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1、中国海洋大学硕士学位论文海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术姓名：戈蕾申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：黄倢;李琪20070604海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：j 运晦签字日期：砷0 7 年6 月7 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全
2、了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：戈彰导师签字；力往签字日期：卅年6 月7 日签字日期：_ 1 年6 月7 日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术摘要弧菌广泛分布于近海及河口的海洋环境，已经证明有多种弧菌是鱼类的重要条件性致病菌。弧菌
3、病是引起全球水产养殖业病害泛滥、造成巨大经济损失的鱼类细菌病。弧菌的致病机理与它携带几种重要毒力基因有关，这些毒力基因编码不同的毒力因子，分别行使不同的功能，2 0 世纪9 0 年代发展起来的基因芯片技术，共同协作形成一套复杂的致病机制。在是高通量、微型化和自动化的新型分子生物学技术，是基因功能研究的有力工具。将该技术应用于水产动物病害监测，进行快速有效的早期诊断对防治工作来说是很重要的。采用十字交叉划线法、点种法和平板扩散法从1 6 0 株海洋细菌中筛选出1 株对鳗弧菌和哈维氏弧菌的生长有一定抑制作用的海洋细菌2 0 0 4 1 0 3 1 0 1。将病原菌接种到2 0 0 4 1 0 3
4、1 0 1 菌的除菌培养上清中，设定对照组，通过在不同培养时间测量培养液的O D 6 0 0 再次确认其培养上清中是否含有抑制病原菌生长的物质。结果显示，这株菌对两种病原菌均有一定的生长抑制作用。2 0 0 4 1 0 3 1 0 1 菌革兰氏染色阴性，弯曲短杆状，T C B S 培养基上菌落呈半透明黄色湿润扁圆形，有较强的体外溶血性，生理生化实验结果表明该菌与鳗弧菌相似。进一步对其1 6 Sr R N A 的序列进行P C R 测序和构建系统发育树，结果显示2 0 0 4 1 0 3 1 0 1 菌与鳗弧菌自然聚类，亲缘关系最近。综合上述结果可将2 0 0 4 1 0 3 1 0 1 菌鉴定
5、为鳗弧菌。将这种拮抗菌对大菱鲆进行腹腔注射感染实验，以注射鳗弧菌和海水鱼用生理盐水分别作为阳性和阴性对照，经过1 4 天的观察和结果分析，结果发现这株菌的毒力相对于鳗弧菌而言是很低的。为进一步探讨其毒力损失原因，针对鳗弧菌的毒力表型相关基因v a i l,e m p A,v i r C，v i r A,f l a A 和a n g M 以及1 6 8r R N A 设计了7 对P C R 弓l物，以鳗弧菌和2 0 0 4 1 0 3 1 0 1 菌的基因组D N A 为模板进行P C R 扩增，发现与鳗弧菌相比较，2 0 0 4 1 0 3 1 0 1 菌缺失与表面抗原合成有关的v i r C
6、 基因，并且a n g M 基因扩增片断的数量和大小也与鳗弧菌有一定不同。a n g M 基因是鳗弧菌质粒p J M l和p E I B I 所共有的，编码非核糖体多肽合成酶。l海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术利用基因芯片高通量、平行性的特点，选择针对各弧菌的1 6 Sr R N A、h s p 6 0和2 至6 个不等的毒力相关基因，设计了由2 9 个探针组成的寡核苷酸芯片和2 8对基因特异性引物。利用国际生物技术信息中心网站(h t t p：w w w n c b i n l m n i h g o v)进行每个基因序列的B L A S T 搜索和相关文献的检索，检索到各基因
7、的同源序列后，再将各基因与其同源序列用o m i g a 软件进行比对，找出保守区和特异区，分别处理保存后导入A l l c l d D3 0 软件或A r r a yD e s i g n e r4 0 软件，设计扩增产物片段长度为2 0 0 5 0 0 b p 的引物和长度为4 5 5 5 b p的探针。将设计好的探针再全部导入o m i g a 软件进行比对，确定探针之间最多不超过四个连续碱基相同，而且位置刚好处于引物扩增区，然后交由基因公司合成。将合成后的探针按照设定的位置分布用手动点样仪点在尼龙膜上，经紫外交联后固定在膜上组成寡核苷酸膜芯片。用酚一氯仿抽提法提取细菌总D N A 作为
