免疫学试验技术讲稿.ppt

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1、关于免疫学试验技术第一页，讲稿共二十二页哦 概概 论论 第二页，讲稿共二十二页哦免疫学技术免疫学技术 利用免疫学反应的特异性原利用免疫学反应的特异性原理建立的各种检测与分析技术以及建立理建立的各种检测与分析技术以及建立这些技术的各种制备方法。这些技术的各种制备方法。包括包括 ：l免疫血清学技术免疫血清学技术 用于抗原或抗体检测用于抗原或抗体检测的体外免疫反应技术；的体外免疫反应技术；l细胞免疫技术细胞免疫技术 用于研究机体细胞免用于研究机体细胞免疫功能与状态的技术；疫功能与状态的技术；l免疫制备技术免疫制备技术 指制备与免疫检测有关指制备与免疫检测有关制剂的各种技术。制剂的各种技术。第三页，讲

2、稿共二十二页哦 一、细胞免疫一、细胞免疫技术技术 淋巴细胞计淋巴细胞计数与分类数与分类淋巴细胞功淋巴细胞功能测定能测定细胞因子测定细胞因子测定 E玫瑰花环试验玫瑰花环试验T细胞亚群检测试验细胞亚群检测试验淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验细胞毒性细胞毒性T细胞试验细胞试验巨噬细胞移动抑制试验巨噬细胞移动抑制试验白介素测定白介素测定干扰素测定干扰素测定 用用 途途免疫机理免疫机理 诊断诊断 治疗治疗 药物选择药物选择类类 型型 +-+-+-+-+-+-+-+体内细胞免疫试验体内细胞免疫试验皮肤试验皮肤试验+-+试验名称试验名称第四页，讲稿共二十二页哦 （一）淋巴细胞计数与分类（一）淋巴细胞计数与分

3、类（一）淋巴细胞计数与分类（一）淋巴细胞计数与分类 1.1.1.1.淋巴细胞数量检测技术淋巴细胞数量检测技术淋巴细胞数量检测技术淋巴细胞数量检测技术1.1 T1.1 T细胞细胞E E玫瑰花环试验玫瑰花环试验 检测检测T T细胞细胞 T T淋巴细胞表面淋巴细胞表面CD2CD2分子是绵羊红细胞（分子是绵羊红细胞（SRBCSRBC）受体，也称）受体，也称E E受体，在一定条件下，受体，在一定条件下，SRBCSRBC环环绕绕T T细胞与之结合，形成花环状，称细胞与之结合，形成花环状，称E E花环（花环（E-rosetteE-rosette），形成此种花环的细胞称），形成此种花环的细胞称E E花环形成花

4、环形成细胞。细胞。1.2 EA1.2 EA玫瑰花环试验玫瑰花环试验 检测检测B B细胞细胞 B B淋巴细胞有表面淋巴细胞有表面FcFc受体，以鸡红细胞作为指示细胞与相应的抗红细胞抗体形成受体，以鸡红细胞作为指示细胞与相应的抗红细胞抗体形成EAEA，B B淋巴细胞可以通过淋巴细胞可以通过FcFc受体与受体与EAEA形成花环，以此计算形成花环，以此计算B B淋巴细胞的数目。淋巴细胞的数目。1.3 EAC1.3 EAC玫瑰花环试验玫瑰花环试验 检测检测B B细胞细胞 B B淋巴细胞表面具有补体淋巴细胞表面具有补体C3C3受体，红细胞可与相应的抗体结合形成抗原抗体复合受体，红细胞可与相应的抗体结合形成

5、抗原抗体复合物（物（EAEA），进而与补体结合），进而与补体结合(EAC)(EAC)，然后与，然后与B B淋巴细胞表面的补体淋巴细胞表面的补体C3C3受体结合而形受体结合而形成花环，以供计数成花环，以供计数B B淋巴细胞。淋巴细胞。第五页，讲稿共二十二页哦第六页，讲稿共二十二页哦第七页，讲稿共二十二页哦1.4 1.4 酯酶染色法酯酶染色法 ANAE ANAE+检测检测T T细胞细胞 T T淋巴细胞的胞浆内存在着酸性淋巴细胞的胞浆内存在着酸性a a 醋酸萘酯酶醋酸萘酯酶(ANAE(ANAE+)，在酸性条件下，能使底物醋酸萘酯水解，在酸性条件下，能使底物醋酸萘酯水解产生产生a a 萘酚，萘酚，而而

6、a a 萘酚与六偶氮副品红作用萘酚与六偶氮副品红作用形成不溶性的红色沉淀物而沉积在形成不溶性的红色沉淀物而沉积在T T淋巴细胞胞浆淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位。内酯酶所在的部位。第八页，讲稿共二十二页哦l2.T2.T细胞亚群检测技术细胞亚群检测技术 T T细胞总数：细胞总数：CDCD3 3；T TH H:CD:CD4 4；T Tc c:CD:CD8 8 应用针对应用针对CDCD抗原的单抗来鉴别各抗原的单抗来鉴别各T T细胞亚群。细胞亚群。2.1 2.1 间接免疫荧光法间接免疫荧光法 分离淋巴细胞分离淋巴细胞 CD CD单抗单抗 荧光二抗荧光二抗 镜检计数镜检计数 2.2 2.2 流式细胞术流式

