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1、关于氨基酸肽和蛋白质(2)现在学习的是第1页，共61页o蛋白质是多聚酰胺，是由氨基酸组成的，组成蛋白质的氨基酸通常有蛋白质是多聚酰胺，是由氨基酸组成的，组成蛋白质的氨基酸通常有2020种，称种，称之为天然氨基酸，都为之为天然氨基酸，都为L-L-型型a-a-氨基酸。氨基酸。蛋白质是复杂的生物生物高分子，蛋白质是复杂的生物生物高分子，相对分子质量通常都在相对分子质量通常都在10 00010 000以上，如胰岛素的相对分子质量为以上，如胰岛素的相对分子质量为60006000，但，但它的二聚体的相对分子质量为它的二聚体的相对分子质量为12 00012 000，同时具有复杂的高级结构，所以胰岛素可，同时
2、具有复杂的高级结构，所以胰岛素可视为最小的蛋白质。从结构上讲，肽与蛋白质没有什么区别，肽也是由氨基酸以视为最小的蛋白质。从结构上讲，肽与蛋白质没有什么区别，肽也是由氨基酸以酰胺键组成，也同样具有较稳定的空间结构，只不过分子较蛋白质小。肽也具有酰胺键组成，也同样具有较稳定的空间结构，只不过分子较蛋白质小。肽也具有多样的和复杂的生理功能。它在生物体内传递信息、调节细胞代谢活动和协调各多样的和复杂的生理功能。它在生物体内传递信息、调节细胞代谢活动和协调各机体的生理过程，在生命活动中起着非常重要的作用。机体的生理过程，在生命活动中起着非常重要的作用。现在学习的是第2页，共61页第一节第一节 氨基酸氨基
3、酸 o氨基酸的结构与分类、理化性质、氨基酸的分离分析（生物化学和食氨基酸的结构与分类、理化性质、氨基酸的分离分析（生物化学和食品化学已经学过）品化学已经学过）现在学习的是第3页，共61页第二节第二节 肽肽 o肽和蛋白质都是重要的生命基础物质。肽和蛋白质都是重要的生命基础物质。从结构上看它们是相同的，都是由氨基从结构上看它们是相同的，都是由氨基酸以酰胺键连接而成。构成多肽与蛋白质的氨基酸通常为酸以酰胺键连接而成。构成多肽与蛋白质的氨基酸通常为a-a-氨基酸，约氨基酸，约2020种，都是种，都是L-L-型，型，只有在微生物代谢产物、植物及个别低等动物来源的多肽中只有在微生物代谢产物、植物及个别低等
4、动物来源的多肽中存在非天然的存在非天然的D D型氨基酸。型氨基酸。o多肽与蛋白质在基本结构上是没有区别的，只是分子大小的不同。多肽与蛋白质在基本结构上是没有区别的，只是分子大小的不同。现在习现在习惯的区分是将相对分子质量惯的区分是将相对分子质量10 00010 000以下的以下的(即约含即约含100100个氨基酸残基结构单元个氨基酸残基结构单元)称称作肽，而大于此值则为蛋白质。作肽，而大于此值则为蛋白质。另外，另外，由于蛋白质的分子较大，因此，分由于蛋白质的分子较大，因此，分子内部各种能稳定结构的因素子内部各种能稳定结构的因素(如氢键、盐键等各种次级键及芳香基团间的如氢键、盐键等各种次级键及芳
5、香基团间的相互作用等相互作用等)明显大于多肽，蛋白质比多肽具有更稳定和更复杂的高级结构。明显大于多肽，蛋白质比多肽具有更稳定和更复杂的高级结构。现在学习的是第4页，共61页o肽和蛋白质在生命科学、生物医学及内分泌学中占有非常重要的地位。肽和蛋白质在生命科学、生物医学及内分泌学中占有非常重要的地位。细胞分化、免疫防御、肿瘤病变、抗御衰老与生殖控制等生理活动无不与多肽密细胞分化、免疫防御、肿瘤病变、抗御衰老与生殖控制等生理活动无不与多肽密切相关。切相关。许多天然和合成的多肽在生物医药中的应用是人们熟知的。例如，胰许多天然和合成的多肽在生物医药中的应用是人们熟知的。例如，胰岛素用于治疗糖尿病、调钙素
6、用于骨质疏松症、促黄体激素释放激素对于生殖岛素用于治疗糖尿病、调钙素用于骨质疏松症、促黄体激素释放激素对于生殖系统疾病及一些多肽类抗菌素如系统疾病及一些多肽类抗菌素如BleomycinBleomycin对于肿瘤抑制等，都说明了多肽类药对于肿瘤抑制等，都说明了多肽类药物的重要性。物的重要性。o作为各种酶重要组分的蛋白质，对于生命活动的重要性更是不言而喻的。作为各种酶重要组分的蛋白质，对于生命活动的重要性更是不言而喻的。没没有这些重要生物催化剂的作用，生命活动就将停止。因此，研究多肽和蛋有这些重要生物催化剂的作用，生命活动就将停止。因此，研究多肽和蛋白质化学对于了解生命现象和改善生命活动是非常重要
