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1、培养基成分与配制现在学习的是第1页，共41页l 实质上，对于整株植物生长有重要作用的这实质上，对于整株植物生长有重要作用的这1515种种元素，对于组织培养来说也是必需的。各种常用培养基之元素，对于组织培养来说也是必需的。各种常用培养基之间在组分上的主要差别，即在于各种盐或离子数量上的不间在组分上的主要差别，即在于各种盐或离子数量上的不同。由质上来看，各种植物组织所需要的无机营养是相当同。由质上来看，各种植物组织所需要的无机营养是相当一致的。一致的。l 当无机盐在水中溶解的时候，它们发生解离，形成当无机盐在水中溶解的时候，它们发生解离，形成离子。培养基中的活性因子即是这些离子，而不是它们离子。培
2、养基中的活性因子即是这些离子，而不是它们的化合物。一种类型的离子可由一种以上的盐提供。的化合物。一种类型的离子可由一种以上的盐提供。l 现在学习的是第2页，共41页l WhiteWhite培养基是最早的植物组织培养基之一，其中包含了所有必培养基是最早的植物组织培养基之一，其中包含了所有必需的营养成分，被广泛用于根的培养。不过，很多研究者的经验表明，需的营养成分，被广泛用于根的培养。不过，很多研究者的经验表明，要想使愈伤组织能令人满意地生长，这个培养基中的无机成分在数量要想使愈伤组织能令人满意地生长，这个培养基中的无机成分在数量上是不足的。早期采用的克服这种缺陷的办法是在培养基中加入某些上是不足
3、的。早期采用的克服这种缺陷的办法是在培养基中加入某些复杂的混合物，如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。为复杂的混合物，如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。为了改进合成培养基，后来的研究者通过增加各种无机盐的浓度，特别了改进合成培养基，后来的研究者通过增加各种无机盐的浓度，特别是钾和氮的浓度，成功地取代了那些复杂的混合物。和是钾和氮的浓度，成功地取代了那些复杂的混合物。和WhiteWhite培养基培养基比较，在现在广泛应用的各种培养基中，多数都含有浓度较高比较，在现在广泛应用的各种培养基中，多数都含有浓度较高的无机盐。的无机盐。HellerHeller（19531953）在其培养
4、基中加入了铝和镍，但这两种）在其培养基中加入了铝和镍，但这两种元素的必要性并未得到证明，因此已被后来的研究者所省略。钠、氯元素的必要性并未得到证明，因此已被后来的研究者所省略。钠、氯化物和碘化物的必要性迄今也还没有得到证明。化物和碘化物的必要性迄今也还没有得到证明。现在学习的是第3页，共41页l 在在WhiteWhite（19431943）原来的培养基中，铁是以）原来的培养基中，铁是以FeFe(SO(SO)的形式的形式加入的，但加入的，但StreetStreet及其合作者在根培养中以及其合作者在根培养中以FeCIFeCI代替了代替了FeFe(SO(SO)，这是因为在，这是因为在FeFe(SO(
5、SO)中含有中含有MnMn和某些其他金属离子杂质。然而，和某些其他金属离子杂质。然而，FeCIFeCI看来也并不是一个完全令人满意的铁盐。以这种形式存在的铁只有看来也并不是一个完全令人满意的铁盐。以这种形式存在的铁只有在在PH5.2PH5.2左右时才能被组织所利用。已知在根培养中，接种后一周之内左右时才能被组织所利用。已知在根培养中，接种后一周之内培养基的培养基的PHPH值即会由原来的值即会由原来的4.94.95.05.0上升到上升到5 58 86.06.0，于是根开始表，于是根开始表现缺铁症状。为了解决这个问题，现在在多数培养基中铁是以一种螫现缺铁症状。为了解决这个问题，现在在多数培养基中铁
6、是以一种螫合形式，即合形式，即 FeFe EDTA EDTA（EDTAEDTA乙二胺四乙酸）的形式提供的。以这乙二胺四乙酸）的形式提供的。以这种形式提供的铁直到种形式提供的铁直到PH7.6PH7.68.08.0仍然可以被植物组织所利用。附带说仍然可以被植物组织所利用。附带说一下，与根不同，愈伤组织培养物直到一下，与根不同，愈伤组织培养物直到PHPH为为6.06.0时仍可利用时仍可利用FeCIFeCI ，这，这是因为愈伤组织能分泌自然的鳌合剂，而螫合剂可与铁相结合。是因为愈伤组织能分泌自然的鳌合剂，而螫合剂可与铁相结合。Fe Fe EDTAEDTA可使用可使用FeSOFeSO7H7H2 2O O