7、细胞术 分离淋巴细胞分离淋巴细胞 CD CD单抗单抗 荧光二抗荧光二抗 FACS FACS测试管测试管 计数计数 第九页，讲稿共二十二页哦（二）淋巴细胞功能测定（二）淋巴细胞功能测定 淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 淋巴细胞在体外培养时，受到非淋巴细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如特异性有丝分裂原（如PHAPHA、ConAConA）或特异性抗原刺激）或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可

8、以反映机体胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体免疫功能的的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体免疫功能的指标之一。指标之一。淋巴胞转化试验的方法有淋巴胞转化试验的方法有形态学方法、形态学方法、MTTMTT法、法、3H-3H-胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR3H-TdR）掺入法）掺入法。第十页，讲稿共二十二页哦A A、形态学方法、形态学方法l1 1、原理、原理 淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原如植淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原如植物血凝素（物血凝素（PHAPHA）等刺激后，可转化为体积较大的母细）等刺激后，可转化为体积较大的母细胞，胞

9、浆增多而深染，核增大并可见核仁部分细胞可胞，胞浆增多而深染，核增大并可见核仁部分细胞可出现有丝分裂，计数转化细胞的百分率可反映机体的出现有丝分裂，计数转化细胞的百分率可反映机体的细胞免疫功能。细胞免疫功能。第十一页，讲稿共二十二页哦l2、方法、方法 （1 1）取无菌肝素抗凝血）取无菌肝素抗凝血0.1ml0.1ml，加入，加入1.8ml1.8ml细胞培养液中，同时加入细胞培养液中，同时加入PHAPHA（1000g/ml1000g/ml）0.1ml0.1ml，对照管不加，对照管不加PHAPHA，将细胞置，将细胞置3737、5%CO25%CO2培养培养3 3天，天，每天摇动每天摇动1 1次。次。（2

10、 2）培养结束时吸弃大部分上清液，加入）培养结束时吸弃大部分上清液，加入4mlNH4Cl4mlNH4Cl（8.5g/L8.5g/L）混匀，置）混匀，置3737水浴水浴10min10min。（3 3）2500r/min2500r/min离心离心10min10min后弃去上清液，沉淀加后弃去上清液，沉淀加5ml5ml固定液，室温作用固定液，室温作用10min10min。（4 4）离心（）离心（2500r/min2500r/min，10min10min）后弃上清液，留）后弃上清液，留0.2ml0.2ml沉淀细胞制片，沉淀细胞制片，迅速吹干。迅速吹干。（5 5）吉姆萨染色）吉姆萨染色1020min10

11、20min，水洗，干燥。，水洗，干燥。（6 6）油镜计数）油镜计数200200个淋巴细胞中转化的细胞数，计算转化率。个淋巴细胞中转化的细胞数，计算转化率。第十二页，讲稿共二十二页哦l3 3、结果、结果 （1 1）淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，核与胞浆的比例、胞浆染色）淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，核与胞浆的比例、胞浆染色性及核的构造与核仁的有无。性及核的构造与核仁的有无。成熟的小淋巴细胞：成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为与未经培养的小淋巴细胞一样为68m68m，核染色，核染色质致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。质致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆

12、染色为轻度嗜碱性。l过渡型淋巴细胞：过渡型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约比小淋巴细胞大，约1020m1020m，核染色质致密，但出现，核染色质致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。l淋巴母细胞：淋巴母细胞：细胞体积增大，约细胞体积增大，约2030m2030m，形态不整齐，常有小突，形态不整齐，常有小突出，核变大，核染色质疏松，有核仁出，核变大，核染色质疏松，有核仁1212个，胞浆变多，常出现胞个，胞浆变多，常出现胞浆空泡。浆空泡。l其它细胞：其它细胞：如中性粒细胞在培养如中性粒细胞在培养72h72h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。后，绝大部分衰变或死亡

13、呈碎片。第十三页，讲稿共二十二页哦l（2 2）淋巴细胞转化率的计算按上述分类检查推片头体）淋巴细胞转化率的计算按上述分类检查推片头体尾三部分，计数尾三部分，计数200200个淋巴细胞，算出百分率。个淋巴细胞，算出百分率。l转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下，的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下，PHAPHA诱导的淋巴细胞转化率为诱导的淋巴细胞转化率为60%-80%60%-80%，如为，如为50%-60%50%-60%则偏低，则偏低，50%50%以下则为降低。以下则为降低

14、。图 淋巴细胞转化示意图第十四页，讲稿共二十二页哦B B、MTTMTT法法l1 1、原理、原理 MTTMTT法即四甲基偶氮唑盐微量反应比色法。法即四甲基偶氮唑盐微量反应比色法。MTTMTT是一种噻唑盐，是一种噻唑盐，化学名化学名3-3-（4 4，5 5二甲基二甲基-2-2-噻唑）噻唑）-2-2，5-5-二苯溴化四唑，水溶液为黄二苯溴化四唑，水溶液为黄橙色。淋巴细胞受到橙色。淋巴细胞受到ConAConA作用红发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸作用红发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，脱氢酶活性相应升高，MTTMTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臢颗作为其底物参与反应，形成蓝色的甲

