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1、第三章荧光法本讲稿第一页，共四十二页荧光分析法教学要求荧光分析法教学要求n掌握分子荧光、磷光的产生机理；掌握掌握分子荧光、磷光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。激发光谱和发射光谱特征。n掌握荧光与分子结构的关系以及溶液对掌握荧光与分子结构的关系以及溶液对荧光强度影响的因素。荧光强度影响的因素。n了解荧光分析法的特点及定量测定方法。了解荧光分析法的特点及定量测定方法。n了解荧光分析仪器的结构。了解荧光分析仪器的结构。本讲稿第二页，共四十二页概述概述 自然界存在这样一类物质，当这些物质的分子吸自然界存在这样一类物质，当这些物质的分子吸收能量后，能发射出荧光，人们根据所发生荧光的特收能量后，能
2、发射出荧光，人们根据所发生荧光的特性和强度，对物质进行定性或定量分析的方法，称为性和强度，对物质进行定性或定量分析的方法，称为荧光分析法（荧光分析法（fluorescence analysis）。）。本讲稿第三页，共四十二页荧光分析的特点荧光分析的特点：n 灵灵敏敏度度高高：视视不不同同物物质质，检检测测下下限限在在0.10.001 g/mL之之间间。可可 见比见比UV-Vis的灵敏度高得多！的灵敏度高得多！n 选择性好选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。n 结结构构信信息息量量多多：包包括括物物质质激激发发光光谱谱、发发射射光光谱谱、光光强强、荧
3、荧光光量子效率、荧光寿命等。量子效率、荧光寿命等。n 应应用用不不广广泛泛：主主要要是是因因为为能能发发荧荧光光的的物物质质不不具具普普遍遍性性、增增强强荧荧光光的的方方法法有有限限、外外界界环环境境对对荧荧光光量量子子效效率率影影响响大大、干干扰扰测测量量的因素较多的因素较多本讲稿第四页，共四十二页基态单重态基态单重态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态 （S）抗磁性）抗磁性激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态 （T）顺磁性）顺磁性区
4、别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。电子跃迁类型电子跃迁类型允许跃迁允许跃迁禁阻跃迁禁阻跃迁本讲稿第五页，共四十二页分子的去激发分子的去激发无辐射跃迁无辐射跃迁辐射跃迁辐射跃迁荧光（荧光（F）磷光（磷光（P）振动弛豫振动弛豫内转移内转移外转移外转移体系间跨越体系间跨越分子的去激发分子的去激发本讲稿第六页，共四十二页分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析一、基本原理一、基本原理荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第
5、一激发态单重当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。如果跃态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态单重态与三重态的区别与三重态的区别在于电子自旋方向在于电子自旋方向不同，激发三重态不同，激发三重态具有较低能级。具有较低能级。本讲稿第七页，共四十二页第一节第一节 分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析 在单重激发态中，两个电子平行自旋，在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为寿
6、命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为性，其激发态的平均寿命为10-4 1s以上以上（通常用（通常用S和和T分别表示单重态和三重态）。分别表示单重态和三重态）。本讲稿第八页，共四十二页分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析 处于激发态的电子，通常以处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式辐射跃迁方式或或无辐无辐射跃迁方式射跃迁方式再回到基态。再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（式辐射其多余的能量，包括振动
7、弛豫（VR）、内部转移）、内部转移（IR）、体系间跨跃（）、体系间跨跃（IX）及外部转移（）及外部转移（EC）等，各种跃）等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构荧光物质本身的结构及及激发时的物理和化学环境等因素激发时的物理和化学环境等因素有关。有关。本讲稿第九页，共四十二页分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析 下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递方式在其中所起的作用。各种能量传递方式在其中所起的作用。设处于基态单重态中的电子吸收波长为设处于基态单重态中的电子吸收波长为1和和2的的辐射光之后，分
8、别激发至第二单重态辐射光之后，分别激发至第二单重态S2及第一单重及第一单重态态S1。振动弛豫振动弛豫 它是指它是指 在同一电子能级在同一电子能级中，中，电子由高振动能级转电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为发生振动弛豫的时间为10-12s数量级数量级。本讲稿第十页，共四十二页分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析内转移内转移 当当两个电子能级两个电子能级非常靠近以至其振动能级有非常靠近以至其振动能级有重重叠叠时，常发生电子由高能级以时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式无辐射跃迁方式转转移至低能级。移至低能级
9、。本讲稿第十一页，共四十二页分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析荧光发射（荧光发射（F）处于第一激发单重态中的电子跃回至基态各处于第一激发单重态中的电子跃回至基态各振动能级时，将得到最大波长为振动能级时，将得到最大波长为3的荧光。注意：的荧光。注意：基态中也有振动驰豫跃迁基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，。很明显，3的波长的波长较激发波长较激发波长1或或2都长，而且不论电子开始被激都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长发至什么高能级，最终将只发射出波长3为的荧为的荧光。荧光的产生在光。荧光的产生在10-7-10-9s内完成。内完成。本讲稿第十二页，共四十二页分子荧光和磷光分
