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1、关于蛋白质一级结构关于蛋白质一级结构的测定的测定现在学习的是第1页，共25页 蛋白质的一级结构指：蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺蛋白质的一级结构指：蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。组成一个蛋白质分子的多肽序，包括二硫键的位置。组成一个蛋白质分子的多肽链的数目和多肽链中氨基酸的精确序列是蛋白质一级链的数目和多肽链中氨基酸的精确序列是蛋白质一级结构的两个重要方面。结构的两个重要方面。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。生物功能的基础。一级结构一级结构(Primary Structure)现在学习的是第2页，共25页
2、包括以下几方面内容：包括以下几方面内容：多肽链的数目；多肽链的数目；每每 条条 多多 肽肽 链链 中中 氨氨 基基 酸酸 的的 种种 类类、残残 基数目和基数目和排列次序排列次序；链内或链间二硫键的位置和数目。链内或链间二硫键的位置和数目。现在学习的是第3页，共25页蛋白质一级结构测定的策略蛋白质一级结构测定的策略从蛋白质开始的蛋白质序列分析从DNA开始推蛋白质氨基酸序列质谱法测定蛋白质的一级结构现在学习的是第4页，共25页从蛋白质开始的蛋白质序列分析从蛋白质开始的蛋白质序列分析测定的基本战略测定的基本战略测定一级结构的准备工作测定一级结构的准备工作测定一级结构的基本步骤测定一级结构的基本步骤
3、现在学习的是第5页，共25页测定的基本策略测定的基本策略p用两种裂解肽链的方法用两种裂解肽链的方法,分别得到裂解肽分别得到裂解肽段；段；p 分离提纯肽段分离提纯肽段,测出各个肽段的氨基酸测出各个肽段的氨基酸序列；序列；p 对两套肽段序列比较对两套肽段序列比较,找出重叠肽找出重叠肽,确定确定各肽段位置各肽段位置,拼凑整个肽链的氨基酸排序。拼凑整个肽链的氨基酸排序。现在学习的是第6页，共25页测定一级结构的准备工作测定一级结构的准备工作p对样品纯度的要求对样品纯度的要求 97%97%p 对蛋白质分子量的测定对蛋白质分子量的测定 误差误差10%10%p 测定分子中多肽链的数目与种类测定分子中多肽链的
4、数目与种类p 蛋白质的氨基酸组成蛋白质的氨基酸组成p 蛋白质的配基蛋白质的配基p 蛋白质的端基分析蛋白质的端基分析现在学习的是第7页，共25页测定一级结构的基本步骤测定一级结构的基本步骤测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子中的多肽链拆分蛋白质分子中的多肽链测定多肽链的氨基酸组成测定多肽链的氨基酸组成分析多肽链的分析多肽链的N N末端和末端和C C末端末端断裂多肽链内的二硫键断裂多肽链内的二硫键多肽链断裂成肽段多肽链断裂成肽段测定各个多肽段的氨基酸顺序测定各个多肽段的氨基酸顺序确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链
5、中二硫键的位置现在学习的是第8页，共25页测得相对分子质量测得相对分子质量Mr 很多方法可用于确定蛋白质的相对分子量，如：渗透压、扩散很多方法可用于确定蛋白质的相对分子量，如：渗透压、扩散系数、沉降系数凝胶过滤、凝胶电泳等，系数、沉降系数凝胶过滤、凝胶电泳等，测定末端氨基酸测定末端氨基酸数数x X (m/Mr)=n(蛋白质分子中肽链数蛋白质分子中肽链数目目)（m为样品质量）为样品质量）蛋白质中多肽链数目的确定蛋白质中多肽链数目的确定现在学习的是第9页，共25页蛋白质中多肽链的拆分蛋白质中多肽链的拆分变性：变性：8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/LHCI6mol/LHCI，或高浓，或
6、高浓度盐溶液度盐溶液如有二硫键交联：巯基乙醇，或过氧乙如有二硫键交联：巯基乙醇，或过氧乙酸处理酸处理凝胶过滤或电泳分离不同肽链凝胶过滤或电泳分离不同肽链现在学习的是第10页，共25页氨基酸组成分析氨基酸组成分析酸水解：酸水解：碱水解：碱水解：甲基磺酸水解：甲基磺酸水解：优点：优点：不破坏色氨酸，不破坏色氨酸，经碱中和后可直接上机自动分析经碱中和后可直接上机自动分析缺点：缺点：不能有碳水化合物存在不能有碳水化合物存在 中和点不易掌握中和点不易掌握计算出各种氨基酸分子比计算出各种氨基酸分子比多肽链分子量多肽链分子量确定氨基酸组成确定氨基酸组成现在学习的是第12页，共25页末端氨基酸分析末端氨基酸分
