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1、复旦大学博士后研究工作报告新型芯片分析系统的研制与应用彭友元工作完成日期2 0 0 4 幽L 旦=垫旦丘生旦报告提交日期一型皿生亘旦一复旦大学2 0 0 6 年6 胃内容摘要本论文包括两部分：第一部分为多通道电化学芯片免疫传感器应用于肝纤化标志物的检测；第二部分为分子印迹模拟酶修饰的多通道微流控芯片应用于食品中残留有机磷农药的检测。第一部分的研究内容：利用微电子机械加工(M E M S)技术，设计制作了八通道金圆盘阵列电极芯片，并采用循环伏安法(C V)共聚邻苯二胺部分绝缘膜(O P D)的方法将三种肝纤维化标志物(透明质酸，H A；层粘连蛋白抗原，L N；I V 型胶原，一C)所对应的抗体(
2、H A B P、a L N、d I V C)分别包埋在同一块芯片的不同电极上。当电极上包埋的抗体与含有抗原的溶液孵化后，由于抗原抗体之间的结合使得电极表面的电化学活性位点进一步减少，从而使得电极表面的绝缘程度增大，引起电化学探针甲醇二茂铁的穿透能力变差。通过该探针的C V图蜂电流的降低，以达到对三种抗原进行定量分析的目的。该方法对三种肝纤维化标志物的线性范围分别为：L N，1 0 一1 0 7n g m l；H A，1 8 9n g m l；I V-C，1 0 7 2n g m l；L N 与I V C 的检测限均为2 n g m l，I V-C为O 5n g m l。已对5 0 0 例样品进
3、行了测定，与标准值(或R I A 值)比较，相对标准偏差(R S D)不超过2 0，阴阳性结果符合率达9 5 以上。本方法操作简便，无需对抗原进行标记，单次测定可在几十秒内完成，所耗试剂量少(几十I lL)，可以对样品进行高通量检测，方法适应于临床快速分析。第二部分的研究内容：基于分子印迹原理，采用C o C l 2 和4(5)一乙烯基咪唑(4(5)-V i n y l i m i d a z o l e)、甲基丙烯酸(a c r y l i ca c i d)为单体，二乙烯基苯为交联剂，以有机磷农药p a r a o x o n 的类似物为模板分子，在多通道微流控芯片内部原位合成含有C 0
4、2+一咪唑一羧酸基活性中心的印迹模拟酶，由于p a r a o x o n 在模拟酶的催化作用下可以水解生成对硝基苯酚，可以采用电化学法进行检测。从而对食品中的残留有机磷农药进行高效、快速、灵敏的检测，还可对有机磷酸酯农药进行降解，具有较高的理论研究意义与应用价值。关键词：阵列电极芯片：免疫传感器：肝纤化标志物；分子印迹；模拟磷酸三酯水解酶：微流控芯片nA b s t r a c tT h e r ea r et w op a r t si nt h ep r e s e n td i s s e r t a t i o n P a r tI，d e t e c t i o no fb i o
5、 m a r k e r sf o rl i v e rf i b r o s i su s i n gh i g h t h r o u g h p u te l e c t r o c h e m i c a lm i c r o i m m u n o s e n s o ra r r a y P a r tI I，m i e r o f l u i d i cb i o m e t i cc h i p-b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss y s t e mf o rt h ed e t e c t i o
6、no ft r a c ep e s t i c i d e si nf o o d s T h em a j o rc o n t e n t sa r ed e s c r i b e da sf o l l o w s：P a r tI：Ah i g h t h r o u g h p u te l e c t r o c h e m i c a lm i c r o-i m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fb i o m a r k e r sf o rl i v e rf i b r o s i sw a sd e v
