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1、第三章蛋白质的一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。 自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作,A. 样品必需纯（97%以上）； B. 知道蛋白质的分子量； C. 知道蛋白质由几个亚基组成； D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,（1）测定蛋白质的一级结构的要求,（2）蛋白质分子的一级结构测定方法,氨基酸组成分析,氨基酸末端分析,蛋白质中肽链的拆离,肽链的部分降解及肽片断的分离,肽段氨基酸顺序测
2、定及肽段重叠,二硫键与酰胺基的定位,测定蛋白质氨基酸残基组成,根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸的数量；,采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。,测定蛋白质分子中多肽链的数目,通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分离出来； 几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基； 用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化
3、； 如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。,二硫健的断裂及多肽链的拆分,巯基的保护,用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化,用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析仪测定； 测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反应分析各肽段氨基酸顺序；,多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺序的测定,获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序；确定多肽链中二硫键的位置。,利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解,2、多肽链氨基酸顺序分析
4、,多肽链降解必须满足两个条件： 选择性强、反应产率高 主要方法包括酶解法和化学法,某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的某一类肽键； 主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶； 糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸； 胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、以及其他疏水性强,酶解法,特点：专一性较强，水解速度快 断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键 R1=Lys（赖、K）和Arg（精、R） R2=Pro（抑制）,胰蛋白酶（trypsin）,特点：专一性稍弱，Leu、Met和Hi
5、s稍慢 断裂位点：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基酸残基的羧基端肽键 R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA R2=Pro（抑制）,糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）,水解速度与相邻AA性质有关: 酸性：-/碱性：+,特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱； 断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸 R1和/或R2Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro（抑制） pH2.0,肽链,水解位点,胃蛋白酶 Pepsin,特点：专一性较差 断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Me
6、t等疏水性强氨基酸残基的羧 基端肽键 R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快,嗜热菌蛋白酶（thermolysin),木瓜蛋白酶： 专一性差 断裂位点：对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感 葡萄球菌蛋白酶： 高专一性 断裂位点：Glu和Asp残基的羧基端肽键 磷酸缓冲液 Glu残基的羧基端肽键 碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）,梭菌蛋白酶： 高专一性 断裂位点：Arg残基的羧基端肽键,溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,化学法,-选择性地切割由Met羧基形成的肽键,溴化氰水解法
7、(Cyanogen bromide),N末端的测定 二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；异硫氰酸苯脂法（PITC 法）； C末端的测定 羧肽酶法；硼氢化锂法；肼解法,（2）多肽链的末端氨基酸测定,N末端测定方法比较C末端更加成熟、可靠和准确，主要的方法有： 二硝基氟苯法（DNFB法） 肽链N末端氨基与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应，生成二硝基苯的衍生物（DNP-肽），其经酸水解后生成的DNP-氨基酸可用有机溶剂（如乙酸乙酯）抽提，再与其他氨基酸分开，鉴定得知N末端的氨基酸。,N末端的测定,二硝基氟苯法(FDNB,DNFB): 1945年Sanger提出此方法
8、。,荧光剂二甲氨基萘磺酰氯（dansyl-chloride, DNS-Cl）可以作为标记试剂专一地与肽链N末端氨基反应生成DNS-肽； 同样，酸水解后可得DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定； DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈的荧光，根据荧光点的位置，确定N末端的氨基酸。此方法反应原理同DNFB法，但其灵敏度比DNFB法高约100倍，用于层析分析的样品只需1nmol。,二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）,基本原理：偶联-环化-转化,异硫氰酸苯酯能与N末端氨基偶联生成苯氨基硫甲酰衍生物 （PTC-肽）,异硫氰酸苯酯法（PITC法）,在酸性溶液中，PTC-肽经环化裂解
9、生成PTC-氨基酸和N末端少一个氨基酸的剩余多肽，前者可用于N末端氨基酸鉴定，但是该产物不稳定，很快进一步转化成3-苯基-2-乙内酰硫脲-氨基酸（PTH-氨基酸）。,生成的PTH-氨基酸非常稳定，它在268nm处有强吸收峰。剩余多肽链的N末端仍是自由的，可以进一步与异硫氰酸苯酯反应进行第二步降解。这样就可以从N末端开始逐次降解下去，进行顺序测定。该方法也称Edman顺序降解，它是制造氨基酸顺序分析仪的理论基础。,一般说来，C末端测定较N末端分析的误差大。可采用的方法有： 1羧肽酶法：羧肽酶能特异地水解C末端氨基酸形成的肽链，而用于测定C末端氨基酸。羧肽酶分A、B、C、Y4种，羧肽酶A使用最多，
10、但对C末端的Pro、Arg、Lys及Hyp不起作用。羧肽酶B，只释放C末端的Lys和Arg，可以和羧肽酶A互补使用。羧肽酶C的作用范围宽。但对C末端的Hyp或连续几个甘氨酸（-Gly-Gly-Gly）无作用。羧肽酶Y也具很宽的作用范围。 2硼氢化锂法（LiBH4法，也称“还原法”）：硼氢化锂可以与C末端氨基反应生成相应的-氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用层析法分离、鉴定。 3肼解法（hydrazinolysis）：测定C末端氨基酸一种较为重要的方法。多肽与无水肼发生反应时，肼可断裂所有的肽键形成肼的衍生物，唯有C末端氨基酸以游离形式存在，故可通过层析鉴定。,C末端的测定,亚基拆离、肽链降解和肽段的分离,亚基,切成小段,蛋白分子,