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1、医学遗传学章诊断预防治疗第一页，讲稿共一百三十九页哦依遗传病诊断的时间不同分：依遗传病诊断的时间不同分：&现症病人诊断：现症病人诊断：临床病人临床病人(患者患者)的诊断。的诊断。&症状前诊断：症状前诊断：症状出现前症状出现前的确认的确认(延迟显现、携带者延迟显现、携带者)。&产前诊断：产前诊断：胎儿出生前胎儿出生前诊断诊断(染色体、基因、酶染色体、基因、酶)。第二页，讲稿共一百三十九页哦产前诊断产前诊断和和症状前诊断症状前诊断均可均可较早较早地发现遗传病地发现遗传病患者患者或或携带者携带者。产前诊断产前诊断选择性流产选择性流产可减少可减少患者患者/携带者携带者出生。出生。症状前诊断症状前诊断在
2、症状出现前在症状出现前早治疗早治疗以控制或延迟以控制或延迟症状出现的症状出现的时间时间及及严重程度严重程度。所以遗传病所以遗传病产前诊断产前诊断和和症状前诊断症状前诊断就比就比现症病现症病人的诊断人的诊断重要得多。重要得多。产前诊断产前诊断可可避免所有染色体异常胎儿避免所有染色体异常胎儿的出生和的出生和减少部分单基因病患儿减少部分单基因病患儿出生。出生。第一节第一节 遗传病的临床诊断遗传病的临床诊断第三页，讲稿共一百三十九页哦产前诊断产前诊断(出生前诊断；出生前诊断；prenatal diagnosisprenatal diagnosis）对胎儿羊水或绒毛细胞对胎儿羊水或绒毛细胞染色体、基因、
3、酶染色体、基因、酶的分析。的分析。适宜产前诊断的对象适宜产前诊断的对象依遗传病的依遗传病的严重程度严重程度和和发病率发病率的高低，产前诊断的高低，产前诊断的适宜对象排序如下：的适宜对象排序如下：夫妇之一有染色体畸变或是平衡易位携带者，夫妇之一有染色体畸变或是平衡易位携带者，夫妇染色体正常但生过染色体病患儿。夫妇染色体正常但生过染色体病患儿。3535岁以上的高龄孕妇。岁以上的高龄孕妇。夫妇之一是神经管畸形或生该畸形患儿的孕妇。夫妇之一是神经管畸形或生该畸形患儿的孕妇。第四页，讲稿共一百三十九页哦夫妇之一患先天性酶病或生过该病患儿的孕妇。夫妇之一患先天性酶病或生过该病患儿的孕妇。X X连锁遗传病致
4、病基因携带者连锁遗传病致病基因携带者(生过患儿生过患儿)孕妇。孕妇。习惯性流产史习惯性流产史(2(2次以上不明原因流产次以上不明原因流产)的孕妇。的孕妇。羊水过多羊水过多(2000ml2000ml;一般一般800-1200ml800-1200ml)的孕妇。的孕妇。夫妇之一有致畸因素夫妇之一有致畸因素(射线、药物射线、药物)接触史的孕妇。接触史的孕妇。有有ARAR遗传病家族史，又近亲结婚的孕妇。遗传病家族史，又近亲结婚的孕妇。已出现已出现先兆流产、妊娠时间过长、有出血倾向先兆流产、妊娠时间过长、有出血倾向的孕妇的孕妇不宜做产前诊断不宜做产前诊断。第五页，讲稿共一百三十九页哦 产前诊断的技术和方法
5、产前诊断的技术和方法 BB超超B超是一种安全无创的检测方法，能够详细检超是一种安全无创的检测方法，能够详细检查胎儿的外部形态和内部结构，使许多遗传性疾查胎儿的外部形态和内部结构，使许多遗传性疾病得到早期诊断。病得到早期诊断。可诊断疾病有可诊断疾病有;神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇裂、腭裂，颈部淋巴管肿瘤；先天性心脏病，支唇裂、腭裂，颈部淋巴管肿瘤；先天性心脏病，支气管及肺发育异常、胸腔积液气管及肺发育异常、胸腔积液。其他的异常，如先天性单侧其他的异常，如先天性单侧肾缺如，先天性幽门肾缺如，先天性幽门狭窄、先天性巨结肠狭窄、先天性巨结肠等。等。第六页，讲稿共一百三