10、析分子荧光和磷光分析体系间跨跃体系间跨跃 指指不同多重态间不同多重态间的的无辐射跃迁无辐射跃迁，例如，例如S1T1就是一种体系间跨跃。通常，发生体系间跨跃就是一种体系间跨跃。通常，发生体系间跨跃时，电子由时，电子由S1的较低振动能级转移至的较低振动能级转移至T1的较高的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生生T1S1，然后由，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧发生荧光。这是产生延迟荧光的机理光的机理。本讲稿第十三页，共四十二页分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析磷光发射磷光发射 电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几电子由基态单重态激发至第一激发三
11、重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以体系间跨跃方式转重态的最低振动能级，有可能以体系间跨跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（这个跃迁过程（T1S0）也是自旋禁阻的，其发光速）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为率较慢，约为10-4-10s。因此，这种跃迁所发射的光，。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。在光照停止后，仍可持
12、续一段时间。本讲稿第十四页，共四十二页分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析外转移外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为这一现象称为“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。荧光与磷光的根本区别荧光与磷光的根本区别：荧光荧光是由激发是由激发单重态单重态最低振动能层至基态各振动最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而能层间跃迁产生的；而磷光磷光是由是由激发三重态激发三重态的最低振的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。动能层至基态各振动能层间跃迁产生
13、的。本讲稿第十五页，共四十二页T1 v0 v3 v1 v4 v2 v0 v3 v1 v4 v2 v0 v3 v1 v4 v2 v0 v3 v1 v4 v2 S1 S2 S0 (b)(b)磷光磷光荧光荧光吸收吸收振动弛豫振动弛豫体系间跨越体系间跨越荧光与磷光产生示意图荧光与磷光产生示意图本讲稿第十六页，共四十二页荧光的检测荧光的检测单色器单色器光源光源检测器检测器狭缝狭缝单色器单色器吸吸收收池池狭缝狭缝I0It荧光的检测荧光的检测本讲稿第十七页，共四十二页激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱 任任何何荧荧（磷磷）光光都都具具有有两两种种特特征征光光谱谱：激激发发光光谱谱与发射光谱。它们是荧（磷）
14、光定性分析的基础。与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。1）激发光谱）激发光谱 改改变变激激发发波波长长，测测量量在在最最强强荧荧（磷磷）光光发发射射波波长长处处的的强强度度变变化化，以以激激发发波波长长对对荧荧光光强强度度作作图图可可得得到激发光谱。到激发光谱。本讲稿第十八页，共四十二页激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱 激激发发光光谱谱形形状状与与吸吸收收光光谱谱形形状状完完全全相相似似，经经校校正正后后二二者者完完全全相相同同！这这是是因因为为分分子子吸吸收收光光能能的的过过程程就是分子的激发过程。就是分子的激发过程。激激发发光光谱谱可可用用于于鉴鉴别别荧荧光光物物质质；在在定定
15、量量时时，用用于选择最适宜的激发波长于选择最适宜的激发波长。本讲稿第十九页，共四十二页激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱2）发射光谱）发射光谱 发发射射光光谱谱即即荧荧光光光光谱谱。一一定定波波长长和和强强度度的的激激发发波波长长辐辐照照荧荧光光物物质质，产产生生不不同同波波长长的的强强度度的的荧荧光光，以以荧荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。由由于于不不同同物物质质具具不不同同的的特特征征发发射射峰峰，因因而而使使用用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。本讲稿第二十页，共四十二页激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的
16、关系i）波长比较）波长比较 与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长。与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长。ii）形状比较）形状比较 荧荧光光光光谱谱形形状状与与激激发发波波长长无无关关。换换句句话话说说，不不管管激激发发波波长长如如何何，电电子子都都是是从从第第一一电电子子激激发发态态的的最最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。本讲稿第二十一页，共四十二页激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系iii）镜像对称）镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系本讲稿第二十二页，共四十二页分子结构与荧光的关系
17、分子结构与荧光的关系 产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件：i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；ii）吸吸收收特特征征频频率率的的光光后后，应应可可产产生生具具一一定定量量子子效率的荧光。效率的荧光。即量子效率即量子效率 F足够大：足够大：本讲稿第二十三页，共四十二页分子结构与荧光分子结构与荧光1）跃迁类型：）跃迁类型：通通常常，具具有有 *及及n*跃跃迁迁结结构构的的分分子子才才会会产产生生荧荧光光。而而且且具具 *跃跃迁迁的的荧荧光光效效率率比比 n*跃跃迁迁的的要要大得多。大得多。2）共轭效应：）共轭效应：共轭度越大，荧