7、对和对和NaNa2 2EDTAEDTA进行制备，或者，如果可能的进行制备，或者，如果可能的话，从市场上直接购买话，从市场上直接购买NaFeNaFeEDTAEDTA。l 现在学习的是第4页，共41页l 在培养基中无机氮的供应可以有两种形式，在培养基中无机氮的供应可以有两种形式，一种是硝酸盐；另一种是铵盐。当做为唯一的氮一种是硝酸盐；另一种是铵盐。当做为唯一的氮源时，硝酸盐的作用要比铵盐好得多，但在单独源时，硝酸盐的作用要比铵盐好得多，但在单独使用硝酸盐时，培养基的使用硝酸盐时，培养基的PHPH会向碱性方向漂移。会向碱性方向漂移。若与硝酸盐一起加入少量铵盐，则会阻止这种漂移。若与硝酸盐一起加入少量
8、铵盐，则会阻止这种漂移。因此，有好几种培养基都既含有硝酸盐，也含有铵因此，有好几种培养基都既含有硝酸盐，也含有铵盐。盐。l 现在学习的是第5页，共41页l 当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如下：出来的症状如下：l 氮氮某些组织（五叶地锦）表现出一种很引人注某些组织（五叶地锦）表现出一种很引人注目的花色素苷的颜色；不能形成导管；目的花色素苷的颜色；不能形成导管；l 氮、钾或磷氮、钾或磷细胞过度生长，形成层组织减退；细胞过度生长，形成层组织减退；l 硫硫非常明显地褪绿；非常明显地褪绿；l 铁铁细胞分裂停止；细胞分裂停止；l 硼硼细胞分裂
9、停滞，细胞伸长；细胞分裂停滞，细胞伸长；l 锰或钼锰或钼影响细胞伸长。影响细胞伸长。现在学习的是第6页，共41页l2.2.有机营养成分有机营养成分l(1)(1)含氮物质含氮物质l 大多数培养的细胞都能合成所有必需的维生素，只是数大多数培养的细胞都能合成所有必需的维生素，只是数量上显然不足。为了能使组织很好地生长，在培养基中常量上显然不足。为了能使组织很好地生长，在培养基中常常必须补加一种或一种以上的维生素和氨基酸。其中硫胺常必须补加一种或一种以上的维生素和氨基酸。其中硫胺素（维生素素（维生素B B）一般认为是一种必需的成分。在其他各种维）一般认为是一种必需的成分。在其他各种维生素中，已知尤其是
10、吡哆醇（维生素生素中，已知尤其是吡哆醇（维生素B6B6），烟酸（维生素），烟酸（维生素B B），泛酸钙（维生素，泛酸钙（维生素B B）和肌醇也都能改善培养的植物组织的）和肌醇也都能改善培养的植物组织的生长状况。各种维生素皆溶于水，唯叶酸例外，先要用少量生长状况。各种维生素皆溶于水，唯叶酸例外，先要用少量稀氨水溶解，然后加蒸馏水定容稀氨水溶解，然后加蒸馏水定容。l 现在学习的是第7页，共41页l 为了促进某些愈伤组织和器官的生长，还常为了促进某些愈伤组织和器官的生长，还常使用很多种化学成分不明的复杂的营养混合物，使用很多种化学成分不明的复杂的营养混合物，如如水解酪蛋白（水解酪蛋白（CHCH），椰
11、子汁（），椰子汁（CMCM），玉米胚乳，），玉米胚乳，麦芽浸出物（麦芽浸出物（MEME），番茄汁（），番茄汁（TJTJ）和酵母浸出物）和酵母浸出物（YEYE）等。不过，只要可能，应尽量避免使用这等。不过，只要可能，应尽量避免使用这些天然物质。这些物质（特别是果实提取物）在些天然物质。这些物质（特别是果实提取物）在样品间的差异将会影响实验结果的可重复性。这样品间的差异将会影响实验结果的可重复性。这是因为，这类提取物所含的生长促进成分的质和是因为，这类提取物所含的生长促进成分的质和量常因组织的年龄和供体植株的品种而变化。此量常因组织的年龄和供体植株的品种而变化。此外，只用一种氨基酸也可能有效地取代
12、这些天然外，只用一种氨基酸也可能有效地取代这些天然物质。物质。现在学习的是第8页，共41页l(2)(2)碳源碳源l Haberlandt（1902）曾试图培养绿色的叶肉细胞，这可能是出自绿色细胞对营养的要求比较简单的想法，但这种想法在实验中并未得到证实。现在我们知道，作为一个规律，起初是绿色的组织在培养中会逐渐失去它们的叶绿素，而只依赖于外界碳源生活。即使是那些在培养期间由于某些突然变化或被置于特殊条件之下而获得了色素的组织，也不是碳素自养的。如果在培养基中加入一种合适的碳源，就是在培养中已经充分分化了的绿色幼茎也会生长得更好。由此看来，在培养基中加入一种可被利用的碳源是十分必要的。l 现在学