8、P C R 的模板，然后用基因特异性引物加入地高辛标记的d U T P 扩增并标记各菌株的待测目的片段，标记后的P C R 产物用1 的琼脂糖凝胶电泳检查后测定标记产量，然后配制成2 0 n g m l 的杂交液同时与膜芯片进行杂交，对杂交时间、P C R 产物浓度设计梯度试验以优化反应条件，检测芯片的灵敏度。杂交结束后的反应信号用N B T-B C I P 液显色后进行分析。试验结果显示其中1 2 个毒力相关基因均能特异性显色，无其它交叉反应，可以作为菌株是否含有该毒力基因的检测方法，作为菌株是否致病的重要参考指标，而每种弧菌的1 6 Sr R N A 和h s p 6 0 探针点(共1 0
9、 个)则都会与其它一至三种弧菌的1 6 Sr R N A、h s p 6 0 发生交叉反应(溶藻胶的h s p 6 0 除外)，其反应信号不能作为菌种准确鉴定的依据，只能作为菌株是否是弧菌的鉴定依据。试验中溶藻胶弧菌的o m p、副溶血弧菌的自m、费氏弧菌的a m p C 在P C R 反应中能很好的扩增出单一的目的条带，但在杂交信号中没有出现显色反应。试验中费氏弧菌的o m p和e n f,灿烂弧菌的a e l v 和v s m 未能扩增出目的条带，因这些基因有菌株特异性，说明试验菌株不是具有该基因的菌株。芯片检测灵敏度可达到2 5 6 n g 目的基因，相当于1 2 8 p g 细菌D N
10、 A。结果证明本试验中的膜芯片在结合1 6 Sr R N A、h s p 6 0和毒力基因共同组成的图谱中，能够准确鉴别出鳗弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌和费氏弧菌等六种弧菌，以及样品是否含有试验所涉及2海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术的毒力基因。关键词：弧菌毒力基因P G R 地高辛杂交膜芯片拮抗检测海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术D e v e l o p m e n to fm e m b r a n ec h i pt e c h n o l o g ya b o u ti d e n t i f i c a t i o na n dv
11、i r u l e n c eg e n e sd e t e c t i o no fm a r i n ef i s hv i b r i o sA B S I R A C TV i b r i o s i si sf i s hd i s e a s er e s p o n s i b l ef o rc o n s i d e r a b l ee c o n o m i ch a r d s h i pt om a r i c u l t u r eo p e r a t i o n sw o r l d w i d e B o t hp a t h o g e n i ca n
12、dn o n-p a t h o g e n i cs t r a i n se x i s ti nt h em a r i n e 矗妣d e t e c t i o no ft h ev i _ r u l e l l c eg e n e sw i Hh e l pi nd i f f e r e n t i a t i o no fp a t h o g e n i cs t r a i n s C o n v e n t i o n a lm i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d si d e n t i f y i n gt h e s e
13、o r g a n i s m sa o f t e nl i m i t e db yt h el e n g t ho ft i m er e q u i r e dt oc o m p l e t et h ea s s a y s 1 1 垃r e q u i r e m e n tf o rm u l t i p l e xd e t e c 缸o no faw i d er a n g eo fp o t e n t i a lp a t h o g e n sh a sn e v e rb e e ng r e a t e r R e c e n t l y,h u g ep o
14、 t e n t i a lo f m i c r o a r r a yg e n e r a t e sc o n s i d e r a b l ei n t e r e s tf o ri t su t i l i t y 嬲ad i a 掣l o s 6 ct 0 0 1 T h u s，i nt h i ss t u d yw ed e v e l o p et h i st e c h n o l o g yi n c l u d e dt h ed e s i g na n de v a l u a t i o no fP C Rc o u p l e dw i t hal o