7、析N末端氨基酸分析末端氨基酸分析丹黄酰氯法丹黄酰氯法(DNS)：优点：可直接层析或电泳分离，荧光检测定性优点：可直接层析或电泳分离，荧光检测定性 定量；灵敏度高定量；灵敏度高(较二硝基氟苯较二硝基氟苯 法高法高100倍倍)二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB or FDNB)法法；氨肽酶法；氨肽酶法；现在学习的是第13页，共25页将肽链裂解成小片断将肽链裂解成小片断 要求：断裂点较少，专一性较强、产率高要求：断裂点较少，专一性较强、产率高酶裂解法：酶裂解法：常用的酶：常用的酶：胰蛋白酶：仅断裂胰蛋白酶：仅断裂Lys、Arg羧基形成的肽键羧基形成的肽键（但）（但）糜蛋白酶：糜蛋白酶：位点：位点：Tyr
8、、Phe、Trp羧基肽键羧基肽键 胃蛋白酶：位点：两种疏水性氨基酸形成的胃蛋白酶：位点：两种疏水性氨基酸形成的肽键肽键 嗜热菌蛋白酶：专一性较差嗜热菌蛋白酶：专一性较差 金黄色葡萄球菌蛋白酶（金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：蛋白酶）：梭状芽孢杆菌蛋白酶（梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：蛋白酶）：化学裂解法：化学裂解法：溴化氰法：专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键溴化氰法：专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键现在学习的是第15页，共25页肽段氨基酸序列的测定肽段氨基酸序列的测定Edman降解法：一次可连续测定降解法：一次可连续测定6070个氨个氨基酸；程序复杂，工作量大；基酸；程序复杂，工作量大
9、；酶降解法：酶降解法：质谱法：质谱法：现在学习的是第18页，共25页Edman Edman 降解法测定降解法测定N-N-N-N-末端氨基酸末端氨基酸末端氨基酸末端氨基酸Edman reagentPTC-多肽多肽少一个少一个N-末端氨末端氨基酸的肽链基酸的肽链层析色谱鉴定层析色谱鉴定重复重复与与DNS法联合法联合现在学习的是第19页，共25页肽片断在多肽链中排列次序的确定 (见p179)p179)现在学习的是第20页，共25页多肽链中二硫键位置的确定多肽链中二硫键位置的确定现在学习的是第21页，共25页多肽链氨基酸系列的直接测定：最初于多肽链氨基酸系列的直接测定：最初于1954年由英国剑桥大学的
10、年由英国剑桥大学的Sanger实验室建立；现实验室建立；现主要由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序推导主要由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序推导.蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库美国生物医学基金会的美国生物医学基金会的PIR(Protein Information Resource or Protein Identification Resource);美国政府的美国政府的Gen Bank(Gene Sequence Data Bank)欧洲的欧洲的EMBL(European Molecular Biology Laboratory Data Bank)（欧洲分子生物学实验室（欧洲分子生物学实验室数据库）数据库）可从可从“Altas of Protein Sequence and Structure”(蛋白质序列和结构图册）蛋白质序列和结构图册）中查找中查找现在学习的是第22页，共25页现在学习的是第23页，共25页现在学习的是第24页，共25页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第25页，共25页