15、臢颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经粒沉积于细胞内或细胞周围，经SDS/SDS/盐酸盐酸-异丙醇溶解为蓝色溶液，异丙醇溶解为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的可用酶标测定仪测定细胞培养物的ODOD值，测定波长值，测定波长570nm570nm。根据。根据ODOD值值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。的大小计算反应体系中细胞增殖程度。第十五页，讲稿共二十二页哦l2 2、方法、方法l（1 1）淋巴细胞的分离与培养）淋巴细胞的分离与培养 常用来分离常用来分离淋巴细胞的分层液淋巴细胞的分层液（聚（聚 蔗糖蔗糖(Ficoll)-(Ficoll)-泛影葡胺泛影葡胺(Urografin)(Urografin

16、)(F(FH)H)分层液，比重是分层液，比重是 1.0770.001 1.0770.001）。）。Ficoll Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000400,000，当密度为当密度为1.2g1.2gmlml时仍未超出正常生理性渗透压时仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮

17、在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到淋巴细胞。周血中分离到淋巴细胞。第十六页，讲稿共二十二页哦l 取抗凝血取抗凝血1ml1ml，加入，加入3737预温的预温的PH7.4 0.01M PBSPH7.4 0.01M PBS溶液溶液1ml1ml，混，混匀后加在匀后加在1ml1ml淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液上，2500rlmin2500rlmin离心离心1010分钟，用毛细分钟，用毛细滴管尖伸入单核细胞层，经轻吸出全部细胞悬液。用滴管尖伸入单核细胞层，经轻吸出全部细胞悬液。用3737预温的预温的PH7.4 0.01M P

18、BSPH7.4 0.01M PBS溶液洗溶液洗2 2次，第一次次，第一次2500r/min152500r/min15分钟。第二次分钟。第二次1010分钟。弃上清，将沉积细胞用分钟。弃上清，将沉积细胞用pH7.4pH7.4含含10%10%小牛血清的小牛血清的RPMI-1640RPMI-1640营营养液液配成养液液配成1 12102106 6个个/ml/ml的单细胞悬液，的单细胞悬液，100l/100l/孔，接种于孔，接种于9696孔平板，并加入适量的孔平板，并加入适量的ConAConA液。置液。置3737、5%CO2 5%CO2 培养箱中培养培养箱中培养4848小时。小时。第十七页，讲稿共二十二

19、页哦第十八页，讲稿共二十二页哦l（2 2）加入）加入5mg/ml5mg/ml的的MTTMTT溶液溶液(10l/(10l/孔孔)，于振荡器上混匀后约，于振荡器上混匀后约1min1min，置，置3737、5%CO2 5%CO2 培养箱中培养培养箱中培养4-64-6小时。小时。l（3 3）取出培养板，每孔加入）取出培养板，每孔加入10%SDS-0.01mol/LHCL100ul,10%SDS-0.01mol/LHCL100ul,置置3737、5%5%CO2 CO2 培养箱中培养培养箱中培养2 2小时后，取出，室温下将平板置于微孔板振荡器上小时后，取出，室温下将平板置于微孔板振荡器上振荡振荡1010分

20、钟，使结晶物溶解。分钟，使结晶物溶解。l（4 4）使用酶联检测仪检测波长）使用酶联检测仪检测波长570nm570nm下的吸光度值。下的吸光度值。第十九页，讲稿共二十二页哦l【注意事项】l1.操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。l2.细胞分层液在室温下应为(l.0770.001)g/L；应避光4 下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。l3.稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。第二十页，讲稿共二十二页哦C C、3H-TdR3H-TdR掺入法：掺入法：n 正常情况下，

21、细胞通常处于细胞周期的正常情况下，细胞通常处于细胞周期的G0G0期，受特异性抗原期，受特异性抗原或丝裂原激活后，从或丝裂原激活后，从G0G0期进入期进入G1G1期，并合成蛋白质、期，并合成蛋白质、RNARNA和和DNADNA前体物前体物质等，为质等，为DNADNA复制准备物质基础，然后进入复制准备物质基础，然后进入S S期，细胞合成期，细胞合成DNADNA量倍增，量倍增，此时若在培养液中加此时若在培养液中加3H3H标记的标记的DNADNA前体（前体（3H-3H-胸腺嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷，3H-TdR3H-TdR），），后者即掺入新合成的后者即掺入新合成的DNADNA中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度 。掺。掺入同位素用液体闪烁测定仪测量，计算入同位素用液体闪烁测定仪测量，计算cpm(cpm(每分钟脉冲数每分钟脉冲数)，用以下，用以下公式进行计算刺激指数：公式进行计算刺激指数：第二十一页，讲稿共二十二页哦感谢大家观看26.09.2022第二十二页，讲稿共二十二页哦