7、 e l o p e d T h ea n t i b o d i e s，h y a l u r o n i ea c i db i n d i n gp r o t e i n(H A B P)，l a m i na n t i b o d y(a L N)a n dI V Ca n t i b o d y(a I V C)，a r ei m m o b i l i z e do nd i f f e r e n te l e c t r o d e so ft h em i c r o e l e c t r o d ea r r a yb yc o p o l y m e r i z
8、i n gi n t ot h ep a r t l yi n s u l a t e dp o l y(o-p h e n y l e n e d i a m i n e)b ym e a n so fc y c l i cv o l t a m m e t r y(C V)E l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no ft h ec o r r e s p o n d i n ga n t i g e nw a sb a s e do nt h ee x t e n to fe l e c t r o d ei n s u l a t i
9、o nt o w a r dar e d o xp r o b e(f e r r o c e n e m e t h a n 0 1)s o l u b i l i z e di nt h ee l e c t r o l y t ea sar e s u l to ft h ef o r m a t i o no ft h ea n t i g e n a n t i b o d yc o m p l e xa tt h ee l e c t r o d es u r f a c e T h em i c r o-i m m u n o s e n s o re x h i b i t s
10、e n o u g hs e n s i t i v i t yt od e t e c tt h et h r e eb i o m a r k e r sa tac o n c e n t r a t i o nl e v e ld o w nt o2n g m L T h em i c r o-i m m u n o s e n s o rh a sb e e na p p l i e dt o5 0 0s y n t h e t i ca n dc l i n i c a ls a m p l e s，t h er e s u l t sa g r e ew e l lw i t ht
11、 h o s eo b t a i n e db yr a d i o i m m u n o a s s a y(R I A)W i t ht h ep o s s i b i l i t yo fb e i n gp o r t a b l ea n dc o n s i d e r i n gi t se a s eo fu s e，r o b u s t n e s s，a n ds i m p l i c i t y，t h em i c r o-i m m u n o s e n s o rh a sg r e a tp o t e n t i a la sat o o lf o
12、rt h es c r e e n i n ga n de a r l yd e t e c t i o no fl i v e rf i b r o s i s P a r tI I：M o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e rw i t hp h o s p h o t f i e s t e r a s e-l i k ea c t i v i t yw a ss y n t h e s i z e di ns i t ui n s i d et h ec h a n n e lo fP M M Ac h i p，b a s e