7、的。白质化学对于了解生命现象和改善生命活动是非常重要的。现在学习的是第5页，共61页一、肽和蛋白质的结构和特性一、肽和蛋白质的结构和特性 o 肽和蛋白质都是由氨基酸通过酰胺键肽和蛋白质都是由氨基酸通过酰胺键(-CONH-)联结而成。联结而成。例如，一个由丙氨例如，一个由丙氨酸酸(alanine)、半胱胺酸、半胱胺酸(cysteine)和缬氨酸和缬氨酸(valine)组成的三肽结构如下：组成的三肽结构如下：现在学习的是第6页，共61页o在三肽中含有两个酰胺键。由于羰基与氮原子之间的键已具部分双键性质，限制在三肽中含有两个酰胺键。由于羰基与氮原子之间的键已具部分双键性质，限制自由旋转。因此，自由旋
8、转。因此，这四个原子处于同一平面，这一结构特征对于肽和蛋白质的空这四个原子处于同一平面，这一结构特征对于肽和蛋白质的空间构象是非常重要的。间构象是非常重要的。现在学习的是第7页，共61页肽的分类：肽的分类：o按结构特征，肽分为：按结构特征，肽分为：o（1）直连肽，）直连肽，即即o（2）环肽）环肽:o以硫硫键相连的环肽以硫硫键相连的环肽，如催产素，如催产素现在学习的是第8页，共61页o头尾以酰胺键相连的环肽头尾以酰胺键相连的环肽，如环肽类抗菌素，如环肽类抗菌素o除了上述常见的环肽之外，还有除了上述常见的环肽之外，还有内酯肽及侧链环肽等内酯肽及侧链环肽等。现在学习的是第9页，共61页二、天然的生物
9、活性多肽二、天然的生物活性多肽 o迄今为止，对生物活性多肽的研究主要集中在动物，特别是哺乳动物来源的生迄今为止，对生物活性多肽的研究主要集中在动物，特别是哺乳动物来源的生物活性肽。它们在哺乳利物如人类的所有内分泌脏器中都有分布。物活性肽。它们在哺乳利物如人类的所有内分泌脏器中都有分布。o从哺乳类动物得到的多肽类激素种类很多，分布也非常广泛，生理功能也非常显著。从哺乳类动物得到的多肽类激素种类很多，分布也非常广泛，生理功能也非常显著。但这类多肽的含量都非常少。但这类多肽的含量都非常少。例如，促黄体激素释放激素例如，促黄体激素释放激素(LH-RH)存在于下丘存在于下丘脑中，脑中，20世纪世纪70年
10、代初年代初Schally与与Guillernin等从数十万头猪或羊的下丘脑中才等从数十万头猪或羊的下丘脑中才分离纯化得到毫克量的提抽物，并借此确定了分离纯化得到毫克量的提抽物，并借此确定了LH-RH的结构。的结构。o下表所示的多肽激素根据它们来源不同的内分泌腺及作用靶细胞的不同，下表所示的多肽激素根据它们来源不同的内分泌腺及作用靶细胞的不同，大体可分为下丘脑、垂体、胃肠、胰腺及组织激肽等多肽激素研究的进大体可分为下丘脑、垂体、胃肠、胰腺及组织激肽等多肽激素研究的进展表明，它们的分布是很广泛的。有些生物活性肽如激肽类，不但存在展表明，它们的分布是很广泛的。有些生物活性肽如激肽类，不但存在于高等动
11、物中，也普遍存于低等动物中。于高等动物中，也普遍存于低等动物中。现在学习的是第10页，共61页现在学习的是第11页，共61页o抗菌多肽具离子通道功能，有抗细菌和真菌活性。抗菌多肽具离子通道功能，有抗细菌和真菌活性。Nisin具有更复杂的环具有更复杂的环状结构，它现被用作食品防腐剂。自状结构，它现被用作食品防腐剂。自1971年结构被确定以来，年结构被确定以来，Shiba等对等对其进行了构象研究并已化学合成。它是从霉菌中分离得到的富含其进行了构象研究并已化学合成。它是从霉菌中分离得到的富含D型氨基酸及非型氨基酸及非天然氨基酸的环肽。它不仅能抑制真菌和酵母的生长，同时也具有抗炎症活性，天然氨基酸的环
12、肽。它不仅能抑制真菌和酵母的生长，同时也具有抗炎症活性，是重要的免疫抑制剂，被用于器官移植手术中。是重要的免疫抑制剂，被用于器官移植手术中。现在学习的是第12页，共61页1、肽的分离纯化与结构鉴定、肽的分离纯化与结构鉴定 o一般地讲，用于氨基酸、肽与蛋白质的纯化方法大致相同，如层析、电泳及一般地讲，用于氨基酸、肽与蛋白质的纯化方法大致相同，如层析、电泳及离子交换等。离子交换等。近代在肽类化合物的分离方法中，最具实用价值的方法有以下近代在肽类化合物的分离方法中，最具实用价值的方法有以下几种：几种：o（1）凝胶过滤：）凝胶过滤：又称分子筛，实际上它又可视为体积排阻层析，用作又称分子筛，实际上它又可
13、视为体积排阻层析，用作支撑物的是一类多孔的高分子。在这类柱分离中，肽类混合物中的小支撑物的是一类多孔的高分子。在这类柱分离中，肽类混合物中的小分子可以进入多孔的支撑物，而大分子则不能进入。因此，大分子先分子可以进入多孔的支撑物，而大分子则不能进入。因此，大分子先洗脱下来，而小分子则随后流出，达到分类目的。如下图。洗脱下来，而小分子则随后流出，达到分类目的。如下图。现在学习的是第13页，共61页现在学习的是第14页，共61页o分子筛的种类：分子筛的种类：o葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（dextran)：商品名商品名Sephadex，有各种交联度的葡聚糖凝胶，有各种交联度的葡聚糖凝胶，根据其适用范围有根