6、十九页哦 羊膜穿刺羊膜穿刺羊膜穿刺羊膜穿刺是在是在B超的监视下，有经验的医生用消超的监视下，有经验的医生用消毒的注射器抽取胎儿羊水毒的注射器抽取胎儿羊水（图图）。）。羊膜穿刺一般在妊娠羊膜穿刺一般在妊娠16201620周进行，流产的风周进行，流产的风险相对较小。险相对较小。抽取的羊水进行抽取的羊水进行生化检测生化检测；胎儿脱落细胞培养胎儿脱落细胞培养后进行后进行生化检测、染色体分析生化检测、染色体分析或或基因检测基因检测。如；羊水中如；羊水中甲胎蛋白甲胎蛋白浓度过高时，提示胎儿可浓度过高时，提示胎儿可能有无脑、开放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积能有无脑、开放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积水等异常。
7、水等异常。第七页，讲稿共一百三十九页哦孕孕16201620周羊水取样示意图周羊水取样示意图耻骨耻骨与与肚脐肚脐连连线线1/21/2处进针处进针,抽取抽取15-2015-20mlml。第八页，讲稿共一百三十九页哦绒毛取样法绒毛取样法妊娠妊娠7979周进行，是周进行，是早期诊断早期诊断方法。方法。在在B B超监视下，用特制取样器，从阴道经宫颈进入子超监视下，用特制取样器，从阴道经宫颈进入子宫，沿子宫壁到达取样处，吸取绒毛宫，沿子宫壁到达取样处，吸取绒毛(图图)。优点；优点；时间早时间早，需作选择性流产时，孕妇，需作选择性流产时，孕妇损伤和损伤和痛苦较小痛苦较小。缺点；缺点；取样取样操作要求高操作要
8、求高，易污染易污染，胎儿、母体易胎儿、母体易感染感染，流产风险流产风险是羊膜取样的是羊膜取样的两倍两倍。范围；范围；诊断染诊断染色体病，遗传性酶病，性别鉴定色体病，遗传性酶病，性别鉴定及及可做可做基因诊断基因诊断的所有遗传病。的所有遗传病。第九页，讲稿共一百三十九页哦孕孕7979周绒毛取样法示意图周绒毛取样法示意图第十页，讲稿共一百三十九页哦脐带穿刺术脐带穿刺术在在B B超监视下超监视下，用细针经腹壁、子宫进入，用细针经腹壁、子宫进入胎儿脐带胎儿脐带抽取胎儿血液抽取胎儿血液。取样取样最好在妊娠最好在妊娠1818周周，常用于因，常用于因错过绒毛取错过绒毛取样样或或羊膜取样最佳时机羊膜取样最佳时机
9、或或羊水检查失败羊水检查失败的补救的补救措施。措施。可检测胎儿可检测胎儿血液系统疾病，先天性代谢缺血液系统疾病，先天性代谢缺陷病陷病及某些及某些单基因病单基因病。第十一页，讲稿共一百三十九页哦胎儿镜检查胎儿镜检查(羊膜腔羊膜腔镜镜或或宫宫腔腔镜镜)它可在羊膜腔直接观察胎儿它可在羊膜腔直接观察胎儿外形、性别外形、性别和和发育发育状况状况及有否及有否畸形畸形。还可还可抽取羊水抽取羊水或或胎血胎血检查及检查及宫内治疗宫内治疗。因此，因此，理论上这是一种最理想的方法理论上这是一种最理想的方法。但因但因操作困难操作困难，易引起并发症，易引起并发症，目前还不被目前还不被广泛采用。广泛采用。胎儿镜最佳检查时