18、光越强。共轭度越大，荧光越强。本讲稿第二十四页，共四十二页共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系共轭结构与荧光的关系本讲稿第二十五页，共四十二页分子结构与荧光分子结构与荧光3）刚性结构和共平面性）刚性结构和共平面性：分分子子刚刚性性（Rigidity）越越强强，分分子子振振动动少少，与与其其它它分分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。如如荧荧光光素素（大大）与与酚酚酞酞（=0）；芴芴(=1）与与联苯（联苯（=0.18）本讲稿第二十六页，共四十二页刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系8 羟基喹啉羟基喹啉8
19、羟基喹啉镁羟基喹啉镁刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系本讲稿第二十七页，共四十二页刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系7-二甲胺萘二甲胺萘 1-磺酸盐磺酸盐 F=0.758-二甲胺萘二甲胺萘 1-磺酸盐磺酸盐 F=0.03空间位阻与荧光的关系空间位阻与荧光的关系本讲稿第二十八页，共四十二页刚性结构和共平面性与荧光的关系刚性结构和共平面性与荧光的关系顺反异构与荧光的关系顺反异构与荧光的关系反式结构反式结构顺式结构顺式结构1，2二苯乙烯二苯乙烯本讲稿第二十九页，共四十二页分子结构与荧光分子结构与荧光4）取代基：）取代基：给给电电子子取取代代基基增增
20、强强荧荧光光（p-共共轭轭），如如 -OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；等；吸吸电电子子基基降降低低荧荧光光，如如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X等；等；重原子降低荧光但增强磷光，重原子降低荧光但增强磷光，如如苯苯环环被被卤卤素素取取代代，从从氟氟苯苯到到碘碘苯苯，荧荧光光逐逐渐渐减减弱到消失，该现象也称重原子效应。弱到消失，该现象也称重原子效应。本讲稿第三十页，共四十二页影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（一）溶剂效应：（一）溶剂效应：溶溶剂剂极极性性可可增增加加或或降降低低荧荧光光强强度度（改改变变 *及及n*跃迁的能量）；跃迁的能量）；与与溶溶剂剂作作用用从从而而
21、改改变变荧荧光光物物质质结结构构来来增增加加或或降降低荧光强度。低荧光强度。本讲稿第三十一页，共四十二页影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（二）温度：（二）温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或粘度或“刚性刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。分析灵敏度。本讲稿第三十二页，共四十二页影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（三）（三）pH值：值：具具酸酸或或碱碱性性基基团团的的有有机机物物质质，在在不不同同pH值值时时，其其结结构构可可能能发发生生变变化化，因因而而荧荧光光强强度度将将发
22、发生生改改变变；对对无无机机荧荧光光物物质质，因因pH值值会会影影响响其其稳稳定定性性，因因而而也也可使其荧光强度发生改变。可使其荧光强度发生改变。本讲稿第三十三页，共四十二页pH 13pH712苯胺苯胺本讲稿第三十四页，共四十二页影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（四）内滤光和自吸：（四）内滤光和自吸：体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质体系内存在可以吸收荧光的物质，或荧光物质的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光的荧光短波长与激发光长波长有重叠，均可使荧光强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，强度下降，称为内滤光；当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。可
23、吸收自身的荧光发射称为荧光自吸。本讲稿第三十五页，共四十二页影响荧光的外界因素影响荧光的外界因素（五）荧光猝灭：（五）荧光猝灭：碰撞猝灭；碰撞猝灭；静态猝灭；静态猝灭；转入三重态的猝灭；转入三重态的猝灭；电子转移猝灭；电子转移猝灭；自猝灭。自猝灭。本讲稿第三十六页，共四十二页溶液的荧光溶液的荧光荧光定量分析荧光定量分析荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 F=F I0 CL F 荧光效率荧光效率 荧光物质的摩尔吸光系数荧光物质的摩尔吸光系数 I0 激发光强度激发光强度 L 液层厚度液层厚度 F=KC（该式只有当（该式只有当 CL 0.05时才时才成成立）立）本讲稿第三十七页，共四十
24、二页荧光定量分析方法荧光定量分析方法n工作曲线法工作曲线法 用用F C作图作图n比例法比例法 FsF0 KCs FxF0 KCx本讲稿第三十八页，共四十二页仪器与技术仪器与技术n荧光计的主要部件荧光计的主要部件1）光源：氙灯、高压汞灯、激光；）光源：氙灯、高压汞灯、激光；2）样品池：石英（低荧光材料）；）样品池：石英（低荧光材料）；3）两个单色器：）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器；选择激发光单色器；分离荧光单色器；4）检测器：光电倍增管。）检测器：光电倍增管。本讲稿第三十九页，共四十二页荧光计的类型荧光计的类型n光电荧光计光电荧光计n荧光分光光度计荧光分光光度计本讲稿第四十页，共四十二页单色器单色器单色器单色器光源光源。检测器检测器液液 槽槽放大和指示仪表放大和指示仪表荧光分光光度计的结构示意图荧光分光光度计的结构示意图I0I本讲稿第四十一页，共四十二页分析条件的选择分析条件的选择n选择线性范围选择线性范围n选择激发光波长和荧光波长选择激发光波长和荧光波长n散射光干扰的排出散射光干扰的排出 散射光包括散射光包括瑞利散射光瑞利散射光（Rayleigh scattering light）和）和拉曼散射光拉曼散射光（Raman scattering light）本讲稿第四十二页，共四十二页