14、据其适用范围有Sephadex G10-G20等各种不同型号。等各种不同型号。o琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶：现在常用的商品有现在常用的商品有Sepharose与与Biogel系列。系列。现在学习的是第15页，共61页(2)SDS-Page电泳电泳o聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺(polyacrylarnide)也是一种凝胶，它更多地被用作电泳支撑也是一种凝胶，它更多地被用作电泳支撑物。物。SDS-Page电泳广泛地用于肽与蛋白质的分析鉴定。电泳广泛地用于肽与蛋白质的分析鉴定。现在学习的是第16页，共61页（3）高效液相层析）高效液相层析o高效液相层析的特点是指层析是在高压下进行的，分离速度快而且是高效高效液
15、相层析的特点是指层析是在高压下进行的，分离速度快而且是高效的的，它的支撑物类型很广，只要具有大的有效的表面积的物质都可用作固定相，它的支撑物类型很广，只要具有大的有效的表面积的物质都可用作固定相，可以是交换树脂，也可以是凝胶，但最常用的硅胶，特别是衍生化了的烷基硅可以是交换树脂，也可以是凝胶，但最常用的硅胶，特别是衍生化了的烷基硅胶，即是反向高效液相层析胶，即是反向高效液相层析(RP-HPLC)，这是目前被广泛用于多肽类化合物，这是目前被广泛用于多肽类化合物的分离技术。的分离技术。在此，在此，它的固定相为非极性的烷基化硅胶，而移动相为极它的固定相为非极性的烷基化硅胶，而移动相为极性洗脱液，通常
16、为各种性洗脱液，通常为各种pH与离子浓度的缓冲液，与离子浓度的缓冲液，为了改进洗脱效果，通常为了改进洗脱效果，通常加入一些有机溶剂作改进剂，常用的溶剂，如乙腈、甲醇等，其中，尤以乙腈加入一些有机溶剂作改进剂，常用的溶剂，如乙腈、甲醇等，其中，尤以乙腈为佳，因为它黏度低并且具有良好的溶解性能。为佳，因为它黏度低并且具有良好的溶解性能。这样极性大的肽先洗脱下来，这样极性大的肽先洗脱下来，而极性小的则随后。而极性小的则随后。RP-HPLC是分离多肽混合物的有效手段。是分离多肽混合物的有效手段。如果选择好如果选择好适当条件，则可将性质非常类似结构差别很小的肽类混合物分开。适当条件，则可将性质非常类似结
17、构差别很小的肽类混合物分开。现在学习的是第17页，共61页o其他一些常用于多肽类化合物分离的技术如等电聚焦其他一些常用于多肽类化合物分离的技术如等电聚焦(isoelectric focusing)、毛、毛细管电泳细管电泳(capillary electrophoresis)及及SDS-Page电泳等同样也广泛地应用电泳等同样也广泛地应用于蛋白质的分离鉴定，较详细的叙述见蛋白质部分。于蛋白质的分离鉴定，较详细的叙述见蛋白质部分。现在学习的是第18页，共61页 2、肽的合成、肽的合成o从从19世纪世纪80年代年代EFischer与与TCurtius第一次成功地合成多肽开始，第一次成功地合成多肽开始
18、，迄今已有一百多年历史。近年来，由于有机合成化学与近代分析技术的迄今已有一百多年历史。近年来，由于有机合成化学与近代分析技术的进步，使得多肽合成化学更趋成熟。特别是固相合成技术的发展圾随之进步，使得多肽合成化学更趋成熟。特别是固相合成技术的发展圾随之而实现的机械化、自动化，使得快速、方便地合成多肽成为现实。而实现的机械化、自动化，使得快速、方便地合成多肽成为现实。大多大多数肽类化合物在自然界存在很少，而且还存在一些结构上的不稳定性，数肽类化合物在自然界存在很少，而且还存在一些结构上的不稳定性，而化学合成的多肽或修饰的多肽类化合物可以克服这些缺点，可以提使而化学合成的多肽或修饰的多肽类化合物可以
19、克服这些缺点，可以提使种类繁多的多肽类药物，在生命科学的发展中起了重要作用。种类繁多的多肽类药物，在生命科学的发展中起了重要作用。现在学习的是第19页，共61页o要实现一个简单二肽的合成，通常步骤是：要实现一个简单二肽的合成，通常步骤是：首先将作为羧基组分的氨基酸的氨首先将作为羧基组分的氨基酸的氨基加以保护，同时将作为氨基组分的氨基酸的羧基加以保护。基加以保护，同时将作为氨基组分的氨基酸的羧基加以保护。反应如下：反应如下：o其次，活化羧基组分中的羧基：其次，活化羧基组分中的羧基：活化羧基的方法很多，可通过形成酰卤、活化羧基的方法很多，可通过形成酰卤、酸酐或各种类型的活化酯或其他活性衍生物以实现