13、习的是第9页，共41页l 最常用的碳源是蔗糖，浓度一般为最常用的碳源是蔗糖，浓度一般为2 25 5。已知葡萄糖。已知葡萄糖和果糖也能使某些组织生长得很好，和果糖也能使某些组织生长得很好，BallBall（19531953，19551955）证实，对）证实，对于红杉属植物（于红杉属植物（SequoiaSequoia）愈伤组织的生长来说，经过高压灭菌的）愈伤组织的生长来说，经过高压灭菌的蔗糖优于过滤灭菌的蔗糖，看来高压灭菌能使蔗糖水解成为更蔗糖优于过滤灭菌的蔗糖，看来高压灭菌能使蔗糖水解成为更能被有效利用的糖，如果糖。能被有效利用的糖，如果糖。l 一般来说，以蔗糖做碳源时，离体的双子叶植物的根生长
14、得最一般来说，以蔗糖做碳源时，离体的双子叶植物的根生长得最好。而以右旋糖（葡萄糖）做碳源时，单子叶植物的根生长得最好。好。而以右旋糖（葡萄糖）做碳源时，单子叶植物的根生长得最好。矮生苹果（矮生苹果（Mains pumilaMains pumila，品种，品种MclntoshMclntosh）的组织培养物在以山）的组织培养物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源时都长得很好。梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源时都长得很好。l 已知植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、已知植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖。红杉属植物和玉米胚乳的组织培养物甚至可以代谢甘露糖和
15、乳糖。红杉属植物和玉米胚乳的组织培养物甚至可以代谢作为唯一碳源的淀粉。作为唯一碳源的淀粉。现在学习的是第10页，共41页l3.3.植物生长物质植物生长物质l 除了营养物质以外，为了促进组织和器除了营养物质以外，为了促进组织和器官的生长，通常还有必要在培养基中加入一官的生长，通常还有必要在培养基中加入一种或一种以上的生长调节物质。如生长素、种或一种以上的生长调节物质。如生长素、细胞分裂素或赤霉素。细胞分裂素或赤霉素。现在学习的是第11页，共41页l(1)(1)生长素生长素l 在自然界中，生长素影响到茎和节间的伸长、在自然界中，生长素影响到茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。在组
16、织培向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。在组织培养中，生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。在养中，生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。在组织培养中常用的生长素有：组织培养中常用的生长素有：IAAIAA、IBAIBA、NAA.NAA.、NOANOA（萘氧乙酸）、（萘氧乙酸）、P PCPACPA（对氯苯氧乙酸）、（对氯苯氧乙酸）、2,4-2,4-D D（二氯苯氧乙酸）和（二氯苯氧乙酸）和2,4,52,4,5T T（三氯苯氧乙酸）。（三氯苯氧乙酸）。其中其中IBAIBA和和NAANAA广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作促进茎的增殖。促进茎的增殖。2,4-D2,
17、4-D和和2,42,4，5 5T T对于愈伤组织的诱对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。生长素一般溶于导和生长非常有效。生长素一般溶于9595酒精或酒精或0.0.lmollmolL L的的aOHaOH中，以后者的溶解效果更好。中，以后者的溶解效果更好。现在学习的是第12页，共41页l生长素活性:2,4-DNAAIAA2,4-D的活性经IAA高8-12倍,2,4-D在植物体内比较稳定,而IAA极不稳定。现在学习的是第13页，共41页l(2)(2)细胞分裂素细胞分裂素l 细胞分裂素影响细胞分裂、顶端优势的变化和细胞分裂素影响细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主茎的