10、间妊娠胎儿镜最佳检查时间妊娠18201820周，可诊断周，可诊断大疱性表皮松懈症大疱性表皮松懈症及某些及某些皮肤病皮肤病。第十二页，讲稿共一百三十九页哦分离孕妇外周血中的胎儿细胞分离孕妇外周血中的胎儿细胞前述前述产前诊断材料的获得产前诊断材料的获得对于胎儿和母体都有对于胎儿和母体都有创伤创伤，存在存在流产流产和和感染感染风险。风险。2020世纪世纪9090年代末，利用胎儿细胞可通过胎盘屏障进入年代末，利用胎儿细胞可通过胎盘屏障进入母体血液中，用母体血液中，用流式细胞仪分离技术流式细胞仪分离技术，磁激活细胞分选磁激活细胞分选技术，免疫磁珠法，显微操作分选法技术，免疫磁珠法，显微操作分选法，分离胎
11、儿细胞。，分离胎儿细胞。该法该法富集的胎儿细胞很少富集的胎儿细胞很少，需用高灵敏的技术方法进行，需用高灵敏的技术方法进行一步分析检测，常用方法一步分析检测，常用方法PCRPCR。第十三页，讲稿共一百三十九页哦植入前诊断植入前诊断随着随着体外受精，试管婴儿体外受精，试管婴儿和和胚胎移植胚胎移植技术的开展，技术的开展，以及以及单细胞基因诊断技术单细胞基因诊断技术的应用，目前正探索的应用，目前正探索胚胎植入胚胎植入前前的诊断技术。的诊断技术。体外培养体外培养的的4-84-8细胞胚胎细胞胚胎或或受精受精后后6 6天天胚胎着床前胚胎着床前，用显微操作技术取出一个细胞，应用用显微操作技术取出一个细胞，应用
12、PCRPCR等技术进行特等技术进行特定基因和染色体畸变的检测，将人类遗传缺陷掌控在最定基因和染色体畸变的检测，将人类遗传缺陷掌控在最早阶段。早阶段。是遗传病是遗传病产前诊断的重大突破产前诊断的重大突破。第十四页，讲稿共一百三十九页哦 二、病史、症状与体征二、病史、症状与体征 1 1病史：病史：主要采集与主要采集与遗传遗传病有关病有关项项目：目：(1)(1)家族史家族史:患者患者父、母父、母家系中各成家系中各成员员健康状况。健康状况。(2)(2)婚姻史婚姻史:婚婚龄龄、次数、配偶、次数、配偶及及配偶家系配偶家系健康状况，特健康状况，特 别别注意是否有注意是否有近近亲结亲结婚婚。(3)(3)生育史
13、生育史:育育龄龄、健康、健康及及患病患病子女数，有无子女数，有无流流产产、死、死产产、早早产产、畸胎、畸胎等等历历史。史。第十五页，讲稿共一百三十九页哦 2 2症状与体征症状与体征 遗传遗传病病常常表表现现特异症状特异症状和和体征体征：（1 1）特异性症候群特异性症候群：遗传遗传病的病的症状与体征症状与体征常常许许多多关关联联性状并列性状并列出出现现。如；与如；与智力低下智力低下相关的疾病相关的疾病(PKUPKU、半乳糖血症、半乳糖血症)，PKUPKU的特殊性状的特殊性状尿臭尿臭可区可区别别于其它疾病。于其它疾病。（2 2）绝绝大多数大多数遗传遗传病可病可见见形态学改变形态学改变(畸形畸形)。
14、（3 3）多数多数遗传遗传病有病有早期症状早期症状，如，如发发育育迟缓迟缓等。等。（4 4）遗传病的最后确诊，需遗传学的遗传病的最后确诊，需遗传学的特殊诊断特殊诊断。第十六页，讲稿共一百三十九页哦 三、系谱分析三、系谱分析 1 1群体普查：群体普查：某某时间对时间对某一群体某一群体进进行某些行某些遗传遗传病病发发病率病率调查调查。样本要求：样本要求：占占地区人口地区人口1/101/101/1001/100，1010万万人人。2 2家系调查：家系调查：对患者对患者1 1、2 2、3 3级级亲属发病率的调查。亲属发病率的调查。3 3系谱分析：系谱分析：经过经过回回顾顾性分析性分析以确定疾病以确定疾