20、羧基的活化。酸酐或各种类型的活化酯或其他活性衍生物以实现羧基的活化。现在学习的是第20页，共61页o（1）氨基的保护。）氨基的保护。在种类繁多的氨基保护基中，最常用的还是氨基甲酸酯在种类繁多的氨基保护基中，最常用的还是氨基甲酸酯(urethane或或carbamate)。其中最常用的与最具代表性的有其中最常用的与最具代表性的有苄氧羰酰基苄氧羰酰基(benzyloxycarbonyl，Z)，叔丁氧羰酰基，叔丁氧羰酰基(t-butyloxycarbonyl,BOC)及芴甲氧羰及芴甲氧羰酰基酰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl，Fmoc)。o（2）羧基的保护。）羧基的保护。相对
21、于氨基保护而言，羧基的保护基种类要简单得多。相对于氨基保护而言，羧基的保护基种类要简单得多。在最在最简单的情况下通过与碱金属成盐就可保护。简单的情况下通过与碱金属成盐就可保护。通常都是酯化成甲酯、乙酯、通常都是酯化成甲酯、乙酯、叔丁酯或苄酯等保护。叔丁酯或苄酯等保护。甲酯或乙酯可通过皂化脱除，而苄酯则用催化氢甲酯或乙酯可通过皂化脱除，而苄酯则用催化氢解脱除。叔丁酯的脱除则通常用酸解解脱除。叔丁酯的脱除则通常用酸解(HCl、CF3COOH等等)实现。实现。现在学习的是第21页，共61页o（3）侧链基团的保护。）侧链基团的保护。在天然氨基酸中，有些还带有功能侧链，如半胱氨在天然氨基酸中，有些还带有
22、功能侧链，如半胱氨酸的巯基、丝氨酸与酪氨酸的羟基、精氨酸的胍基和组氨酸的咪唑基等。这酸的巯基、丝氨酸与酪氨酸的羟基、精氨酸的胍基和组氨酸的咪唑基等。这些功能团一般都需要加以保护。些功能团一般都需要加以保护。这些保护基团的选择应与这些保护基团的选择应与a-氨基与羧基的保氨基与羧基的保护基团协调配合。护基团协调配合。o（4）肽键的形成。）肽键的形成。正如前述，几乎所有肽键形成的方法都是活化羧基组正如前述，几乎所有肽键形成的方法都是活化羧基组分中的羧基，以利于氨基的亲核进攻。早期应用的方法如酰氯分中的羧基，以利于氨基的亲核进攻。早期应用的方法如酰氯(RCOCl)、叠氮叠氮(RCON3)由于存在一些缺
23、点，现已较少应用。由于存在一些缺点，现已较少应用。现在形成肽键的常用现在形成肽键的常用方法有活化酯法、酸酐法及缩合剂。方法有活化酯法、酸酐法及缩合剂。现在学习的是第22页，共61页o（5）肽的固相合成。）肽的固相合成。上述的肽键形成方法对于液相或固相肽合成都是相同的，上述的肽键形成方法对于液相或固相肽合成都是相同的，但在实现的方式或手段上却是不同的。但在实现的方式或手段上却是不同的。固相合成是以一种不溶的高分子为载体，固相合成是以一种不溶的高分子为载体，实现在半杂相情况下的缩合，用过量的反应物与缩合剂以使缩合反应接近完实现在半杂相情况下的缩合，用过量的反应物与缩合剂以使缩合反应接近完全，过量缩
24、合剂与反应物则用简单的洗涤方法除去。连接在不溶的高分子物全，过量缩合剂与反应物则用简单的洗涤方法除去。连接在不溶的高分子物上的肽再经过重复的操作方式增长。上的肽再经过重复的操作方式增长。以合成一个含以合成一个含A、B、C、D、E、F的六的六肽为例，其合成流程如图肽为例，其合成流程如图11-6所示。所示。现在学习的是第23页，共61页现在学习的是第24页，共61页第三节第三节 蛋蛋 白白 质质 o蛋白质在生命科学中的重要性是不言而喻的，在生物体的各种组织中都广泛蛋白质在生命科学中的重要性是不言而喻的，在生物体的各种组织中都广泛存在。它是存在。它是生物催化剂一生物催化剂一酶酶；保护性蛋白保护性蛋白
25、抗体抗体；调节蛋白调节蛋白DNA结结合蛋白和激素；合蛋白和激素；结构蛋白结构蛋白胶原胶原及传送蛋白及传送蛋白血红蛋白血红蛋白等的主要组分。等的主要组分。o近年来，我国科学工作者从天然产物中分离到许多具有重要生理功能近年来，我国科学工作者从天然产物中分离到许多具有重要生理功能的蛋白质，特别是从葫芦科植物如栝楼、苦瓜子和王瓜中分离到许多的蛋白质，特别是从葫芦科植物如栝楼、苦瓜子和王瓜中分离到许多活性蛋白。其中天花粉蛋白的结构鉴定与生理活性研究是我国科学工活性蛋白。其中天花粉蛋白的结构鉴定与生理活性研究是我国科学工作者通力协作所取得的重大成果。本章即从它的分离、提纯、结构测作者通力协作所取得的重大成
26、果。本章即从它的分离、提纯、结构测定等的实际方法来了解如何从天然产物中分离生物活性蛋白质，这是定等的实际方法来了解如何从天然产物中分离生物活性蛋白质，这是很具代表性的工作；同时也了解蛋白质结构测定方法的最新进展。很具代表性的工作；同时也了解蛋白质结构测定方法的最新进展。现在学习的是第25页，共61页o本节以天花粉蛋白为实例，对天然产物中蛋白质的提取、分离、纯化、纯度本节以天花粉蛋白为实例，对天然产物中蛋白质的提取、分离、纯化、纯度鉴定、结构测定和结构与功能关系作系统的论述。鉴定、结构测定和结构与功能关系作系统的论述。o天花粉蛋白是从中草药栝楼的根中提取的。栝楼根又称天花粉，其中的天花粉蛋白是从