18、分化等。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。由于这类化合物有助于使腋芽由顶端优势的抑制芽。由于这类化合物有助于使腋芽由顶端优势的抑制下解放出来，因此也可用于茎的增殖。比较常用的细下解放出来，因此也可用于茎的增殖。比较常用的细胞分裂素有：胞分裂素有：BAPBAP（苄氨基瞟呤），（苄氨基瞟呤），6 6BABA（苄基腺瞟（苄基腺瞟呤），呤），2 2iPiP（异戊烯氨基膘呤）和（异戊烯氨基膘呤）和(KT)(KT)激动素（呋激动素（呋喃氨基嘌呤）。细胞分裂素一般溶于喃氨基嘌呤）。细胞分裂素一般溶于0.50.5或
19、或lmollmolL L的的HCIHCI或稀的或稀的NaOHNaOH中。中。现在学习的是第14页，共41页l细胞分裂素的活性：ZTBAKT腺嘌呤.ZT的活性比KT高10倍,KT的活性比腺嘌呤3万倍.现在学习的是第15页，共41页(3)(3)赤霉素赤霉素 赤霉素有赤霉素有2020多种，其中在组织培养中所用的多种，其中在组织培养中所用的是是GAGA。与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不。与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素不常使用。据报道，赤霉素能刺激在培养中形成的常使用。据报道，赤霉素能刺激在培养中形成的不定胚正常发育成小植株。赤霉素易溶于冷水，不定胚正常发育成小植株。赤霉素易溶于冷水，每升水最多可溶
20、解每升水最多可溶解1 1mgmg。GAGA溶于水后不溶于水后不稳定，容易分解，故最好以稳定，容易分解，故最好以9595酒精配成母液酒精配成母液在冰箱中保存。在冰箱中保存。l 现在学习的是第16页，共41页l4.4.琼脂琼脂l如果使用液体培养基进行静止培养，组织将会沉没并因缺如果使用液体培养基进行静止培养，组织将会沉没并因缺氧而死亡。为了避免这种情况，可用琼脂使培养基凝胶化，然氧而死亡。为了避免这种情况，可用琼脂使培养基凝胶化，然后把组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻得来的多糖类物后把组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻得来的多糖类物质，一般的使用浓度是质，一般的使用浓度是0.70.71 1，
21、若浓度太高，培养基就会变，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质就难于扩散到培养的组织中去。由于在这种半固得很硬，营养物质就难于扩散到培养的组织中去。由于在这种半固体培养基上所建立的培养物便于保存，而且对于多种目的的实验来体培养基上所建立的培养物便于保存，而且对于多种目的的实验来说都能得到令人满意的结果，因此琼脂固化培养基得到了广泛的应说都能得到令人满意的结果，因此琼脂固化培养基得到了广泛的应用。但琼脂并非是培养基中的一种必需成分。用。但琼脂并非是培养基中的一种必需成分。l 单细胞和细胞聚合体可以在含有无机和有机营养以及激素的液体单细胞和细胞聚合体可以在含有无机和有机营养以及激素的液体培养基
22、中进行悬浮培养。不过，在悬浮培养中必须定时通气，其方法培养基中进行悬浮培养。不过，在悬浮培养中必须定时通气，其方法或是由培养基底部鼓入无菌空气，或是不断轻轻摇动。在原生质体培或是由培养基底部鼓入无菌空气，或是不断轻轻摇动。在原生质体培养中，如果采用浅层液体培养基或小滴液体培养基进行培养，则可保养中，如果采用浅层液体培养基或小滴液体培养基进行培养，则可保持静止，不必通气。持静止，不必通气。现在学习的是第17页，共41页 5.5.P H 值值在灭菌之前PH值一般都是调节到5.0-6.0之间，一般来说，当PH值高于6时，培养基会变硬，低于5时，琼脂不能很好地凝固。6.其他成分其他成分（1）活性炭：在