15、病遗传遗传方式。方式。第十七页，讲稿共一百三十九页哦 系谱分析时的注意事项；系谱分析时的注意事项；（1 1）系统、完整：系统、完整：至少收集至少收集三代三代或或更多代更多代资资料，力求料，力求详细详细、准确、准确。如；死因、死胎、流如；死因、死胎、流产产、新生儿死亡、夭折、新生儿死亡、夭折、有无近婚、重婚、非婚生子女、半同胞、养子女有无近婚、重婚、非婚生子女、半同胞、养子女 及嫁出和嫁入者的家族及嫁出和嫁入者的家族资资料等。料等。（2 2）去伪存真：去伪存真：与患者沟通要与患者沟通要热热情、耐心、有同情心情、耐心、有同情心以取得信以取得信 任。要任。要讲讲明意明意义义，晓晓以利害，并以利害，并
16、进进行必要的核行必要的核查查。第十八页，讲稿共一百三十九页哦 (3)(3)系谱分析时要考虑全面：系谱分析时要考虑全面：遗传方式、单基因遗传、线粒体遗传、多基遗传方式、单基因遗传、线粒体遗传、多基因遗传、遗传异质性、外显不全、延迟显性、限因遗传、遗传异质性、外显不全、延迟显性、限性显性、从性显性、遗传印记、动态突变，以及性显性、从性显性、遗传印记、动态突变，以及散发病例的新基因突变引发等。散发病例的新基因突变引发等。特别是有特别是有遗传异质性遗传异质性的疾病；的疾病；如如耳聋耳聋，50%-50%-单单；ARAR占占43.5%;43.5%;ADAD占占6.5%;6.5%;XRXR0.5%;0.5%
17、;环环境境占占30%30%；特特发发占占20%20%。先天性白先天性白内内障障；10%10%单单基因基因(多多AD)AD)、20%20%染色染色 体畸体畸变变、25%25%宫内宫内感染感染、34%34%特特发发。第十九页，讲稿共一百三十九页哦第二节第二节 细胞遗传学检查细胞遗传学检查 核型分析核型分析是是确诊染色体病确诊染色体病的主要方法。的主要方法。家族中有家族中有智力发育不全智力发育不全、先天畸形先天畸形(生殖器畸形生殖器畸形)、生殖能力异常生殖能力异常(不育、闭经、多发性流产不育、闭经、多发性流产)的的个个体体以以及及确认染色体异常者或携带者确认染色体异常者或携带者时均宜检查染色体。时均
18、宜检查染色体。如如;发育迟缓发育迟缓：常见常见1 1q q与与1111p p相互易位。相互易位。乳腺癌乳腺癌的多种染色体异常的多种染色体异常t(1q;11q)t(1q;11q)第二十页，讲稿共一百三十九页哦染色体检查适应征染色体检查适应征有下列情况之一的应建议其作核型分析有下列情况之一的应建议其作核型分析有多个出生缺陷患者的家系。有多个出生缺陷患者的家系。习惯性流产的夫妇双方。习惯性流产的夫妇双方。可疑是先天愚型的个体及其双亲。可疑是先天愚型的个体及其双亲。X X或或Y Y染色质数目异常者。染色质数目异常者。体态和精神发育异常并伴有先天畸型者。体态和精神发育异常并伴有先天畸型者。卵巢或睾丸发育
19、不全者。卵巢或睾丸发育不全者。原发性闭经，女性不孕和男性不育者。原发性闭经，女性不孕和男性不育者。外生殖器两性畸形者。外生殖器两性畸形者。身身材高大材高大(1.80(1.80以上以上)且且性格粗暴者。性格粗暴者。恶恶性血液病性血液病(慢粒、急淋等慢粒、急淋等)患者患者。第二十一页，讲稿共一百三十九页哦性染色质检查性染色质检查(X X/Y Y染色染色质质)：针对针对两性畸形两性畸形或或性染色体数目异常性染色体数目异常疾病疾病而进行的检查，可作为染色体检查的一种而进行的检查，可作为染色体检查的一种辅助手段辅助手段。易取材易取材(口腔上皮、发根毛囊口腔上皮、发根毛囊)、时间短、时间短、费用低、易接受
