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1、免疫学试验技术1 概概 论论 1.4 1.4 酯酶染色法酯酶染色法 ANAE ANAE+检测检测T T细胞细胞 T T淋巴细胞的胞浆内存在着酸性淋巴细胞的胞浆内存在着酸性a a 醋酸萘酯醋酸萘酯酶酶(ANAE(ANAE+)，在酸性条件下，能使底物醋酸萘酯，在酸性条件下，能使底物醋酸萘酯水解产生水解产生a a 萘酚，萘酚，而而a a 萘酚与六偶氮副品萘酚与六偶氮副品红作用形成不溶性的红色沉淀物而沉积在红作用形成不溶性的红色沉淀物而沉积在T T淋巴淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部位。细胞胞浆内酯酶所在的部位。l2.T2.T细胞亚群检测技术细胞亚群检测技术 T T细胞总数：细胞总数：CDCD3 3；T T
2、H H:CD:CD4 4；T Tc c:CD:CD8 8 应用针对应用针对CDCD抗原的单抗来鉴别各抗原的单抗来鉴别各T T细胞亚群。细胞亚群。2.1 2.1 间接免疫荧光法间接免疫荧光法 分离淋巴细胞分离淋巴细胞 CD CD单抗单抗 荧光二抗荧光二抗 镜检计数镜检计数 2.2 2.2 流式细胞术流式细胞术 分离淋巴细胞分离淋巴细胞 CD CD单抗单抗 荧光二抗荧光二抗 FACS FACS测试管测试管 计数计数 （二）淋巴细胞功能测定（二）淋巴细胞功能测定（二）淋巴细胞功能测定（二）淋巴细胞功能测定 淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 淋巴细胞在体外培养时，受到淋巴细胞在体外培养时，受到非特异性
3、有丝分裂原（如非特异性有丝分裂原（如PHAPHA、ConAConA）或特异性抗原）或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可以淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体反映机体的细胞免疫水平，因此，可作为测定机体免疫功能的指标之一。免疫功能的指标之一。淋巴胞转化试验的方法有淋巴胞转化试验的方法有形态学方法、形态学方法、MTTMTT法、法、3H-3H-胸腺嘧啶核
4、苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR3H-TdR）掺入法）掺入法。A A、形态学方法、形态学方法l1 1、原理、原理 淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原淋巴细胞在体外培养过程中受有丝分裂原如植物血凝素（如植物血凝素（PHAPHA）等刺激后，可转化为体积）等刺激后，可转化为体积较大的母细胞，胞浆增多而深染，核增大并可见较大的母细胞，胞浆增多而深染，核增大并可见核仁部分细胞可出现有丝分裂，计数转化细胞的核仁部分细胞可出现有丝分裂，计数转化细胞的百分率可反映机体的细胞免疫功能。百分率可反映机体的细胞免疫功能。l2、方法、方法 （1 1）取无菌肝素抗凝血）取无菌肝素抗凝血0.1ml0.1ml，加入，加入1
5、.8ml1.8ml细胞培养液中，同时细胞培养液中，同时加入加入PHAPHA（1000g/ml1000g/ml）0.1ml0.1ml，对照管不加，对照管不加PHAPHA，将细胞置，将细胞置3737、5%CO25%CO2培养培养3 3天，每天摇动天，每天摇动1 1次。次。（2 2）培养结束时吸弃大部分上清液，加入）培养结束时吸弃大部分上清液，加入4mlNH4Cl4mlNH4Cl（8.5g/L8.5g/L）混匀，置混匀，置3737水浴水浴10min10min。（3 3）2500r/min2500r/min离心离心10min10min后弃去上清液，沉淀加后弃去上清液，沉淀加5ml5ml固定液，固定液，
6、室温作用室温作用10min10min。（4 4）离心（）离心（2500r/min2500r/min，10min10min）后弃上清液，留）后弃上清液，留0.2ml0.2ml沉淀细沉淀细胞制片，迅速吹干。胞制片，迅速吹干。（5 5）吉姆萨染色）吉姆萨染色1020min1020min，水洗，干燥。，水洗，干燥。（6 6）油镜计数）油镜计数200200个淋巴细胞中转化的细胞数，计算转化率。个淋巴细胞中转化的细胞数，计算转化率。l3 3、结果、结果 （1 1）淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，核与胞浆的比）淋巴母细胞的形态学标准是细胞核的大小，核与胞浆的比例、胞浆染色性及核的构造与核仁的有无。例、