13、do nt h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fm i m i ce n z y m e，P n i t r o p h e n o l，t h ep r o d u c to ft h ep h o s p h o t r i e s t e rh y d r o l y s i s，c o u l db ed e t e c t e db ye l e c t r o c h e m i s t r y mT h i sw o r ki se x p e c t e dt op r o v i d eas i m p l ea n dc h e a
14、pm e a n sf o r t h ed e t e c t i o no ft r a c ep e s t i c i d e ss u c ha sp a r a o x o n K e y w o r d s：M i c r o e l e c t r o d ea r r a y；I m m u n o s c n s o r；B i o m a r k e r sf o rl i v。rf i b r o s i s：M o l e c u l a ri m p r i n t；M i m i c so fp h o s p h o t“e s t e r a s e；M i
15、c r o f l u i d i cc h i p I V第一章多通道电化学芯片免疫传感器应用于肝纤化标志物的检测第一节免疫传感器概论免疫传感器是将特异性的免疫反应与高灵敏度的传感技术结合，用以检测抗原抗体反应的生物传感器【I】。免疫传感器具有选择性商、分析速度快、操作简便的特点。免疫传感器结合了生物、化学、医学、电子等多门学科技术，广泛应用于生物医学、环境检测、食品医药等领域 2 4 羽。随着生物技术和电子技术的迅速发展，免疫传感器技术已经发展成为一个独立的新兴领域。目前，免疫传感器的研究日新月异，趋于向微型化、集成化和智能化的方向发展，已经成为分析化学的研究熟点。1 免疫传感器的原理f
16、1 5 I自然界中各种生命个体必须适应外界环境，尤其是具有抵御其他生物侵害的能力，动物在抵御病原、微生物侵害的自主调节过程中形成免疫系统。免疫系统包括淋巴组织、免疫活性细胞和免疫活性介质。当称为抗原的外源性物质侵入高等动物体后，在对抗原刺激的免疫应答中，B 琳巴细胞产生类糖蛋白，称为抗体。抗体能与相应抗原特异性结合，产生各种免疫效应，起到对外源性物质破坏和分解的作用。抗体分子的基本结构可以用免疫球蛋白G(I g G)亚类结构为代表加以说明。I g G 抗体是由四条多肽链组成的大分子，包括两个完全相同的轻链和两个相同的重链，轻链由2 1 2 个氨基酸构成，重链由4 5 0 个氨基酸构成，两者能形
17、成一个柔韧易弯曲的Y 型结构。每一条链都有可变区v，位于N 端，是抗原抗体的结合位点；恒定区C 在重链中决定抗体的同种型和功能特性。轻链和重链通过非共价键相互作用和二硫键结合。轻链和重链的V 区配对产生两个同样的抗原结合位点，位于Y 字型两臂的顶端，使得抗体分子能交联抗原。抗原抗体间的反应具有高度的特异性，两者的结合只局限于一些大分子的特定部位，即抗原簇与抗体结合位点之间，以亲和力作用方式结合在一起，而不是共价键形成。这些特定部位之间的吸引力只有在极短的距离内有效，因而抗原4 簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能够产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专性。图
18、1 抗体的基本结构免疫传感器能够实时检测抗原抗体反应，有利于分析反应的动力学。同时由于抗原-抗体间的反应高度的特异性，提高了检测的准确性。免疫传感器包括标记型和无标记型，标记型是在分析体系中引入探针系统以实现检测，常用的标记技术包括放射免疫法(R A)、酶标记免疫分析法(E I A)、化学发光免疫分析法(C L I A)和荧光免疫分析法(F I A)等f 1 6 1。近年来，以电容型免疫分析f 1 7-2 2 1和分子印迹技术1 2 3 代表的无标记免疫传感器发展迅速，无标记免疫传感器灵敏度高，操作简便，已经成为研究热点。2 免疫传感器的制备方法免疫传感器根据其结构，可以分为两个部分：分子识别
19、层和信号转换器。分2子识别层是由具有分子识别能力的生物活性物质构成，例抗原、抗体等，信号转换器主要是电化学或光学检测元件，例如电流、电位测量电极、压电晶体等。当待检物与分子识别物特异结合后，产生的复合物(或光、热等)通过信号转换器转交为可输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测的目的。免疫传感器制备过程中一个非常关键的步骤是识别分子在传感器表面的固定。识别分子的有效固定可以提高传感器的稳定性和灵敏性。目前，常用的制备方法有：自组装单层膜技术，溶胶凝胶技术，导电聚合物包埋技术、分子印迹技术以及直接吸附技术。2 1 自组装单层膜技术自组装单层膜(s e l f-a s s e m b l e d