27、中草药栝楼的根中提取的。栝楼根又称天花粉，其中的蛋白质是我国独创的计划生育和治疗宫外孕、葡萄胎、恶性葡萄胎、死蛋白质是我国独创的计划生育和治疗宫外孕、葡萄胎、恶性葡萄胎、死胎、植入性胎盘等的良药。胎、植入性胎盘等的良药。1989年，美国又发现天花粉蛋白能抑制年，美国又发现天花粉蛋白能抑制HIV的复制和繁殖，用于治疗艾滋病。的复制和繁殖，用于治疗艾滋病。o业已证明业已证明天花粉蛋白也是一个单链核糖体失活蛋白属天花粉蛋白也是一个单链核糖体失活蛋白属RNAN一糖苷酶型。一糖苷酶型。它能专一性水解它能专一性水解28S rRNA第第4324位腺苷酸的位腺苷酸的N-C糖苷键，释放出一个腺嘌糖苷键，释放出一
28、个腺嘌呤碱基，使核糖体失活，这类蛋白质广泛存在于天然产物中。呤碱基，使核糖体失活，这类蛋白质广泛存在于天然产物中。现在学习的是第26页，共61页一、分离纯化一、分离纯化 o一般蛋白质的分离纯化可以按溶解度不同进行初步的分离，一般蛋白质的分离纯化可以按溶解度不同进行初步的分离，如如用无机盐用无机盐最常最常用用(NH4)2S04或有机溶剂或有机溶剂(如丙酮、乙醇等如丙酮、乙醇等)沉淀；沉淀；按分子大小的不同进行按分子大小的不同进行分离，如各种类型的分子筛分离，如各种类型的分子筛(Sephadex葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、Bio-gd生物凝胶生物凝胶)、SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)凝胶电泳，
29、各种不同孔径的透析袋或超滤膜；凝胶电泳，各种不同孔径的透析袋或超滤膜；按电荷性质按电荷性质不同进行分离纯化，如各种类型的离子交换树脂和等电聚焦等方法；不同进行分离纯化，如各种类型的离子交换树脂和等电聚焦等方法；根据生根据生物活性的不同，如亲和层析；物活性的不同，如亲和层析；也可以用结晶方法；也可以用结晶方法；高效液相色谱等方法进高效液相色谱等方法进一步纯化。一步纯化。现在学习的是第27页，共61页1、丙酮分级沉淀、丙酮分级沉淀(精制天花粉蛋白精制天花粉蛋白)o采集采集10 Kg新鲜天花粉块根，去皮，捣碎，榨汁，过滤，得新鲜天花粉块根，去皮，捣碎，榨汁，过滤，得2000 mL原汁。原汁。将上清液
30、冷却到将上清液冷却到5以下，用以下，用2mol/L盐酸调盐酸调pH到到4左右，即有沉淀析出。然左右，即有沉淀析出。然后在后在5以下再慢慢加入以下再慢慢加入1600 mL(用原汁体积的用原汁体积的08倍倍)冰冷的丙酮，有沉冰冷的丙酮，有沉淀析出。用冷冻离心机离心淀析出。用冷冻离心机离心20min(0-5，1500r/min),除去沉淀。上清液除去沉淀。上清液A在在5以下再加入以下再加入800mL冰冷的丙酮，有沉淀析出，在同样条件下离心，得冰冷的丙酮，有沉淀析出，在同样条件下离心，得沉淀和上清液沉淀和上清液B。所得沉淀用。所得沉淀用l00mL蒸馏水溶解，对流水透析蒸馏水溶解，对流水透析3648 h
31、，离心，弃去沉淀，清液离心，弃去沉淀，清液C冷冻干燥，得冷冻干燥，得10-15 g干粉即为精制天花粉蛋白，得干粉即为精制天花粉蛋白，得率为率为0.1-0.15。上清液。上清液B内含有热原性糖蛋白、游离氨基酸和多糖等，从内含有热原性糖蛋白、游离氨基酸和多糖等，从中还可以回收丙酮中还可以回收丙酮(如图如图11-7)。现在学习的是第28页，共61页现在学习的是第29页，共61页2、结晶天花粉蛋白的制备、结晶天花粉蛋白的制备 o1g精制天花粉蛋白溶于精制天花粉蛋白溶于10 mL蒸馏水，离心，除去不溶物质。上清液装人透蒸馏水，离心，除去不溶物质。上清液装人透析袋在冰箱中用析袋在冰箱中用pH=8.6巴比妥
32、缓冲液透析。一星期内有长方片状结晶生长，得巴比妥缓冲液透析。一星期内有长方片状结晶生长，得300mg左右结晶天花粉蛋白。左右结晶天花粉蛋白。现在学习的是第30页，共61页3、层析方法、层析方法o（1）葡聚糖凝胶（）葡聚糖凝胶（Sephadex）层析：）层析：从天花粉压汁后的残渣中用生理盐水提从天花粉压汁后的残渣中用生理盐水提取和硫酸铵沉淀法得到栝楼蛋白的粗提取和硫酸铵沉淀法得到栝楼蛋白的粗提物，再经物，再经Sephadex G-75分离得到两分离得到两个峰。第二个峰（主峰）含有栝个峰。第二个峰（主峰）含有栝楼蛋白。如图楼蛋白。如图11-8。现在学习的是第31页，共61页o（2）羧甲基葡聚糖凝胶