7、胞浆染色性及核的构造与核仁的有无。成熟的小淋巴细胞：成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为与未经培养的小淋巴细胞一样为68m68m，核染色质致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱核染色质致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。性。l过渡型淋巴细胞：过渡型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约比小淋巴细胞大，约1020m1020m，核染色质致，核染色质致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。l淋巴母细胞：淋巴母细胞：细胞体积增大，约细胞体积增大，约2030m2030m，形态不整齐，常有，形态不整齐，常有小突出，核变大，核染
8、色质疏松，有核仁小突出，核变大，核染色质疏松，有核仁1212个，胞浆变多，常个，胞浆变多，常出现胞浆空泡。出现胞浆空泡。l其它细胞：其它细胞：如中性粒细胞在培养如中性粒细胞在培养72h72h后，绝大部分衰变或死亡呈后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。碎片。l（2 2）淋巴细胞转化率的计算按上述分类检查推片头）淋巴细胞转化率的计算按上述分类检查推片头体尾三部分，计数体尾三部分，计数200200个淋巴细胞，算出百分率。个淋巴细胞，算出百分率。l转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况转化的淋巴细胞指的
9、是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下，下，PHAPHA诱导的淋巴细胞转化率为诱导的淋巴细胞转化率为60%-80%60%-80%，如为，如为50%-50%-60%60%则偏低，则偏低，50%50%以下则为降低。以下则为降低。图 淋巴细胞转化示意图B B B B、MTTMTTMTTMTT法法法法l1 1、原理、原理 MTTMTT法即四甲基偶氮唑盐微量反应比色法。法即四甲基偶氮唑盐微量反应比色法。MTTMTT是一是一种噻唑盐，化学名种噻唑盐，化学名3-3-（4 4，5 5二甲基二甲基-2-2-噻唑）噻唑）-2-2，5-5-二苯二苯溴化四唑，水溶液为黄橙色。淋巴细胞受到溴化四唑，水溶液为黄橙色。淋巴细胞受
10、到ConAConA作用红发作用红发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTTMTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臢颗粒沉积于细作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臢颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经胞内或细胞周围，经SDS/SDS/盐酸盐酸-异丙醇溶解为蓝色溶液，异丙醇溶解为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的可用酶标测定仪测定细胞培养物的ODOD值，测定波长值，测定波长570nm570nm。根据根据ODOD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。l2 2、方法、方法l（1 1）淋巴细胞的分离与培养）
11、淋巴细胞的分离与培养 常用来分离常用来分离淋巴细胞的分层液淋巴细胞的分层液（聚（聚 蔗糖蔗糖(Ficoll)-(Ficoll)-泛影泛影葡胺葡胺(Urografin)(F(Urografin)(FH)H)分层液，比重是分层液，比重是 1.0770.001 1.0770.001）。）。Ficoll Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000400,000，当密度为，当密度为1.2g1.2gmlml时仍未超出正常生理性渗透压时仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单物膜。红细胞、粒
12、细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到淋巴细胞。胞，就可从外周血中分离到淋巴细胞。l 取抗凝血取抗凝血1ml1ml，加入，加入3737预温的预温的PH7.4 0.01M PBSPH7.4 0.01M PBS溶液溶液1ml1ml，混匀后加在，混匀后加在1ml1ml淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液上，2500rlmin2500rlmin离心离心1010