20、m o n o l a y e r,S A M)是分子自发地化学吸附在固液或气固界面形成热力学稳定和能量最低的有序体系，它具有高密堆积、均匀一致和低缺陷等特性，并且通过预先设计和精确的化学控制，可获得特定的功能。自组装单层膜具有广泛的仿生和生物亲和特性，在化学和生物传感器方面有着广泛的应用前景。其中，有机硫醇分子在金上的自组装膜最具代表性同时广泛应用。2 1 1 金电极上的自组装单层膜有机硫醇类化合物在金表面有很强的亲和力。将清洗干净的金基底直接插入硫醇或二硫化物修饰荆溶液中，浸泡一段时间后，在金电极表面可形成硫醇分子单层膜。将抗体等生物识别分子通过功能试剂(戊二醛、碳二亚胺等)以化学键合作用
21、固定在自组装膜电极表面，可得到具有高度选择性的免疫传感器 2 5-2 9 I。b图2 典型的自组装单层膜范例2 1 2 碳电极上有序膜碳电极是电化学研究和应用最广泛的电极体系，近年来在碳电极上上有序组装膜的研究已经引起注意。碳电极上的有序单层膜的制备首先要将碳基底功能化。其过程都是通过溶液中活性自由基的生成，该自由基与碳原子共价键合，从而形成稳定的单层膜。常用的方法有胺基的氧化【3”，重氮盐还原【3 2。3”，乙醇溶液中的氧化【3 4 1。有文献报道在碳电极表面键合生物素，可直接与溶液中的亲和素作用，提供一种基于生物素亲和素反应制备生物传感器的简便方法【j”。碳电极上有序膜修饰过程简单、迅速，
22、同时无须昂贵试剂。但是同金电极上的自组装单层膜相比，由于碳电极在化学结构上的差异，无法得到高度有序致密的膜。同时修饰过程涉及活性自由基的生成，也为膜的控制带来压；难。2 2 溶胶凝胶(S o l-g e l)技术溶胶凝胶法固定生物识别分子已经成为化学修饰电极的一大研究热点。溶胶凝胶法是将金属醇盐等原料配制成均质溶液，在饱和条件下经水解缩聚等化学反应，生成物聚集成溶胶，在经过蒸发干燥转变为凝胶，在低温下制备纳米粉末或多空玻璃的技术。溶胶凝胶由于其载体为无机多孔网状材料，适用范围广泛，不仅适合固化小分子也适合固定生物大分子。包埋于溶胶凝胶中的生物识别分子可以保持起结构、活性和功能，另外溶胶凝胶孔大
23、小具有可调性，这进一步提高了生物化学反应的选择性【3 5】。溶胶凝胶技术在光化学传感器、酶电化学传感器和免疫传感器中得到广泛应用。目前常用的溶胶凝胶体系为S i 0 2，A 1 2 0 3。本课题组江得臣成功了研制一种超薄Y A 1 2 0 3 溶胶凝胶体，其厚度只有2 0 4 0 n m。将其应用于电容型免疫传感器，包埋肝纤维化标志物，得到较高的灵敏度1 2 6 1。图3 在溶胶一凝胶形成过程中对蛋白质的捕获42 3 分子印迹技术分子印迹技术是一种人工合成具有分子识别功能的一种新技术，其核心是一分子印迹聚合物(M o l e c u l a r l yI m p r i n t e dP o
24、 l y m e r,M I P)的制备。一般的制备过程为：印迹分子与功能单体相互作用，在交链剂作用下形成聚合物，然后在一定条件在除去印迹分子，聚合物中就形成与印迹分子空间结构互补的具有多重作用的孔穴。这些孔穴与印迹分子的形状、电荷及大小具有互补性，因此具有选择性识别印迹分子的功能。根据功能单体与印迹分子的作用机理，分子印迹技术可分为共价分子印迹技术(利用共价键)、非共价分子印迹技术(离子作用、氢键、疏水作用等)和半共价分子印迹技术(共价键与非共价键共用)2 3】。目前分子印迹技术在手性药物分离、酶模拟催化和仿生化学传感器上获得了长足的发展。其中以蛋白质为印迹分子的高特异性凝胶在此领域有着诱人
25、的前景。以酶或抗体作为特异识别元件，分子印迹聚合物对分析物产生的结合可通过，转换器作出快速反应。2 4 导电聚合物包埋技术土!士!。盥l 鬯=竺：LId“图4 分子印迹示意图导电聚合物一直是化学修饰电极的研究热点，导电聚合物具有大订键共轭大环结构，可形成三维刚性骨架，而且修饰方法简便。以导电聚合物为载体或包埋材料可以方便快捷地固定生物活性分子(酶，抗原、抗体等)。导电聚合物的高导电性有利于保持蛋白的生物活性，通过氧化态与还原态之间的相互转化方便的将生物分子掺杂进聚合物膜中，聚合物的聚合与生物识别分子的固定可一步完成；同时通过改变电聚合参数，可以控制膜的结构和厚度，达到提高检测限的目的；不少聚合