33、法）羧甲基葡聚糖凝胶法:这这种凝胶把羧甲基种凝胶把羧甲基(-O-CH2-COONa+)阳离子交换基团阳离子交换基团接到葡聚糖上使这种凝胶接到葡聚糖上使这种凝胶既具有离子交换作用，又既具有离子交换作用，又具有分子筛作用，分离效具有分子筛作用，分离效果较好。例如，丙酮沉淀果较好。例如，丙酮沉淀天花粉蛋白用羟甲基葡聚天花粉蛋白用羟甲基葡聚糖凝胶分离后主要可得糖凝胶分离后主要可得4个个峰，如图峰，如图11-9。现在学习的是第32页，共61页二、纯度的鉴定二、纯度的鉴定o1、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(简称简称SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法法)鉴
34、定分子大小鉴定分子大小o按常法用按常法用SDS凝胶电泳法鉴定天花粉蛋白。因为蛋白质经凝胶电泳法鉴定天花粉蛋白。因为蛋白质经SDS处理后，带有负处理后，带有负电荷，在电泳中向正极移动，其电泳迁移率只与相对分子质量大小有关，借电荷，在电泳中向正极移动，其电泳迁移率只与相对分子质量大小有关，借此可以鉴定蛋白质的相对分子质量与均一性。电泳用此可以鉴定蛋白质的相对分子质量与均一性。电泳用0.1mol/L,pH=7.2磷酸盐磷酸盐缓冲液系统，凝胶浓度为缓冲液系统，凝胶浓度为10丙烯酰胺，用考马斯亮蓝丙烯酰胺，用考马斯亮蓝R250染色，其结果如图染色，其结果如图11-10结晶天花粉蛋白只出现一条色带，显示其
35、分子是均一的。结晶天花粉蛋白只出现一条色带，显示其分子是均一的。o另外，用分子筛如葡聚糖凝胶分离结晶天花粉蛋白也只显一峰，也证明另外，用分子筛如葡聚糖凝胶分离结晶天花粉蛋白也只显一峰，也证明其分子大小是均一的。其分子大小是均一的。现在学习的是第33页，共61页现在学习的是第34页，共61页2、从电荷性质方面鉴定、从电荷性质方面鉴定 o采用采用pH=4.3氢氧化钾氢氧化钾-乙酸系统，聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳乙酸系统，聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳(丙烯酰胺的浓丙烯酰胺的浓度为度为15)所得结果见图所得结果见图11-11。结晶天花粉蛋白只有一条色带，粗制天。结晶天花粉蛋白只有一条色带，粗制天花粉蛋白由十几条
36、色带。粗制天花粉蛋白经羧甲基葡聚糖凝胶分离后，花粉蛋白由十几条色带。粗制天花粉蛋白经羧甲基葡聚糖凝胶分离后，其峰其峰1、2、3、4和和5在此系统中电泳位置不同在此系统中电泳位置不同(图图11-12)，说明这些蛋白质，说明这些蛋白质等电点不同。等电点不同。现在学习的是第35页，共61页现在学习的是第36页，共61页现在学习的是第37页，共61页 3、免疫血清法鉴定、免疫血清法鉴定 o一般特异性蛋白质都有抗原性，注射到各种动物一般特异性蛋白质都有抗原性，注射到各种动物(如羊、兔等如羊、兔等)体内，能在体内，能在这些动物血清中产生专一性的抗体。天花粉蛋白也有强抗原性，如把粗制天花粉蛋这些动物血清中产
37、生专一性的抗体。天花粉蛋白也有强抗原性，如把粗制天花粉蛋白多次注射到兔或羊等动物体内，白多次注射到兔或羊等动物体内，12个月后它们的血清中会含天花粉蛋白抗个月后它们的血清中会含天花粉蛋白抗体，取这种免疫血清做免疫电泳。用离子强度为体，取这种免疫血清做免疫电泳。用离子强度为0.05、pH=8.8的巴比妥缓冲的巴比妥缓冲液配成液配成03琼脂糖溶液，铺于琼脂糖溶液，铺于3cm7.5 cm的玻片上，在凝胶板上两边挖两的玻片上，在凝胶板上两边挖两个小孔，分别加粗制天花粉蛋白和结晶天花粉蛋白溶液，在个小孔，分别加粗制天花粉蛋白和结晶天花粉蛋白溶液，在pH=8.8巴比妥缓冲巴比妥缓冲液中电泳后，在中间开一条
38、窄槽，加粗制天花粉蛋白免疫血清，在密闭缸中任液中电泳后，在中间开一条窄槽，加粗制天花粉蛋白免疫血清，在密闭缸中任其扩散。抗体与抗原结合产生白色沉淀形成一条弧线，然后彻底洗去粗制天花其扩散。抗体与抗原结合产生白色沉淀形成一条弧线，然后彻底洗去粗制天花粉蛋白免疫血清，用氨基黑粉蛋白免疫血清，用氨基黑10B染色，其结果见图染色，其结果见图11-13。粗制天花粉蛋白显。粗制天花粉蛋白显示有五六条弧线，结晶天花粉蛋白只有一弧线，证明天花粉蛋白在免疫示有五六条弧线，结晶天花粉蛋白只有一弧线，证明天花粉蛋白在免疫特性上也是均一的。特性上也是均一的。现在学习的是第38页，共61页现在学习的是第39页，共61页