23、培养基中加入活性炭（AC）主主要是为了吸附植物的有害分泌物，但活性炭对物质吸附的选择性很低，它同时也吸附某些植物必需的化合物。活性炭的用量一般为0.5%-3%。注意：在高压灭菌之前加入活性会降低培养基的PH值，合使培养基不易凝固。现在学习的是第18页，共41页（2）硝酸银：离体培养的植物组织会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中和积累会影响培养物的生长和分化，AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而可起到抑制乙烯活性的作用。培养基中加AgNO3能促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生，并能使某些原来再生困难的物种分化出再生植株。AgNO3对于克服试管苗玻璃化及早衰和落叶等
24、也有明显效果。由于低浓度AgNO3能引起细胞坏死，而这种坏死、细胞会产生一定数量的乙烯，所以AgNO3不一定总能阻止乙烯的积累。AgNO3的使用浓度一般为110mg/l。使用过滤灭菌。现在学习的是第19页，共41页（3）抗生素：培养基中添加抗生素的主要目的，是防止由外植体内生菌造成的污染。注意：不同抗生素抑制不同菌种，因此要有针对性选择抗生素；有时必须几种抗生素结合使用才能取得较好的效果；抗生素的使用对植物的生长有一定的抑制作用；在停用抗生素后，污染率往往显著上升。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素等，用量一般为520mg/L。大部分要求过滤灭菌。现在学习的是第20页，共41页l二、培养基的
25、种类二、培养基的种类l 长期以来长期以来,根据组织培养的不同目的和选用的根据组织培养的不同目的和选用的不同材料不同材料,科学工作者们设计了许多不同种类的培科学工作者们设计了许多不同种类的培养培养基基，最常见的培养基为养培养基基，最常见的培养基为MSMS培养基（见表培养基（见表3-13-1）。）。lMS培养基：培养基：Murashige和和Skoog于于1962年为烟草细胞培养设计年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞它的硝酸盐含量高，其养分的
26、数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。速繁殖用它作为培养基的基本培养基。现在学习的是第21页，共41页l 表表3-1 MS3-1 MS培养基培养基 l 大量元素大量元素 (mg/L)微量元素微量元素 (mg/L)l（NH4NO3）.1650 KI.0.83l（KNO3）.1900 H3BO3.6.2l（CaCI22H2O）.440 MnSO4 4H2O 22.3l（MgSO47H2O）.370 ZnSO4 7H2O 8.6l（KH2PO4）.170 Na2Mo
27、O4 2H2O .0.25l维生素维生素 CuSO4 5H2O.0.025l肌醇肌醇.100 CoCl2 6H2O.0.025l烟酸烟酸.0.5 FeSO4 7H2O .27.8l盐酸硫铵素盐酸硫铵素.0.1 Na EDTA.37.3l盐酸吡哆素盐酸吡哆素 0.5 生长调节物质生长调节物质l有机附加物有机附加物 KIN.0.0410l甘氨酸甘氨酸.2.0 2，4-D.1-30l蔗糖蔗糖.30g/L pH 5.7现在学习的是第22页，共41页l植物组织培养能否取得成功,营养培养基的种类是一个很关键的问题。比较常用的培养基及其成分见表3-2。现在学习的是第23页，共41页l表表3-2 3-2 常用
28、的培养基及其成分常用的培养基及其成分现在学习的是第24页，共41页现在学习的是第25页，共41页表表表表3-3 3-3 不同培养基离子浓度的比较不同培养基离子浓度的比较现在学习的是第26页，共41页l三、培养基的选择三、培养基的选择l1.1.培养基选择的原则培养基选择的原则l(1)(1)目的性强：目的性强：要针对不同的培养目的如初代要针对不同的培养目的如初代培养、增殖培养、生根培养，分别选择最适合的培养、增殖培养、生根培养，分别选择最适合的培养基培养基;l(2)(2)成本低廉：成本低廉：要考虑到工厂化生产时的运营成要考虑到工厂化生产时的运营成本，以总体运营效益来评价一种培养基的优劣。本，以总体