26、物膜具有选择性透过某些物质的功能，可以降低干扰【3 7-3 S 。目前有聚吡咯(P P y)膜，聚噻吩(P T h)和聚苯胺(P A n)三大类。其分子结构如下图所示：足k y 似恰l：耠一吐，图5 常见导电聚合物的结构聚吡咯(P P y)是导电聚合物中研究最多和应用最广的一类【3 羽。主要原因是聚吡咯膜的电聚合可以在p H 酸性到中性的水溶液中进行，而聚苯胺通常需要在酸性条件下聚合，聚噻吩通常在有机溶剂中聚合同时需要较高的电位。聚毗咯膜修饰电极具有良好的电化学活性，可以在氧化态(导电态)与还原态(绝缘态)之间相互转换。聚吡咯膜的导电性和生物相容性为生物传感器的制备提供了一种优良的载体，酶、抗
27、原抗体、D N A 等生物识别分子均可掺入聚吡咯膜中。例如抗体是以带负电的形式掺杂在带正电荷的聚吡咯膜中，因此抗体不易从膜中脱落。目前，功能化聚毗咯膜研究已经成为热点，大量文献报道将各种功能团修饰在吡咯环上，通过电聚合制成各种功能化聚吡咯膜，同时将吡咯与其他单体共聚，生成共聚物膜，可以改善聚吡咯膜的稳定性和可逆性 3 7-3 8 1。在生物传感器的制备技术中，电聚绝缘膜和部分绝缘膜是一种快速良好的方法。这种方法一步完成、聚合参数容易控制、可以防止电流干扰和电极污染，形成的膜均一稳定1 3 9 4 8 1。邻苯二胺(O P D)作为苯胺的衍生物，一直是研究的热点。与导电聚合物相比，聚邻苯二胺膜有
28、两个特性使其在电化学和生物电化学中得到广泛的应用【3 9】：(1)聚邻苯二胺膜在还原态为导电性，氧化态为绝缘性，这点与聚吡咯，聚苯胺等刚好相反；(2)聚邻苯二胺膜具有良好的选择透过性。当被修饰在电极表面时，聚邻苯二胺膜可以允许小的氧化还原分子(过氧化氢)扩散到电极表面，而其他较大尺寸的分子则被阻止在膜与溶液的界面，因而可以防止生物传感器响应的干扰。过去聚邻苯二胺膜被广泛使用在酶电极的制作。最近，对邻苯二胺在中性环境中氧化形成超薄的绝缘膜研究进一步深入，这种绝缘膜厚度只有1 0 0 r i m 左右，6因而聚邻苯二胺膜再次得到青睐，用于制备分子印迹仿生膜和双电层电容器p s-z g 。N H 2
29、N H 2p h e n a z i r l e-l J k e s t r u c t u r o1,4-s u b b e r z z e n o|d-q t A n o t d 8 n u d m图6 聚邻苯二胺膜的结构过去大量的文献报道了酸性条件下邻苯二胺导电膜的结构，提出了p h e n a z i n e 和1 4 s u b-b e n z e n o l d-q u i n o i d 的两种结构，但对于其在中性环境下形成的绝缘膜结构和聚合机理却鲜有报道(4 9 躬1。最近L o s i t o 小组利用X P S 对邻苯二胺在不同的p H 环境下分子结构进行研究，发现在p H
30、7 0 的条件，聚邻苯二胺膜中-N H 2 的含量最高。同时他们采用电喷雾离子肼质谱手段，对不同的p H 环境下电聚过程提出新的机理f 4 9，5 0】近年来，纳米结构的导电聚合物研究也日趋活跃。J u nL i u 等人报道了利用三阶段恒电流法制备的聚苯胺纳米环，这种方法无需模版，纳米环直径在5 0 7 0 h m 之间，将F e H C F 掺杂到聚苯胺纳米环里，可用于过氧化氢的检测f 5”。J i a x i n gH u a n g 等报道了采用界面共聚技术制备无需模版的聚苯胺纳米线，其平均直径在5 0 r i m。这种苯胺纳米线对氯化氢气体的响应要远大于普通的聚苯胺膜怕邵。纳米结构的
31、导电聚合物研究将为其在传感器中的应用开辟新的领域。Z 5 直接吸附技术用含有生物识别分子的溶液涂覆或浸泡与电极表面，通过物理或化学吸附作用使电极表面生成具有识别功能的生物膜。这种方法简单、快速，但是生物识别分子容易脱落，稳定性差，会产生非特异性吸附。3 免疫分析方法根据检测目标分子是否需要标记，免疫分析方法主要分为标记法和无标记7法：3 1 标记法：在检测过程中，通过标记目标抗原分子监控抗原抗体结合反应。3 1 1 放射免疫分析法 5 3 1：在测定过程中，对目标抗原分子标记放射性物质，如1 2 5 I，1 3 1 I，3 H 和3 5 S。当抗原结合到免疫传感器表面后，用第二抗体或聚乙二醇沉