15、 w-d e n s i t yo l i g o n u l e o t i d em e m b r a n ec h i pf o rt h ed e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o nt h ep r e s e n c eo fs p e c i f i cm a r k e r si nb a c t e r i a lg e n o m e sa s s o c i a t e dw i t hp a t h o g e n e s i so fs e l e c t e dm a l i n ef i s hp a t h
16、 o g e n s At o t a lo fm o r et h a n1 6 0s t r a i n sb a c t e r i a,i s o l a t e c lf r o mm a r i n ef i s h,s h r i m pa n da q u a t i ce n v i r o n m e n t，B x ee x a m i n e df o rt h e i ri n h i b i t o r ya c t i v i t i e st op a t h o g e n i cb a c t e r i ab yu s i n gc r o s s-s t
17、 r e a k i n gm e t h o d，d o t-i n o c u l a t i n gm e t h o da n ds c r i pd i f f u s i o na s s a yO B2 2 1 6 Ep l a t e s T w op a t h o g e n i cv i b r i o s(v i b r i oa n g n i l l a r t t ma n dV i b d oh a r v e y i)a l eu s e da si n d i c a t i n gs t r a i n s u s i n gp r e p a r a t
18、 o r ys e l e c t i o nm e t h o d s，2 0 0 4 1 0 31 0 1i ss e l e c t e db yi t si n h i b i t o r ya c t i v i t i e st ot h ei n d i c a t i n gs t r a i n s t h ee v i d e n tc l e a rz o n e sa r eo b s e r v e da r o u n dt h ep a t h o g e n i cb a c t e r i a T h e nt h ei n d i c a t i n gs
19、w a i n s 黜i n o c u l a t e di ns t e r i l ec u l t i v a t e ds u p e m a t a n to ft h ei n h i b i t o rr e s p e c t i v e l y,s t e r i l ec u l t i v a t e db-q l p e l l l a l a i l ti sm a k e db yp e r c o l a t i o n A f t e ri n c u b a t i o nf o rp e r i o do f t i m e，m s u r i n gt
20、h ev a l u eo f t h e i rO D 6 0 0t ov e d f y i n gi t Sr e s t r a i n i n gf u n c t i o n T h er e s u l ts h o w st h a ta n t a g n n i s l i cb a c t e r i u m2 0 0 4 1 0 3 1 0 1r e a l l yh a si n h i b i t o r ya c t i v i t i e st ot h ei n 凼c a l i n gs t r a i n s S t r a i n2 0 0 4 1 0
21、3 1 0 1i sah a l o p h i l i c，g r a m-n e g a t i v e，c l l r v c-s h a p e db a c t e r i u m I tc 趾m a k eT C B Sc u l t u r em e d i u my e l l o w,a n di th a ss t r o n gh a e m o l y t i ca c t i v i t y T h ec l o n ei sr o u n d，s e m i t r a n s p a r e n ta n dw e t a s h,A c c o r d i n
22、gt ot h ec l o n ec h a r a c t e r,p h y s i o l o g i c a l，b i o c h e m i c a lr e s u l t sa n dt h es e q u e n c eo f1 6 Sr i b o s o m a lD N A(1 6 Sr R N A)，i t S4海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术i d e n t i f i e da sv i b r i oa n g u i l l a r u m T u r b o t sa l gc h a l l e n g e dw i t hs t r
