吲哚基的乙醛酸反应,乙醛酸,Trp +,紫红色,（5）胍基的sakaguchi反应（坂口反应） -萘酚,为蛋白质的定性试验和测定色氨酸的基础,Arg +,NaOBr or,红色,NaOCl,OH,-,保护胍基，用作肽合成,
18、浓H2SO4,生物化学,（7）Folin一酚反应,+,磷钼酸,TyrTrp,磷钨酸,or,蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）,可作蛋白质的定性、定量用。,（6）咪唑基pauly反应,His + 重氮苯磺酸,红色（棕红色）,所有关于氨基酸的分离手段都建立在它们在物理性质（大小）或化学性质（电荷）的差别的基础之上。用于分离、纯化氨基酸的主要手段是电泳和层析。,Ala、Lys和Asp的电泳分离,离子交换层析分离氨基酸的原理,氨基酸的分离与纯化技术,层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色
19、带而被分开，由此得名为“色谱法”。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。,Chromatography （色谱法、层析法）,层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（Partition coefficient），使各组分在两相（一相为固定的，称为Fixed phase；另一相流过固定相，称为Mobile phase）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,1.吸附层析(Adsorption chromatography)：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。2.分配层析(Partition chromatography) ：利用不同组分在流动
20、相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。3.离子交换层析(Ion-exchange chromatography) ：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。4.凝胶层析(Gel filtration,Molecular sieve chromatography) ：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。5.亲和层析(Affinity chromatography) :利用固定在固相介质上的配体与被分离的目标物质的特异性相互作用而达到分离目的的一种技术。6.疏水层析（Hydrophobic interaction chromatography）7,按层析过程的机理分类：,用离子交换树
21、脂作支持物（固相），一定pH Buffer为流动相,根据被分离组分所带电荷的差别达到分离的技术。 阳离子交换树脂能交换阳离子 如酸性基团-SO3H（强酸型）或 -COOH （弱酸型） 能解离出H+，当溶液中含有其他阳离子时， H+与 其交换而 “结合”在树脂上。 阴离子交换树脂能交换阴离子 如-N(CH3)3OH 强碱型 - NH3OH 弱碱型 能解离出OH-,离子交换层析Ion-exchange chromatoraphy,pI of neutral AAs： pH=6.26.8 pI of acidic AAs： pH=2.83.2 pI of alkaline AAs： pH=7.610
22、.8,e.g. 混合Aa，在pH 2条件下上柱，各种Aa pI 2，相当于置酸中，得H+而为阳离子，全部“挂上”。逐渐增加洗脱液pH值进行洗脱，各种氨基酸按带正电荷少到多的顺序依次被洗脱下来。,Amino Acid Analyzer,蛋白质的水解产物（氨基酸混合物）,二、肽,* 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）肽(peptide),肽就是氨基酸之间通过-氨基和-羧基缩合以酰胺键或肽键相连的聚合物，它包括寡肽、多肽和蛋白质。构成肽的每一个氨基酸单位被称为氨基酸残基。各氨基酸残基以肽键相连形成的链状结构被称为肽链。,+,甘
23、氨酰甘氨酸,肽键,肽的命名和分类的主要依据是氨基酸残基的数目和组成。肽的分类可根据氨基酸残基的数目而直呼其为几肽。例如，2个氨基酸形成的肽称为二肽，3个氨基酸构成的肽称为三肽，以此类推。一般将210个氨基酸残基组成的肽称为寡肽，由1150个氨基酸残基组成的肽称为多肽，由50个以上的氨基酸残基组成的肽通常被称为蛋白质。,肽的分类和命名,除了少数环状肽链以外，其它肽链都含有不对称的两端：其中含有自由-氨基的一端被称为氨基端或N端，含有自由-羧基的一端称为羧基端或C端。,肽的化学结构与命名,非核糖体合成肽与核糖体合成肽,两性解离肽也有等电点，其中小肽的pI的计算方法与氨基酸相似，但复杂的寡肽只能与多
24、肽和蛋白质一样不能计算，只能测定（如使用等电聚焦的手段）。手性与旋光性双缩脲反应凡含有两个肽键的肽含有与双缩脲结构相似的肽键（至少含有两个肽键，故二肽不行），都能发生此反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，与碱性硫酸铜作用，生成紫红色或蓝紫色络合物。水解具有特定的生物学功能,寡肽的理化性质,生物化学,All right by Shunqin Zhu,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序 称为氨基酸顺序。肽链骨架是由-N-C-C-单位规则重复排列而成共价主链。多肽链的一端含有一个游离的-氨基氨基端或N-端；在 另一端含有一个游离的-羧基羧基