32、淀分离抗原抗体结合物，通过测定其反射活性用于定量抗原。为提高灵敏度，可采用竞争法对抗原或抗体进行定量。但该方法在测定过程中使用不稳定的放射性物质，需要特殊设备，安全性差：同时废物处理较为麻烦。因此临床上已逐渐为酶联免疫分析法所取代。3 1 2 酶联免疫分析法f 5 3】：一类为均相法，如酶放大免疫分析法(E n z y m em u l t i p l i e di m m u n o a s s a yt e c h n i q u e，E M I T)。其检测原理是将小分子抗原连接在酶分子的活性位点附近，抗原和抗体结合将封闭酶催化位点，使之失去活性。如果被测溶液中没有相应抗体，则酶催化底物
33、形成产物，通过检测溶液中底物的量监控抗原抗体反应。同一标记物也可以以竞争方式测定抗原含量。该方法优点在于无需分离结合和游离的抗原或抗体即可测定被测分子的含量；另类为固相法，即将抗原或抗体吸附在固相表面，抗原抗体反应后，分离固相和液相除去游离的抗原或抗体，丽结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物产生有色产物加以检测，即酶联免疫吸附试验(E n z y m e-l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y,E L I S A)。该方法稳定性高，目前在医学上被广泛使用。但其缺点在于灵敏度差，测定过程长达数小时，操作复杂。3 1 3 电流免疫分析
34、法I s 4 1：以辣根过氧化物酶(H R P)和碱性磷酸酶(A L P)标记抗体，在酶底物存在的情况下，溶液中的酶可催化底物产生催化电流。当溶液中存在相，对应抗原时，其特异性结合将增大电极的绝缘性，催化电流降低，降低的程度与底物上的抗原浓度相关。该方法较酶联免疫分析法灵敏度高，但检测时间仍然较长。近期提出一种超灵敏电化学酶联免疫分析方法，称为毛细管电化学酶联免疫分析方法f 5 5】。对于毛细管而言，其中心与表面的距离较短，免疫反应在其中进行，可大大的缩短反应孵化时间：同时该体系对催化产物的稀释效应小，缩短酶催化的放大时间。综合结果可使分析时间从原来的7 h 的测定减小到3 0 m i n，对
35、8人血清I g G 测定的检测限达5 6 1 0 珈M，测定的线性范围跨4 个数量级。该方法适合于快速临床检测，尤其在生物样品(如脑、眼、刺突和新生婴等)量少的情况下有重要应用。3 1 4 光免疫分析法 5 6 1：通过对测定的目标免疫分子标记荧光物质，测定结合物的荧光量进行分折的免疫分析方法。该方法可实现大规模目标物质识别测定，已应用于商用生物芯片的研制。为提高检测灵敏度，目前人们开始将电化学化学发光技术用于荧光免疫分析体系【5 7 1。其原理是：通过电化学反应得到的产物与溶液体系中存在的发光物质发生反应，提供足够的能量使发光物质的电子由基态跃迁到磁发态；该电子在返回基态时发光，可马上参与下
36、一个电化学发光，通过每毫秒几十万次的循环可大大的提高检测灵敏度。一般采用的体系为碱性鲁米洛双氧水体系以及三吡啶钌三苯胺体系。把电化学发光技术和免疫反应相结合而形成的电化学化学发光免疫分析(E C L n)具有很高的灵敏度和特异选择性，快速方便，可广泛地应用于生化研究测试，目前已经商品化。标记免疫分子的免疫分析方法优点在于特异选择性高，但由于测定过程需标记目标分子，操作较为复杂。3 2 无标记法：无需标记目标抗原分子，直接监控抗原抗体结合反应的免疫分析方法。3 2 1 电压免疫分析法【5 8】：早期无标记免疫分析方法。当抗原抗体结合时，由于生物分子本身所带电荷不同，将使体系电压发生变化。通过监控
37、电极电压变化了解抗原抗体反应进行程度。该方法的灵敏度为|lg 级，已不能满足目前检测要求。3 2 2 表面等离子共振免疫分析f 5 9 1：其原理是基于物理光学现象一表面等离子共振(S u r f a c eP l a s m o nR e s o n a n c e)。当入射光以临界角照射到两个不同折射率的透明介质界面将产生全反射，其入射角的强度在每个角度都应该相同。但当两界面之间镀上一层薄金属层，入射角的一部分能量将和金属表面的自由电子作用产生共振，从而导致反射光强度在一特定的角度大大减弱。反射光消失的角度随金属层表面液体相的折射率的变化而改变。通过在等离子共振装置表面上修饰一层抗9体分子