23、a i n2 0 0 4 1 0 3 1 0 1a n dv i b r i oz m g u i l l a r a m S t r a i n2 0 0 4 1 0 3 1 0 1i sa t t a n u a t e ds h a r p l yv i r u l e n tb yi n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o nt h a nt h eV i b r i oa n g r u l l l a l a m l I no r d e rt oe x p l o r et h er e f l s o no ft h i sv a
24、n g n i l l a r u m Sv i f l l l e n c el o s s，S e v e ns e t so fp r i m e r sa r cd e s i g n e df o rs i xv i r u l e n o og e n e sy a h,e m p A,v i r C，v i r A,f l a A，a n g Ma n d1 6 Sr R N A，t h eg e n o m eD N Ao fv i b r i oa n g u l n a r a ma n d2 0 0 4 1 0 3 1 0 1a 聆u s i n ga st e m p
25、l a t e st oa m p l i f i e dr e s p e c t i v e l y,t h er e s u l to f1 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o wt h a tv i r Co f2 0 0 4 1 0 3 1 0 1w a sa b s e n LV u Ci sag a n er e l a t e dt os y n t h e s i z i n gm a j o rb l n f a e ea n t i g e n,t h ev i r Cm u t a n ts h o
26、w e dal o s si nv i r u l e n c e T h ea m p l i f i e dl i a g m e n to fa n g Mo f2 0 0 4 1 0 3 1 0 1i sd i f f e r e n tf r o mv i b r i oa n g m l h m mi nq u a n t i t y,a n da n g Mi si n c l u d i n gb yv i r u l e n tp l u s m i dp J M la n dp E I B lo fv i b r i oa n g n m a r u m,e n c x)d
27、 i l l ga7 8-k D an o n r i b o s o m a lp e p f i d es y n t h e t a s ep r o t e i n M e m b e r so ft h ev i b r i og r o u pc a r f yg e n e se n c o d i n gs e v e r a li m p o r t a n tv i r u l e n o ef a c t o r s S i n c e1 6 Sr D N As e q u e n c e so fg r o u pm e m b e r sa r ev e r ys i
28、 m i l a r,i t st a x i n gt od i f f e r e n t i a t et h e m,a n dv i b r i ov i r u l e n c ef a c t o r sa r ev e r yi m p o r t a n tf o rp a t h o g e n e s i s，ao l i g o n u c l e o t i d em e m b r a n e-a r r a ys y s t e mb es p e c i f i c a l l yd e v e l o p e df o rs t r a i ni d e n
29、t i f i c a t i o na n dd e t e r m i n a t ev i r u l e n c eg a n ed e t e c t i o n T h e1 6 Sr R N Aa n dk,p 6 0o fp a r t i a ls t r a i ns e q u e n c e sa r eu s e da si d e n t i f i c a t i o nr e f e r e n c e T o t a l2 9o l i g o n u l e o t i d e sp r o b e ss p e c i f i cf o re a c hs