25、端或C-端。氨基酸的书写和命名顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：,Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu,多肽的结构,生物化学,All right by Shunqin Zhu,（二） 几种生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,谷胱甘肽的生理功用：,解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜
26、结构的破坏作用。,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2. 多肽类激素及神经肽,多肽激素及神经肽,三、蛋白质的分类,* 根据蛋白质组成成分,* 根据蛋白质形状,其中非蛋白成分称为辅基, 可以是金属离子、色素、寡糖、脂类、磷酸或核酸等,多数不溶于水, 为结构蛋白,多数可溶于水, 为功能蛋白,蛋 白 质 的 分 子 结 构The Molecular Structure of Protein,第 二 节,生物化学,（一）蛋白质的组织层次,All right by Shunqin Zhu,当多肽的分子量大到足够具有一定的空间结构时就称为蛋白质。蛋白质与多肽的主要差别：分子量，
27、空间结构通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔 顿甚至更大。,生物化学, 实验已经证明蛋白质是由各种氨基酸通过肽键连接而成的多 肽链，再由一条或一条以上的多肽链按各自特殊的方式组合成 具有完整生物活性的分子。随着肽链数目、氨基酸组成以及排列顺序的不同，就有不同的 三维空间结构，也就形成了不同的蛋白质。,All right by Shunqin Zhu,生物化学,随着蛋白质化学研究的进展，越来越多的人认为在二级结构和三级结构之间应加入超二级结构和结构域这两 个层次，所以蛋白质的结构层次为：,一级结构,二级结构,超二级结
28、构,结构域,三级结构,四级结构,All right by Shunqin Zhu,定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,生物化学,定义1969年，国际纯化学与应用化学委员会（ IUPAC） 规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连 中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要 的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基 础。一级结构的主要连接键是肽键。,蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构；成百亿的天然蛋白质各有其特殊的生物学活性：1) 首先在于其肽链的氨基酸序列；2)由于组成蛋白质的20种氨基酸各具
29、特殊的侧链，侧链基团的理化 性质和空间排布各不相同，当它们按照不同的序列关系组合时， 就可形成多种多样的空间结构和不同生物学活性的蛋白质分子。,All right by Shunqin Zhu,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,目 录,二、蛋白质的二级结构,主要的化学键： 氢键,（一）肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,具有部分双键的性质（40），其键长为0.133nm，介于一个典型的单键和一个典型的双键之间。具有双键性
30、质的肽键不能自由旋转，与肽键相关的6个原子共处于一个平面，此平面结构被称为酰胺平面或肽平面与C相连的两个单键可以自由旋转，由此产生两个旋转角多为反式，但是X-Pro是例外。N带部分正电荷，O带部分负电荷。,肽键的结构与性质,肽键的双键性质,肽平面上各个共价键的主要参数,肽平面及二面角,蛋白质分子结构中的特殊化学键(C-C, C-H, C-O, C-S, O-H, S-H等为普通共价键), Peptide bond(肽键) Disulfide link(-S-S-，二硫键) 2个Cys的-SH被氧化成胱氨酸时即形成的共价键。此键与肽链空间结构的稳定性和生物活性有密切的关系。 Ester link
31、（酯键） 在蛋白质分子中的-OH与-COOH可形成酯键. 更常见的是Phosphoprotein (磷蛋白)中OH与磷酸形 成的磷酸酯键，此种键对于维系某些蛋白质的结构和 功能是必不可少的。, Ionic bond, Salt linkage(离子键或盐键) 在一定的pH条件下，酸性和碱性氨基酸可形成离子。带相反电荷的两个基团之间的距离合适时，由于静电引力作用而形成的一种化学键。 Dative link（配位键） 两个原子之间，共用电子由其中的一个原子提供而形成的共价键。如铁氧还蛋白，固氮酶铁蛋白，Cyt C等含Fe；Inslin含Zn等等。金属离子与蛋白质通常以配位键形式连接。 Dative
32、 bond参与维系蛋白质的高级结构。 Hydrophobic link（疏水键或疏水作用力） 主要存在于蛋白质分子的内部结构中，是非极性侧链（疏水基团）在极性溶剂中为了避开水相而彼此靠近所产生的一种作用力，本质上也是Van de waals forces。, Hydrogen link（氢键） 氢原子与一个电负性强的原子以共价键结合后，再与第二个电负性强的原子以化学键结合，这个化学键即为氢键。氢键是弱键，其特点是有方向性，即供体原子，氢和受体原子处于一直线时形成的氢键最强。蛋白质分子中有较多的H和O，可形成较多的氢键。在肽链与肽链之间，在一条链的不同区段都可形成氢键。 Van de waals