39、4、N末端氨基酸的鉴定末端氨基酸的鉴定o按常法用二甲氨基萘磺酰氯按常法用二甲氨基萘磺酰氯(dansyl chloride)和和4-N，N-二甲胺基偶氮苯二甲胺基偶氮苯-4-异异硫氰酸酯硫氰酸酯(4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4-isothiocyanate，DABITC)分别测定天花粉蛋白的分别测定天花粉蛋白的N末端，结果都证明为单一的天冬氨酸末端，结果都证明为单一的天冬氨酸(图图11-14)。现在学习的是第40页，共61页现在学习的是第41页，共61页5、C末端氨基酸的检定末端氨基酸的检定o按常法用羧肽酶、肼解、乙内酰硫脲等法测定天花粉蛋白的按常法用羧肽酶、肼解
40、、乙内酰硫脲等法测定天花粉蛋白的C末端，末端，不能得到肯定的结论。肼解法结果，出现甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸等，不能得到肯定的结论。肼解法结果，出现甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸等，都有可能是都有可能是C末端氨基酸；乙内酰硫脲法出现丙氨酸和甲硫氨酸；羧末端氨基酸；乙内酰硫脲法出现丙氨酸和甲硫氨酸；羧肽酶肽酶A显示丙氨酸和甲硫氨酸两个显示丙氨酸和甲硫氨酸两个C末端氨基酸的可能。最后根据计算机辅助的末端氨基酸的可能。最后根据计算机辅助的羧肽酶法测定羧肽酶法测定C末端是不均一的，有两个：一是甲硫氨酸；二是丙氨酸。这类末端是不均一的，有两个：一是甲硫氨酸；二是丙氨酸。这类末端微观不均一性的情况在植物性蛋白并不
41、是独有的。末端微观不均一性的情况在植物性蛋白并不是独有的。现在学习的是第42页，共61页6、氨基酸测定、氨基酸测定o每一种均一性蛋白质应该有恒定的氨基酸组成，按常法将不同批号的每一种均一性蛋白质应该有恒定的氨基酸组成，按常法将不同批号的结晶天花粉蛋白用结晶天花粉蛋白用5.7 molL盐酸在封管中盐酸在封管中105水解水解24h，减压浓缩除去，减压浓缩除去盐酸后，经氨基酸分析仪分析其氨基酸组成恒定。盐酸后，经氨基酸分析仪分析其氨基酸组成恒定。7、结晶、结晶o用结晶的方法来纯化蛋白质，也是一种重要手段。天花粉蛋白在巴比妥缓冲液中用结晶的方法来纯化蛋白质，也是一种重要手段。天花粉蛋白在巴比妥缓冲液中
42、得单斜晶系晶体，而在柠檬酸缓冲液中得单斜晶系晶体，而在柠檬酸缓冲液中(pH=54)可获得正交晶系单晶。可获得正交晶系单晶。现在学习的是第43页，共61页8、生物活性、生物活性o每一种均一性蛋白质应该有一定的生物活性每一种均一性蛋白质应该有一定的生物活性(当然要在不变性失活情况下当然要在不变性失活情况下)，结晶天花粉蛋白的生物活性结晶天花粉蛋白的生物活性ED50为为0.31 mgkg。9、毛细管电泳、毛细管电泳 o如用毛细管电泳可以证明天花粉蛋白与栝楼蛋白不同。把天花粉蛋白和栝如用毛细管电泳可以证明天花粉蛋白与栝楼蛋白不同。把天花粉蛋白和栝楼蛋白混合后做毛细管电泳得到明显的两个峰。如图楼蛋白混合
43、后做毛细管电泳得到明显的两个峰。如图11-15。10、高效液相色谱、高效液相色谱(HPLC)o栝楼蛋白用栝楼蛋白用HPLC检定得到很好的一个峰，如图检定得到很好的一个峰，如图11-16。现在学习的是第44页，共61页11、质谱、质谱o20世纪世纪80年代末年代末90年代初，由于质谱技术的发展，一种被称为年代初，由于质谱技术的发展，一种被称为电喷雾电离电喷雾电离质谱质谱(electrospray ionizati0MS，ESIMS)；另一种被称为；另一种被称为基质辅助激光解基质辅助激光解析电离飞行时间质谱析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ion
44、ization-time of flight-MS，MALDI-TOF-MS)，解决了极性大、热不稳定的蛋白质、多肽离子解决了极性大、热不稳定的蛋白质、多肽离子化和相对分子量测定问题，只要蛋白质在相对分子质量方面不均一用质谱方法立化和相对分子量测定问题，只要蛋白质在相对分子质量方面不均一用质谱方法立即能够检出，即能够检出，如天花粉蛋白如天花粉蛋白C端不均匀，一个为端不均匀，一个为Met，另一个为，另一个为Ala。用质。用质谱方法检出两个峰，其他方法都无法检出，因此谱方法检出两个峰，其他方法都无法检出，因此质谱已成为蛋白质纯度质谱已成为蛋白质纯度检定和生物大分子结构测定的一种非常有效的方法，检定