30、 e q u e n c ea l es y n t h e s i z e da n da p p l yt on y l o nm e m b r a n e s G e n o m i cD N Ai se x t r a c t e df r o m 丘e s hb a c t e r i u mc u l t u r e su s i n gap h e n o l-e h o r o f o r me x t r a c t i o na n da r eu s e d 嬲t e m p l a t e D i g o x i g e n i n(D I G)-l a b e l
31、e dt a r g e tg e n e sa r ea m p l i f i e db yg e n es p e c i f i cp r i m e r sa n dD I G-l a b e l e dd U T P,t h ea m p l i f i e df r a g m e n t sa r eh y b r i d i z e dt ot h em e m b r a n e a r r a y T h eq u a n t i t yo fP C Rp r o d u c t sa n dt h et i m eo fh y b r i d i z a t i o n
32、i se v a l u a t e db ys e r i a l sg r a d sa S s a y H y b r i d i z a t i o ns i g n a l sa r e a db yN B T B C I Pc o l o rd e v e l o p e d 2 5o u to f2 9s e q u e n c e sr e a d yf o rd e t e c t i o n 眦a m p l i f i e ds p e c i f i c a l l y,t w e l v ev i r u l e n c er e l a t e dg e n e s
33、o f2 5h a v ee x a c tc o l o rd e v e l o p m e n t,t e l l1 6 Sr R N Aa n dh s p 6 0p r o d u c t sh a v ee r O s sl a g t i o nw i t h1t 03p r o b e so fo t h e r1 6 Sr D N Aa n dh s p 6 0，a n dt h r e ef r a g m e n t s,v i b r i oa l g i n o l y t i c u so m p,v i b r i op a r a h a e m o l y t
34、 i C u st r h,v i b r i of i s c h e r ia m p C c a nb ed e t e c t e db y1 a g a r o s eg e le l e c 灯o p h o r e s i sb u tn o tm e m b r a n e-a r r a y,r e v e a lt h a tt h es t r a i n sa t t e n d i n ga S s a ya r en o tt h es t r a i n sh a r b o r i n gt h i sg e n e s T h em e m b r a n e
35、a r r a yc a nd e t e c t2 5 6 n gt a r g e tf r a g m e n t s，a n de q u a lt o1 2 8 p gD N Ao f b a c t e r i a T h er e s u l t so f t h i sw o r ki n d i c a t et h a tS海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术t h em e m b r a n e-a r r a yi sar e l i a b l em e m o dt od e t e c t i o nv i b r i o s，a n di tc a
36、no f f e rap o w e r f u le v i d e n c et op a t h o g e n i c i t yo f p a t h o g e n i cg e r m s K e yw o r d s：v i b r i o；v i r u l e B c eg e n e s；P C g；D I G(d i g o x y g c n i n)；h y b r i d i z a t i o n；m e m b r a n ea r r a y；a n t a g o n i s t i c；d e t e c t i o n6海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检