13、分钟，用毛细滴管尖伸入单核细胞层，经轻吸出全部细分钟，用毛细滴管尖伸入单核细胞层，经轻吸出全部细胞悬液。用胞悬液。用3737预温的预温的PH7.4 0.01M PBSPH7.4 0.01M PBS溶液洗溶液洗2 2次，第一次，第一次次2500r/min152500r/min15分钟。第二次分钟。第二次1010分钟。弃上清，将沉积细胞分钟。弃上清，将沉积细胞用用pH7.4pH7.4含含10%10%小牛血清的小牛血清的RPMI-1640RPMI-1640营养液液配成营养液液配成1 12102106 6个个/ml/ml的单细胞悬液，的单细胞悬液，100l/100l/孔，接种于孔，接种于9696孔平板
14、，孔平板，并加入适量的并加入适量的ConAConA液。置液。置3737、5%CO2 5%CO2 培养箱中培养培养箱中培养4848小小时。时。l（2 2）加入）加入5mg/ml5mg/ml的的MTTMTT溶液溶液(10l/(10l/孔孔)，于振荡器上混匀后约，于振荡器上混匀后约1min1min，置，置3737、5%CO2 5%CO2 培养箱中培养培养箱中培养4-64-6小时。小时。l（3 3）取出培养板，每孔加入）取出培养板，每孔加入10%SDS-0.01mol/LHCL100ul,10%SDS-0.01mol/LHCL100ul,置置3737、5%CO2 5%CO2 培养箱中培养培养箱中培养2
15、 2小时后，取出，室温下将平板置小时后，取出，室温下将平板置于微孔板振荡器上振荡于微孔板振荡器上振荡1010分钟，使结晶物溶解。分钟，使结晶物溶解。l（4 4）使用酶联检测仪检测波长）使用酶联检测仪检测波长570nm570nm下的吸光度值。下的吸光度值。l【注意事项】l1.操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。l2.细胞分层液在室温下应为(l.0770.001)g/L；应避光4 下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。l3.稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。C C
16、、3H-TdR3H-TdR掺入法：掺入法：n 正常情况下，细胞通常处于细胞周期的正常情况下，细胞通常处于细胞周期的G0G0期，受特期，受特异性抗原或丝裂原激活后，从异性抗原或丝裂原激活后，从G0G0期进入期进入G1G1期，并合成蛋白质、期，并合成蛋白质、RNARNA和和DNADNA前体物质等，为前体物质等，为DNADNA复制准备物质基础，然后进入复制准备物质基础，然后进入S S期，细胞合成期，细胞合成DNADNA量倍增，此时若在培养液中加量倍增，此时若在培养液中加3H3H标记的标记的DNADNA前体（前体（3H-3H-胸腺嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷，3H-TdR3H-TdR），后者即掺入新合成的）
17、，后者即掺入新合成的DNADNA中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度 。掺入同位素用。掺入同位素用液体闪烁测定仪测量，计算液体闪烁测定仪测量，计算cpmcpm(每分钟脉冲数每分钟脉冲数)，用以下公，用以下公式进行计算刺激指数：式进行计算刺激指数：（三）细胞毒性（三）细胞毒性T T细胞细胞CTL)CTL)试验试验 将靶细胞（肿瘤细胞、病毒感染细胞将靶细胞（肿瘤细胞、病毒感染细胞)等，与致敏的等，与致敏的淋巴细胞混合培养，然后检测靶细胞的死亡情况。淋巴细胞混合培养，然后检测靶细胞的死亡情况。形态学检查法：形态学检查法：根据体外贴壁生长的靶细胞被根据体外贴壁生长的靶细胞被CTLCTL杀伤后失去贴壁的能力，因此从贴壁细胞数目的减少杀伤后失去贴壁的能力，因此从贴壁细胞数目的减少情况即可判断情况即可判断CTLCTL的功能。的功能。5151CrCr释放法两种方法：释放法两种方法：将将5151CrCr标记的靶细胞与致敏标记的靶细胞与致敏淋巴细胞一同培养，靶细胞被淋巴细胞一同培养，靶细胞被CTLCTL杀伤后，杀伤后，5151CrCr即释放即释放到培养液中，用到培养液中，用r-r-计数仪测定培养液中计数仪测定培养液中5151CrCr的脉冲数的脉冲数（cpm)cpm)即反应出即反应出CTLCTL杀靶细胞的能力。杀靶细胞的能力。