33、 forces（范德华力） 任何两个原子（基团，分子）之间相距约34时，就存在一种非专一性的弱的吸引力，这种相互作用就称为Van de waals Forces。总的趋势是相互吸引，但又不碰撞。因为当两个基团靠的很近时，电子云之间的斥力增大，使二者不能相碰。在蛋白质分子内部非极性结构中较重要，对于维系蛋白质的高级结构也是一种重要的作用力。,生物化学,蛋白质的二级(Secondary)结构是指蛋白质分子中多肽链本身折叠和盘绕的方式。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。不涉及侧链部分的构象。酰胺平面是主链构象的基本单位。主要有 -螺旋、 -折叠、 -转角。,（二）蛋白质的二级结构,（二）
34、 -螺旋,目 录,. -螺旋(- helix) i. 在二级结构中最常见、含量最丰富 ii. 是局部肽段的盘绕呈右手螺旋状，侧链伸向四周的一种结构 iii. 主要特征,右手螺旋, 3.6a /turn, pitch=0.54nm螺旋之间通过氢键保持稳定 由第一个肽单位上的 -NH- 和其后的第四个肽单位上的C=O之间形成影响螺旋形成的主要因素有侧链的大小、形状及所带电荷等,-螺旋(-helix ),SN=3.613,螺旋直径5,: -60o-550: -45o-500,第1个残基C=O与第5个残基N-H之间形成氢键,生物化学,除了上面这种典型的-螺旋外，还有一些不典型的-螺旋，所以规定了有关螺
35、旋的写法，用“nS”来表示，n为螺旋上升一圈氨基酸的残基数。S为氢键封闭环内的原子数，典型的-螺旋用3.613表示，非典型的-螺旋有3.010， 4.416（螺旋）等。,生物化学,2）-螺旋的方向,右旋：凡从R-CH-NH-CO-端作起点 围着螺旋轴心向右盘旋的多 肽为右手螺旋。几乎所以的蛋白质分子为右 手螺旋。左旋：1978年有人在嗜热蛋白酶的 晶体结构中发现第226-229位 的氨基酸残基形成一圈左手 螺旋。这是目前所发现的唯 一的左手螺旋。,（三）-折叠,. -折叠 (- pleated sheet) i. 两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，呈折纸状，相邻肽链上的-NH-与C
36、=O形成有规则的氢键，这样的结构称为-折叠或-片层。 ii. 主要特征,主链较伸展, 呈 Z- 字型 相邻的两条链之间通过氢键保持稳定 侧链位于片层上、下 主链走向可平行，亦可反平行 其中反平行的方式更稳定,生物化学,t by Shunqin Zhu,-折叠包括平行式和反平行式两种类型,NN N,多肽链伸展不及反平行式 R基团突出位 于片层两端,All righ,氢键,0.65nm,生物化学,-折叠包括平行式和反平行式两种类型N C N,0.7nm,All right by Shunqin Zhu,生物化学,（四）、-转角-turn,-回折（或发夹结构）-转角是多肽链180回折部分所形成的一种
37、二级结构， 主链骨架本身以大约180回 折; 回折部分通常由四个氨基酸 残基构成;构象依靠第一残基的-CO基 与第四残基的-NH基之间形成 氢键来维系。甘氨酸，脯氨酸容易出现于此结构,目前发现的-转角多数都存在蛋白质分子表面，它们的含量相当丰 富，约占全部AA残基的1/4。,All right by Shunqin Zhu,凸起是由于 折叠的1个股中额外插入1个氨基酸残基，使原来连续的氢键结构被打破，从而使肽链产生的一种弯曲凸起结构。凸起主要发现在反平行折叠之中，只有约5%出现在平行的折叠结构之中。凸起也能轻微地改变多肽链的走向。,突起的主要内容,All right by Shunqin Zh
38、u,肽段在空间的不规则排布称为无规则卷曲。在一般球蛋白分子中，往往含有大量的无规则 卷曲，它使蛋白质肽链从整体上形成球状构象。,（五）模体-超二级结构,在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。常见模体（1） 发夹环两个反平行股由一个环相连；（2） 折叠-螺旋-折叠，即；（3）卷曲螺旋和螺旋束两个或多个螺旋的聚合体； （4） 螺旋-环-螺旋（EF手相） ；（5）螺旋-转角-螺旋，即；（6）Rossmann卷曲；（ 7）希腊钥匙,发夹环,卷曲螺旋,四螺旋束,螺旋-转角-螺旋,螺旋-转角-螺旋与DNA的相互作用,功能
39、是与DNA序列特异性结合,EF手相结构,螺旋-环-螺旋,功能是结合Ca 2+,Rossmann折叠,希腊钥匙模体,功能是结合辅酶I/II,（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,三、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一） 定义,如果蛋白质分子仅由一条多肽链组成，三级结构就是它的最高结构层次。,生物化学,All right by Sh,unqin Zhu,蛋白质的三级结构研究最早的肌红蛋白，肌红蛋白 是哺乳动物肌肉
40、中运输氧的蛋白质，由一条多肽链构成， 有153个氨基酸残基和一个血红素辅基组成。,一种蛋白质的全部三维结构一般被称为它的构象。注意不要将构象与构型混为一谈。构型是指在立体异构中，一组特定的原子或基团在空间上的几何布局。两种不同构型的转变总是伴随着共价键的断裂和重新形成；一个蛋白质可以存在几种不同的构象，但构象的转变是单键的自由旋转造成的，无共价键的断裂和形成。 由于构成蛋白质的多肽链上存在多个单键，至少在理论上一种蛋白质会可能具有许多不同的构象。然而，在生理条件下，一种蛋白质只会采取一种或几种在能量上有利的构象。,蛋白质构象,是在一个蛋白质分子内的相对独立的球状结构和/或功能模块，是由若干个结