37、测的膜芯片技术1 海水鱼类主要弧菌毒力相关基因的研究进展弧菌病是世界范围内对海水养殖业造成严重经济损失的鱼类疾病，主要由鳗弧菌(1 i s t o n e l l aa n g u i l l a r u m)、创伤弧菌(m b ov u l n i f i c u s)、溶藻胶弧菌(v i b r i oa l g i n o l y t i c u a)和哈维氏弧菌(v i b r i oh a r v e y)等引起t 1 1。本文综述了6 种弧茵主要毒力相关基因，以期为弧菌致病机理的研究及防治提供参考和借鉴。1，1 鳗弧菌主要毒力相关基因鳗弧菌是世界范围内流行的海水养殖鱼类重要的条件致
38、病菌，1 9 9 0 年我国引进了优质的海水鱼种大菱鲆(S c o p h t h a l m u sm a x i m u s)，但近年来病害问题较为严重，其中由鳗弧菌引起的病理损害和死亡严重，给养殖业造成较大损失。国内外学者对其进行了许多研究，现普遍认为鳗弧菌的致病性与其产生的毒素密切相关。随着分子生物学技术的发展，已有许多学者从分子水平上对鳗弧菌进行了研究，为阐明鳗弧菌的致病机理提供了一些理论依据。1 1 1 外毒素(e x o t o x i n)溶血素(h e m o l y s m)：目前国内外研究资料表明鳗弧菌有6 条溶血素基因序列：v a h l，y a h 2，y a h 3
39、，y a h 4，y a h 5 和M 3 株的溶血素基因。H i r o n o 克隆了一个5 k b的溶血索片断，其中一个是y a h l 的开放阅读框2,2 5 3 b p，对应7 5 1 个氨基酸残基【2】。邹玉霞等用P C R 扩增出鳗弧菌M 3 株的溶血素基因，根据基因推测的氨基酸编码序列与已发表的A 型血清的鳗弧菌P T 8 4 0 5 7 株有8 6 的相似性，并证明所克隆的溶血素基因对鳗弧菌M 3 的毒力没有直接的作用【3】。在随机基因组测序中，鳗弧菌所有的溶血素基因与弧菌属的其它物种如O l 型霍乱弧菌E 1 T o r、副溶血弧菌和创伤弧菌的溶血素基因相似程度都很高【4】
40、。R o d k h u m(2 0 0 5)对y a h 2，y a h 3，y a h 4，y a h 5 等4 个溶血素基因进行了克隆和测序，4 个基因都有很多开放阅读框，分别编码含有2 9 1、6 9 0、2 0 0 和5 8 5 个氨基酸残基的多肽，预测分子量分别为3 3、7 5、2 2 和6 6k D，y a h 2 的产物与假定的创伤弧菌Y J 0 1 6 的溶血素有8 9 的相似性，y a h 3 的产物与0 1 型霍乱弧菌的溶血素相关蛋白有6 8 的相似性，y a h 4 的产物与霍乱弧菌0 1 群的热稳定溶血素有7 2 相似性。纯化的溶血素蛋白对鱼类、绵羊和兔的红细胞有溶血
41、活性。构建鳗弧菌的4 株溶血素突变株进行彩虹鲑稚鱼的攻毒试验，这四个突变株的毒力都比9海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术野生株要+某基因名”的格式保存，序列从第二行开始记录。4 1 6 探针和引物的设计将所有的加工后的保守序列同时或间断的导入A l l d e I D3 0 软件或者A r r a yD e s i g n e r4 0 软件，并使用该软件设定片断长度为2 0 0-5 0 0 b p，探针长度为4 5-5 5 b p(选择该长度时软件会默认为4 7-5 3 b p)，导出引物数量设定为5 0 个，导出探针数量设定为3 0 个，其余参数一般采用软件默认值，然后同时导出
42、所有的引物和探针。针对每一个基因优先考虑探针的优劣性和保守性，选取探针的参数(包括二级结构、G c 含量、T m 值和A G 值等)合理的，r a f i g 值较高的，然后导出两套至E x c c l 文件，保存。在o m i g a 软件中的a l i g n m e n t 结果中(如图4-5)圈4-5O M I G A 软件序列比对结果F 远4-5r e s u l t o f s e q t m)e m s u s i n g s o f t w a r e O M I(3 A按“曲1+F”键在图表中寻找探针序列，并验证探针的位置确实在保守区后，在A I M e I D3 0 软件或
43、者A r r a y D e s i g n e r 4 0 软件中对所有选择好的探针进行B L A S T，结果应确定该探针不会与其它物种的基因有超过4 个连续碱基的互补。海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术将经过探针比对完毕的序列在A l l e l e I D3 0 软件或者A r m yD e s i g n e r4 0 软件中设计特异性引物，引物要求不能与探针有重合的碱基，即探针与该序列的结合位于引物结合区之间，将每个探针配套的引物择优选择后导入E x c e l 文件中保存。其中较优的一套作为首选合成序列，另一套在试验过程中作为补充备选。在设计引物时有的序列不能设计出适