29、运营效益来评价一种培养基的优劣。l(3)(3)方便可行：方便可行：试剂容易选购，培养基的制试剂容易选购，培养基的制备操作简单易行。备操作简单易行。现在学习的是第27页，共41页l2.2.培养基筛选的方法培养基筛选的方法l(1)(1)选择基本培养基选择基本培养基:l 在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，一般最好先由一种已被广泛采用种适合的培养基，一般最好先由一种已被广泛采用的基本培养基（如的基本培养基（如MSMS或或B B）开始。）开始。现在学习的是第28页，共41页l(2)(2)选择最佳激素组合选择最佳激素组合:l 在植物组织培养基中
30、最常改动的因子是生长调在植物组织培养基中最常改动的因子是生长调节物质，尤其是生长素和细胞分裂素。节物质，尤其是生长素和细胞分裂素。l 开始时，可以选择一种基本培养基，以及不同激开始时，可以选择一种基本培养基，以及不同激素组合，比如说，各有素组合，比如说，各有5 5种不同浓度（种不同浓度（0 0，0.50.5，2.52.5，5 5，10mol10molL L）的某种生长素（例如）的某种生长素（例如NAANAA）和某种细胞分）和某种细胞分裂素（例如裂素（例如BAPBAP）。这两种激素）。这两种激素5 5种浓度的所有可能组合，种浓度的所有可能组合，即构成了一个具有即构成了一个具有2525项处理的实验
31、（表项处理的实验（表3 34 4）。由这）。由这2525项处理中选出最好的一个，然后在保持浓度不变的项处理中选出最好的一个，然后在保持浓度不变的情况下，再试验其他种类的生长素和细胞分裂素。情况下，再试验其他种类的生长素和细胞分裂素。l 注意注意:当改变细胞分裂素的种类时，保持生长素不变，当改变细胞分裂素的种类时，保持生长素不变，反之亦然。反之亦然。现在学习的是第29页，共41页表表3-4 3-4 3-4 3-4 二种激素五种浓度的各种组合二种激素五种浓度的各种组合二种激素五种浓度的各种组合二种激素五种浓度的各种组合现在学习的是第30页，共41页l(3)(3)选择适宜的盐分浓度选择适宜的盐分浓度
32、:l高浓度盐分培养基对若干实验体系来说都已证明效果很好，但有某些培养物在低浓度盐分培养基上生长得更好，因此就还有必要试验一下在保持生长调节物质最佳组合不变的情况下，1 12 2和和1 14 4水平的基本培养基盐分的效果。现在学习的是第31页，共41页l(4)(4)确定适宜的蔗糖浓度确定适宜的蔗糖浓度:l在保持其他成分不变的情况下，设在保持其他成分不变的情况下，设计一个蔗糖浓度梯度（计一个蔗糖浓度梯度（2 26 6以至更以至更高），一筛选出最适宜的蔗糖浓度。高），一筛选出最适宜的蔗糖浓度。l 通过以上这些实验，常常就足以研通过以上这些实验，常常就足以研制出一种适合的培养基。不过，为了对制出一种适
33、合的培养基。不过，为了对这种培养基做进一步的改良还有很多其这种培养基做进一步的改良还有很多其他可能性值得探讨。他可能性值得探讨。现在学习的是第32页，共41页l(5)(5)广谱实验法广谱实验法:l为了能给一个新的实验体系选出一种适合的培养基，为了能给一个新的实验体系选出一种适合的培养基，De De Fos-sardFos-sard等（等（19741974）介绍了一种）介绍了一种“广谱实验法广谱实验法”。和上面介绍。和上面介绍的方法相比，这个方法是比较复杂的。然而，如果利用简单的的方法相比，这个方法是比较复杂的。然而，如果利用简单的方法解决不了问题，就有必要用这个方法试验一下。方法解决不了问题，
34、就有必要用这个方法试验一下。l 1)1)在这个广谱实验法中，把培养基中的所有组分分为在这个广谱实验法中，把培养基中的所有组分分为4 4大类：大类：无机盐、生长素、细胞分裂素、有机营养物质（蔗糖、氨基酸和肌醇等）无机盐、生长素、细胞分裂素、有机营养物质（蔗糖、氨基酸和肌醇等）。l 2)2)对每一类物质再选定对每一类物质再选定3 3个浓度，即低（个浓度，即低（L L），中（），中（M M）和高）和高（H H）（见表）（见表3-43-4）。）。4 4类物质各类物质各3 3种浓度的各种不同组合即构成了一种浓度的各种不同组合即构成了一项包括项包括8181个处理的实验。个处理的实验。l 3)3)在这在这8