41、构模体组成的相对独立的球形结构单位，它们通常是独自折叠形成的，与蛋白质的功能直接相关。某些结构域在同一个蛋白质分子上被重复使用，某些蛋白质由多个拷贝的一种和多种结构域组成。根据占优势的二级结构元件的类型，结构域可分为五类：（1）结构域完全由螺旋组成；（2）结构域只含有折叠、转角和不规则环结构；（3）/结构域由股和起连接的螺旋片段组成；（4）+-结构域由独立的螺旋区和折叠区组成；（5）交联结构域缺乏特定的二级结构元件，但由几个二硫键或金属离子起稳定作用。,（二）结构域,大肠杆菌的DNA 聚合酶具有三个结构域，分别具有三个不同的酶活性,（三）分子伴侣,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环
42、境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,* 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,* 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,* 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键，也有二硫键（抗体）,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,血红蛋白的四级结构,维
43、系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键、二硫键维系蛋白质分子的四级结构：疏水键、范德华力、盐键、二硫键,a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键,亚基相同时，分子具有对称性,亚基的排列,蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 节,生物化学,一、蛋白质一级结构与功能的关系,（一） 蛋白质一级结构的变异与分子病1. Sickle-cell anemia 镰刀型红细胞贫血,生物化学,基
44、因发生突变,关键氨基酸发生变化,蛋白突变导致 (分 子病), 发病机理, 概念由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”,分子病的发病机理及概念,生物化学,细胞色素C (Cytochrome C),线粒体（Mitochondron）,（二）蛋白质的一级结构相似，功能相似,同源蛋白质（Homologous protein）: 指存在于不同物种，功能相同，在进化上相关的一组蛋白质。,生物化学,不同物种细胞色素C氨基酸序列比对图,不同物种细胞色素C关键部位相同，在进化上是保守的,生物化学,不同生物与人的Cytc的AA差异数目 生物 与人不同的AA数目,根据细胞色素 C的 顺序种属差异建立,圆圈
45、代表分歧点,All right by Shunqin Zhu,起来的进化树,生物化学,二、二级结构与功能的关系,-螺旋离 子 烫-折叠,生物化学,阿尔茨海默病,微管相关蛋白 Tau中部分氨基 酸异常折叠,-螺旋,-折叠,1. 构象病：由于蛋白质的 空间构象改变而产生的异 常的疾病称为构象病。,囊性纤维变性是一种遗传性疾病，它与一种编码囊性纤维变性跨膜传导调节蛋白（CFTR）的基因缺陷有关。正常的CFTR是一种跨膜蛋白，在上皮细胞的质膜上作为一种受ATP调控的Cl-通道，负责将Cl-从细胞内泵出去。有缺陷的CFTR不能整合到细胞膜上或虽能整合到但无功能。于是，缺乏CFTR的上皮细胞开始积累Cl-
46、 。由于渗透压的缘故，细胞开始拼命吸收周围粘液中的水分，导致粘液变稠，特别在患者的呼吸道内会产生稠厚的粘痰，而阻碍呼吸，使得呼吸道反复受感染。,囊性纤维变性,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,二、蛋白质空间结构与功能的关系,目 录,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,* 协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促
47、进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity),变构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。,第四节,蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,（一）蛋白质的两性电离,一、理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷
48、的基团。,* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,* 蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活
49、性的丧失。,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子、生物碱试剂及表面活性剂等 。,蛋白质变性后的表现生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；生化反应易进行；光吸收系数增大；组分和分子量不变。,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,* 蛋白质可逆沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在
50、外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,* 蛋白质可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法（向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象（水与离子的相