44、合的引物，因为设计的引物有的扩增产物太大，有的扩增片断不含有探针互补序列，有的引物会与探针结合区重叠，等等，这时需要将导入的片断切割成较小的片断，确保探针的互补区在该片断内，然后再导入软件设计引物。所有的引物也要导出两套至E x c e l 文件中保存。为了确保引物和探针不可能发生序列重叠，在初步设计好两套引物和探针以后需要再次确认。将所有的引物扩增片断切下(引物结合区一定要完全切下)，将处理后的小片断再次导入A U e l e I D3 0 软件或者A r r a yD e s i g n e r4 0 软件中同时设计探针，这样精确定位导出的探针应该全部是初步设计的那一套。对于1 6 Sr
45、R N A 序列，需要将探针的位置选在可变区，然后再与其它种的1 6 Sr R N A 进行比对，选择能区别于其它种的探针，导出两套，分别导出保存为E x c e l文件。因为弧菌的1 6 Sr R N A 序列相似性很大，序列片断也较长，为了避免空间位阻和交叉反应，除了副溶血弧菌和溶藻胶弧菌无法区分，其余的再针对每个探针选择能扩增部分片断的配套引物，将最优的一套引物和探针各自编好名称后交由生物工程有限公司上海合成部合成(见表4 1)。表4 1 弧菌的毒力相关基因T a b l e4-1I n f o r m a t i o no f v i b r i ov i r u l e n c ef
46、 a c t o r sO r g a n i s m N a m eA c c e s s i o nn u m b e rP C Rp r o d u c ts t z e(n t)l e n g t ho f p r o b e sA 9 6 3 6 3 1A F 2 3 0 9 3 3L 0 8 0 1 2$8 3 5 3 4U 1 7 0 5 4L 4 7 1 2 2L 0 2 5 2 8N C0 0 5 2 5 0X 7 4 7 2 0A F 2 3 0 9 5 2钉钉驺舄舄蛐钉s!钉钉捞|s|榔坳诽掰觎姗缁l晏姒箸：嚣翟耀水盘类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术4 2 材料与
47、方法4 2，1 菌株试验所用菌株来自于中国科学院微生物研究所和中国水产科学研究院黄海水产研究所，如表4 2 所示。表4 _ 2 菌株来源T a b l e4-2s o I eo f b a L,t o i a菌株来源鲤弧菌费氏弧菌哈维氏弧菌1哈维氏弧菌2灿烂弧葡副溶血弧菌溶藻胶弧菌试验未知菌中国水产科学研究院黄海水产研究所病研室分离鉴定中国水产科学研究院黄海水产研究所病研室分离鉴定中厨科学院微生物研究所菌种保藏中心中国水产科学研究院黄海水产研究所病研室分离鉴定中国水产科学研究院黄海水产研究所病研室分离鉴定中国科学院微生物研究所菌种保藏中心中国科学院微生物研究所菌种保藏中心均由中国水产科学研究院
48、黄海水产研究所病研室分离海水鱼类主要弧菌鉴定和毒力基因检测的膜芯片技术4 2 2 膜芯片的制备没有加任何修饰的寡核萤酸探针用T E 缓冲液(1 0m MT r i s-H C l，p H S 0，1m ME D T A)分别稀释至1 0 0 p m o l L、5 0 p m o l L、2 5 岬o I L 和1 2 5 1 x m o l L，加入lr a g h a的二甲苯菁作为点样指示剂。把尼龙膜(带正电的，B 0 e h f i n g e r M 锄n h e i mG M B H，德国)剪成适当大小，用2 x S S C(3 0 m m o l L N a C l，0 3m m
49、o l L N a c i t r a t e P H 7 o】)室温下浸泡2 m i n，空气晾干后固定在玻片上。然后将倍比稀释的寡核苷酸探针加入3 8 4 孔板中，沸水煮2 m i n，然后立即在冰水中冷却l m i n，用手动波片点样仪&PS c i e n t i f i c,I n c S A ND I E G O 美国)点样。2 9 个探针和地高辛标记的片断(阳性对照)共三十个寡核苷酸，每个三个重复，点成1 8 x 5 的微阵列，空气晾干后进行紫外交联(紫外交联仪，U l t r a-v i o l e t P r o d u c t sL t d 英国)。制备好的芯片用塑料膜包装
50、后室温保存在避光处。4 2 3 细菌总D N A 的提取用酚氯仿提取法从新鲜菌液中提取基因组D N A。取l m l 处于对数生长期的菌液，1 0 0 0 0 r p m 离，心1 0 m i n，去上清；菌体重悬在5 6 7 p a 的T E 缓冲液中(1 0m MT r i s-H C l，1 0m ME D T A p H8】)，加入3 0 m1 0(w v)十二烷基硫酸钠(S D S)和6 m 蛋白酶K(1 0 r a g r o D 在3 7 0 c 温育1h：加入l o o v a5MN a C I 和8 0 山C T A B-N a C I 溶液，在6 5。C 温育1 0 r a