35、181个处理中最好的一个可用个字母表示。例如，一个个处理中最好的一个可用个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐、低浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高浓包含中等浓度无机盐、低浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高浓度有机营养物质的处理即可表示为度有机营养物质的处理即可表示为MLMHMLMH。顺序是无机盐。顺序是无机盐-生长素生长素-细细胞分裂素胞分裂素-有机营养。有机营养。l 4)4)达到这个阶段以后，即可再试验不同类型的生长素和达到这个阶段以后，即可再试验不同类型的生长素和细胞分裂素，以找到它们的最好类型。细胞分裂素，以找到它们的最好类型。现在学习的是第33页，共41页表表3-5 3-5 广谱实
36、验法中，各类物质的成分和浓度广谱实验法中，各类物质的成分和浓度现在学习的是第34页，共41页l四、培养基的制备四、培养基的制备l 1.1.干粉直接配制干粉直接配制:l现在配制培养基的最简单的方法是用市售培养基现在配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉，其中含有无机盐、维生素和氨基酸。把这种干干粉，其中含有无机盐、维生素和氨基酸。把这种干粉溶解在蒸馏水里（要比培养基的最终容积少粉溶解在蒸馏水里（要比培养基的最终容积少1010），），加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，最后再加入蒸馏水加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，最后再加入蒸馏水使之达到最终的容积。调节使之达到最终的容积。调节PHPH，高压
37、灭菌，于是制成所需，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。在有些国家有厂家制作和销售这种干粉培养要的培养基。在有些国家有厂家制作和销售这种干粉培养基，我国市场上目前尚无供应。干粉培养基可用于常规的基，我国市场上目前尚无供应。干粉培养基可用于常规的实验目的，如植物的快速繁殖等，在这类实验中所需的培实验目的，如植物的快速繁殖等，在这类实验中所需的培养基成分是早已完全确定了的。在这种情况下，使用干粉养基成分是早已完全确定了的。在这种情况下，使用干粉培养基就可以节省时间和金钱培养基就可以节省时间和金钱。现在学习的是第35页，共41页l2.2.储备母液配制储备母液配制:(1)(1)浓缩贮备液的浓缩倍数：浓缩
38、贮备液的浓缩倍数：1)1)大量元素（浓缩大量元素（浓缩2020倍）；倍）；l2)2)微量元素（浓缩微量元素（浓缩200200倍）；倍）；l3)3)铁盐（浓缩铁盐（浓缩200200倍）；倍）；4)4)除蔗糖之外的有机物质（浓缩除蔗糖之外的有机物质（浓缩200200倍）。倍）。l5)5)生长调节物质生长调节物质(浓度浓度:mg/ml,:mg/ml,分别配制分别配制)（2 2）浓缩贮备液配制方法：）浓缩贮备液配制方法：l 以培养及为例，其贮备液的配置如表以培养及为例，其贮备液的配置如表3-63-6所示。所示。现在学习的是第36页，共41页l表表3-6 MS3-6 MS贮备液的配制贮备液的配制现在学习
39、的是第37页，共41页l（3 3）浓缩贮备液配制时注意问题：）浓缩贮备液配制时注意问题：l1)1)在制备这在制备这4 4种贮备液的时候，应使每种成分分别溶解，一种贮备液的时候，应使每种成分分别溶解，一粒不剩，然后再把它们彼此混合粒不剩，然后再把它们彼此混合;l 2)2)各种生长调节物质的贮备液应当分别配制，如果它们各种生长调节物质的贮备液应当分别配制，如果它们是不溶于水的，则应先把它们溶解在很少量的适当溶剂中是不溶于水的，则应先把它们溶解在很少量的适当溶剂中（见第（见第3 32.32.3节），然后再加蒸溜水到最终容积。节），然后再加蒸溜水到最终容积。l 3)3)生长调节物质浓度取决于所要求的生