38、，当抗原抗体识别反应后，等离子共振装置的折射率会发生位移，该位移的大小和位置与固定在金属表面的生物分子的质量有关。该方法灵敏度高，可实现多目标分子的在线检测。但所需仪器昂贵，将限制其实际应用。3 2 3 压电免疫分析【删：利用抗体与抗原的特异识别功能与压电晶体的高灵敏质量响应之间的关系而产生的免疫分析方法。通常的实验方法是将抗体固定于晶体表面，浸入溶液后免疫反应发生将使晶体表面质量负载增加，频率降低，其值与样品溶液中的抗原含量有关。该方法的测定原理简单，稳定性高；但灵敏度不高，同时检测原理大多基于压电晶体的质量效应，故存在定的局限性。由于表面声波有比体声波更高的振荡基频，因此可在免疫分析上提供
39、更高的检测灵敏度，目前成为该领域研究的热点。基于表面声波制备的免疫传感器检测下限有望改善多个数量级。达绝级【6 1 1。3 2 4 电流免疫分析法：电流检测是测定在恒定电压下通过电极表面的电流，待测物通过氧化还原反应在电极上产生的电流与电极表面的待测物浓度成正比。电流检测式免疫传感器一般都需要标记，标记物均是酶类，包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。参考文献1 W o r w o o d M，A n n C l i n B i o c h e m，2 0 0 2，3 9，2 2 1 2 C l e r i c o,A,D e l R S，G i a n n e s s i D，C l i n C
40、 h e m 2 0 0 0，4 6，1 5 2 9 3。L i u，C H，L i a o K T,H u a n g H J，A n a lC h e m，2 0 0 0，7 2，2 9 2 5 4 Z o n g D f e n g Y,s i n C H u a n g H LA n a lC h e m,2 0 0 3，7 5，5 4 2 9 5 F a r e T L，C a b e l l i M D，D a I l a s S M，H e r z o g D P，B i o s e n s B i o e l e c t r o n 1 9 9 8，1 3，4 5 9 6 R
41、u b t s o v a M YK o v b a G V,E g o r o v A M，B i o s e n s B i o e l e c t r o n 1 9 9 8，1 3，7 5 7 L u n d s t r o m I，B i o s e n s B i o e l e c t r o n 1 9 9 4，9，7 2 5 8 P a r k 上K i m W K J r n N B i o s e n sB i o e l e c t r o n 2 0 0 0，1 5，1 6 79 F u n g Y S，W o n g Y：YA n a lC h e m 2 0 0
42、1，7 3，5 3 0 2 1 0 O m o w u n m i A S，J e a n e t t e M V E，B i o s e n s B i o e l e c t r o n,1 9 9 6，1 l，1 1 5 胨启民，王金忠，耿运琪，分子生物学，南开大学出版社，2 0 0 3，3 7 1 1 6 汪尔康2 1 世纪的分析化学科学出版社1 9 9 9，2 7 4 1 7 K r a u s e C，M i r s k y V M，H e c k m a r m K D，L a n g m u i r 2 0 0 3，1 26 0 51 01 8 M i r s k y V M，
43、R i e p l M，W o l l b e i s 0 S，B i o s e n s B f D P 如曲H 1 9 9 7，1 2，9 7 71 9 G r a n e k V，R i s h p o n J，J E n v i r o n S c L T e c h n 0 1 2 0 0 2，3 6，1 5 7 4 2 0 V a r l a n A S u l s J，S a n s e n W；V e e l a e r t D，L o o f A D，S e n s A c t u a t o r s,且1 9 9 7，4 4，3 3 4 2 1 s Q H u,Z YW u
44、,Y M Z h o u,z。X C a o，G L S h e n,R Q Y u,A n a lC h i m A c t a 2 0 0 2，4 5 8，2 9 72 2 D e i n h a m m e r R S，H o M，A n d e r e g g J W P o r t e r M D，L a n g m u i r1 9 9 4，1 0 1 3 0 62 3 ZL C h e n g，E K W a n g，X R Y a n g，B i o s e n s B z o e l e c t r o n 2 0 0 1，1 6，1 7 92 4 C h r i s t i