45、和生物大分子结构测定的一种非常有效的方法，如图如图11-17。发明这两。发明这两种质谱的科学家都获得种质谱的科学家都获得2002年诺尔化学奖。年诺尔化学奖。现在学习的是第45页，共61页现在学习的是第46页，共61页三、蛋白质的物理化学性质三、蛋白质的物理化学性质 o蛋白质可以是简单蛋白质，其结构全部由氨基酸组成蛋白质可以是简单蛋白质，其结构全部由氨基酸组成，如胰岛素、血清白蛋白、，如胰岛素、血清白蛋白、天花粉蛋白等；天花粉蛋白等；也可以是结合蛋白，除了氨基酸外还有其他辅基也可以是结合蛋白，除了氨基酸外还有其他辅基如核蛋如核蛋白结合核酸；脂蛋白结合脂类，如磷脂、胆固醇；糖蛋白结合糖类。白结合核
46、酸；脂蛋白结合脂类，如磷脂、胆固醇；糖蛋白结合糖类。o蛋白质的物理化学性质除了上述简单蛋白外，结合蛋白质的相对分子质量、等电蛋白质的物理化学性质除了上述简单蛋白外，结合蛋白质的相对分子质量、等电点、氨基酸组成、点、氨基酸组成、N端、端、C端等都是非常重要的数据。端等都是非常重要的数据。现在学习的是第47页，共61页四、蛋白质一级结构的测定四、蛋白质一级结构的测定 o在用各种方法鉴定蛋白质纯度是均一后在用各种方法鉴定蛋白质纯度是均一后(纯度在纯度在95以上以上)，可以测定蛋，可以测定蛋白质的一级结构。蛋白质一级结构的测定目前已有很多方法，如白质的一级结构。蛋白质一级结构的测定目前已有很多方法，如
47、化学方化学方法利用法利用Edman降解从降解从N端开始逐个测定，端开始逐个测定，用基因方法和物理方法如质谱、核磁用基因方法和物理方法如质谱、核磁共振等。共振等。本节主要介绍本节主要介绍Edman降解法，其降解法，其基本反应是通过三个步骤偶联、裂基本反应是通过三个步骤偶联、裂解、转化和解、转化和PTH氨基酸检定。氨基酸检定。现在学习的是第48页，共61页1、偶联、偶联o蛋白质和多肽的自由蛋白质和多肽的自由a-氨基经与异硫氰酸苯酯氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂偶联后，与其紧挨的试剂偶联后，与其紧挨的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。反应如下：第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。反应
48、如下：现在学习的是第49页，共61页2、裂解、裂解o在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的第二个氨基酸在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的残基暴露出自由的a一氨基，又可与一氨基，又可与PITC进行偶联反应。进行偶联反应。现在学习的是第50页，共61页3、转化、转化oATZ-氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液(25)条件下可转化成稳定的条件下可转化成稳定的PTH-氨基酸氨基酸(图图11-21)。现在学习的是第51页，共61页4、PTH-氨基酸的鉴定氨基酸的鉴定o可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段
49、进行分可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。近年来，由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性析。近年来，由于高效液相色谱技术具有分析速度快、灵敏度高、定性定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于定量准确等诸多优点，并且仪器自身结构也日臻完善，被广泛应用于PTH-氨基酸的鉴定。氨基酸的鉴定。通常选用通常选用C-18反相柱进行分离。反相柱进行分离。o蛋白质化学方法的顺序测定现在一般都用仪器，可以详见夏其昌主编的蛋白质化学方法的顺序测定现在一般都用仪器，可以详见夏其昌主编的蛋白质蛋白质化学研究技术与进展化学研究技术与进展)一书一书(1997年
50、，北京，科学出版社年，北京，科学出版社)。o在没有顺序仪的实验室也可以用手工在没有顺序仪的实验室也可以用手工DABITCPITC双偶合法测定，该双偶合法测定，该法具有简便有效快速等优点。法具有简便有效快速等优点。现在学习的是第52页，共61页o DABITCPITC双偶合微量顺序测定法，是用有色试剂双偶合微量顺序测定法，是用有色试剂DABITC与多肽或蛋与多肽或蛋白质的氨基做第一次偶合，因该偶合反应产率只有白质的氨基做第一次偶合，因该偶合反应产率只有20-50，余下没有与，余下没有与DABITC偶合的氨基再用偶合的氨基再用PITC做第二次偶合，由于做第二次偶合，由于PITC 与多肽或蛋白质与多