40、长调节物质的水平，其生长调节物质浓度取决于所要求的生长调节物质的水平，其贮备液的强度可以是贮备液的强度可以是mmolmmolL L，也可以是，也可以是10mmol10mmolL L。l 4)4)所有贮备液都应贮存于适当的塑料瓶或玻璃瓶中，置冰所有贮备液都应贮存于适当的塑料瓶或玻璃瓶中，置冰箱中保存。铁盐贮备液须贮存于琥珀色玻璃瓶中，在贮备椰子汁箱中保存。铁盐贮备液须贮存于琥珀色玻璃瓶中，在贮备椰子汁（液体胚乳）的时候，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以（液体胚乳）的时候，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于一除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮
41、存于一2020的低温的低温冰箱内。冰箱内。l 5)5)作为一项规则，在使用这些贮备液之前必须轻轻摇动瓶子，如作为一项规则，在使用这些贮备液之前必须轻轻摇动瓶子，如果发现其中有沉淀悬浮物或微生物污染，必须立即将其淘汰。果发现其中有沉淀悬浮物或微生物污染，必须立即将其淘汰。l 6)6)在制备贮备液和培养基的时候，应当使用蒸馏水或无离在制备贮备液和培养基的时候，应当使用蒸馏水或无离子水，以及高纯度的化学试剂。子水，以及高纯度的化学试剂。现在学习的是第38页，共41页l（4 4）常用固体培养基的配制步骤）常用固体培养基的配制步骤(以以1L1L为例为例)：l 1 1）称出规定数量的琼脂）称出规定数量的琼
42、脂(7-10g)(7-10g)和蔗糖和蔗糖20-40g)20-40g)，加水，加水直到培养基最终容积的直到培养基最终容积的1/2-3/4(500-700ml)1/2-3/4(500-700ml)，在恒温水浴，在恒温水浴中加热使之溶解中加热使之溶解,也可直接加热或放入微波炉加热溶解。也可直接加热或放入微波炉加热溶解。在配制液体培养基时则无须加热，因为蔗糖甚至在微温的在配制液体培养基时则无须加热，因为蔗糖甚至在微温的水中也能溶解。水中也能溶解。l 2 2）分别加入一定量的各种贮备液）分别加入一定量的各种贮备液:大量元素大量元素50ml;50ml;微微量元素量元素5ml;5ml;铁盐铁盐5ml;5m
43、l;有机营养有机营养5ml;5ml;生长调节物质和其他的生长调节物质和其他的特殊补加物适量。如果由于特殊原因有必要在高压灭菌之特殊补加物适量。如果由于特殊原因有必要在高压灭菌之后再加入维生素和生长素，那么在调节了后再加入维生素和生长素，那么在调节了PHPH值之后，可使值之后，可使这些物质的溶液通过孔径为这些物质的溶液通过孔径为0 022220.45m0.45m的微孔滤器的微孔滤器消毒。消毒。l 现在学习的是第39页，共41页l 3 3）加蒸馏水直至培养基的最终容积。）加蒸馏水直至培养基的最终容积。l 4 4）充分混合之后，用）充分混合之后，用0.l mol0.l molL NaOH L NaO
44、H 和和0.1mol0.1molL L HCI HCI 调节培养基的调节培养基的PHPH到到5.8-6.0,PH5.8-6.0,PH过低过低,不易凝固不易凝固,过高过高培养基变硬。培养基变硬。l 5 5）把培养基分装到所选用的培养容器中，每个）把培养基分装到所选用的培养容器中，每个 25 X 25 X 150mm150mm的试管约装培养基的试管约装培养基15ml15ml；每个；每个150ml150ml的三角瓶约装的三角瓶约装50ml50ml。l如果在步骤如果在步骤2 25 5期间培养基开始凝固，应将装培养基的期间培养基开始凝固，应将装培养基的三角瓶置水浴中加热，只有当培养基为均匀的液态时才三角瓶置水浴中加热，只有当培养基为均匀的液态时才能分装。能分装。l 现在学习的是第40页，共41页l6 6）用包在纱布中的棉塞（它能阻止微生物污染，但可）用包在纱布中的棉塞（它能阻止微生物污染，但可使气体自由交换），或其他适宜的塞或盖封严瓶口。使气体自由交换），或其他适宜的塞或盖封严瓶口。l 7 7）把已装入了培养基的培养容器装在铁丝篮子）把已装入了培养基的培养容器装在铁丝篮子里，外面包上一层铝箔以防止棉塞在高压灭菌时里，外面包上一层铝箔以防止棉塞在高压灭菌时吸湿，在吸湿，在120120（1.06kg1.06kgcm2cm2）下灭菌）下灭菌15min15min。现在学习的是第41页，共41页