45、 n eB，P e rS，J a nB，G i l l i sJ，E l e c t r o a n a l y s 趣1 9 9 9，l l，1 5 6。2 5 B e r g g r e n C，J o h a n s s o n G A n a lC h e m 1 9 9 7，6 9，3 6 5 1 2 6 D C J i a n g，J T a n g，B H L i u,E Y Y a n g，X，R S h e r i,J L k o n g，B i o s e n s B i o e l e c t r o n2 0 0 3，1 8，1 1 8 32 7 B l a k e D
46、。A，J o n e。R，M，B l a k e 1 L C，P a v l o v A R D a r w i s hI A，H B i o s e n s B i o e l e c t r o n2 0 0 1，1 6，7 9 9 2 8 B e r g g r e n C，B j a l T l a s o n B，J o h a n s s o n qE l e c t r o a n a l y s i s2 0 0 1，1 3，1 7 3 2 9 B e r g g r e n C，B j a H l a s o n B，J o h a n s s o n GB i o s e
47、n s B i o e l e c t r o n 1 9 9 8，1 3，1 0 6 1 3 0 B a r b i e r,B；P i n s o n，J；D e s a r m o t，G；S a n c h e z，M E l e c t r o c h e m S o c 1 9 9 0，1 3 7，1 7 5 7 3 1 H a y e s，M A；K u h e W GA n a lC h e m，1 9 9 9，7 1，1 7 2 0 3 2 D o w n a r d，A J；R o d d i e k A D；B o n d,A M A n a lC h i m A c t
48、 a 1 9 9 5，31 73 0 3 3 3 D e q u a i r e，M；D e g r a n dC；L i m o g e s，B I A m C h e m，S o c 1 9 9 9，1 2 1，6 9 4 63 4 G u o，B；A n z a i，J；O s a,T C h e m P h a r m B u l l 1 9 9 6，4 4，8 0 0 3 5 李清文，王义明，罗国安，化学通报，2 0 0 0，5，1 4 3 6-D C J i a n g，J T a n g，B H L i u，E Y Y a n g，J L k o n g，A n a l C h
49、e m 2 0 0 3，7 5，4 5 7 83 7 F a r e T L，C a b e l l i M D，D a l l a s S M，H e r z o g D P，B i o s e n s B i o e l e c t r o n，1 9 9 8，1 3，4 5 9 3 8 R a r n a n a v i c i e n e A，R a m a n a v i c i u s A，C r i t i c a lR e v i e w si nA n a l C h e m 2 0 0 2，3 2，2 4 5 3 9 M a z e i k i e n e，1 L；M a
50、l i n a u s k a s，A S y n t h e t i cM e t a l2 0 0 2，1 2 8，1 2 1 4 0。M y l e r,S。；E a t o n,S；H i g s o n,S P J A n a lC h i mA c t a 1 9 9 5，3 5 7，5 5 4 1 C o s m i n o M；I l a r i o L；P i e r G Z，A n a l C h e m 1 9 9 9,7 1，1 3 6 6 4 2 M a l i t e s t a,C；P a l m i s a n o，F；T o r s i，L；Z a m b o