20、。费用低、易接受。第二十二页，讲稿共一百三十九页哦第三节蛋白质水平诊断第三节蛋白质水平诊断(生化检查生化检查)P193P193常见疾病的生化检查常见疾病的生化检查苯丙酮尿症苯丙酮尿症粘多糖病粘多糖病枫糖尿症枫糖尿症白化病白化病中间代谢中间代谢产物产物血清（血清（）苯丙氨酸苯丙氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸尿（尿（）苯丙酮酸苯丙酮酸苯乙酸苯乙酸硫酸皮肤素硫酸皮肤素硫酸乙肝素硫酸乙肝素硫酸角质素硫酸角质素酮衍生物酮衍生物缺陷酶缺陷酶酶活性（酶活性（）苯丙氨酸羟化苯丙氨酸羟化酶酶支链酮酸羧支链酮酸羧化酶化酶酪氨酸酪氨酸酶酶酶检测采样部酶检测采样部位位肝肝肝肝白细胞白细胞成纤维细胞成纤维
21、细胞毛囊毛囊以生化手段以生化手段定性、定量定性、定量地分析患者的地分析患者的酶酶和和蛋白质蛋白质。临床诊断单基因病首选法，最常用检测临床诊断单基因病首选法，最常用检测酶的缺陷酶的缺陷。第二十三页，讲稿共一百三十九页哦第四节第四节基因诊断基因诊断直接检查直接检查基因结构基因结构，对被检查者是否有基因缺陷，对被检查者是否有基因缺陷 做出做出状态状态和和疾病疾病的诊断。的诊断。简悦简悦威威(YW KanYW Kan 19781978)首次用首次用DNADNA重重组组法法进进行行HbSHbS 产产前前诊断诊断，目前，目前临临床上普遍床上普遍开开始始试试用用基因基因诊断诊断技技术术。可做可做基因基因诊断
22、诊断疾病已疾病已达达40004000余余种种(包括包括亚亚型型)。基因基因诊断诊断的出的出现现，使，使对对疾病的疾病的诊断诊断模式模式由由表型表型诊诊 断断过过渡渡为为基因型基因型诊断诊断或或称称逆向诊断逆向诊断。基因基因基因型基因型表型表型第二十四页，讲稿共一百三十九页哦生化分析生化分析仅在仅在发病前发病前或或产前产前对对少数少数遗传病做诊断遗传病做诊断.因因待测物待测物是是蛋白质、酶蛋白质、酶或或激素激素等等基因基因的的产物产物，而，而基因表达基因表达有个体发育的有个体发育的阶段性阶段性和组织和组织特异性特异性,故故局局限限了疾病检测的类型。了疾病检测的类型。基因诊断基因诊断则则不受限制不
23、受限制，任何来源的任何来源的有核细胞有核细胞,基因基因的组成是一致的的组成是一致的(免疫球蛋白基因、免疫球蛋白基因、T T细胞受体基因、细胞受体基因、肿瘤细胞例外肿瘤细胞例外)。基因诊断基因诊断特别适用于特别适用于生化分析无法确诊生化分析无法确诊遗传病。遗传病。第二十五页，讲稿共一百三十九页哦如；如；PKUPKU，生化检测需取，生化检测需取肝组织肝组织来测来测定定苯丙氨酸羟化酶苯丙氨酸羟化酶活性，因无法取得胎活性，因无法取得胎儿的肝组织细胞而不能做儿的肝组织细胞而不能做产前诊断产前诊断。基因诊断基因诊断直接以直接以基因基因为探测对象为探测对象，可，可用所有用所有有核细胞有核细胞为标本。为标本。
24、PKUPKU可可取取绒毛绒毛或或羊水细胞羊水细胞进行诊断。进行诊断。第二十六页，讲稿共一百三十九页哦一、基因诊断的特点一、基因诊断的特点直接检测直接检测基因结构基因结构基因基因型型表型表型。逆向诊断逆向诊断改改变了了传统表型表型诊断断模式，可在模式，可在发发病前，病前，产前前和和对携携带者者做出准确做出准确诊断断，并并 不受不受时间、细胞胞类型、年型、年龄限制。限制。因基因诊断的特点因基因诊断的特点:针对性强、特异性高、针对性强、特异性高、灵敏度高、适应性广灵敏度高、适应性广。第二十七页，讲稿共一百三十九页哦以以特定基因特定基因为目标，检测基因变化，为目标，检测基因变化，特异性强特异性强。分子
25、杂交和分子杂交和PCRPCR技术具有技术具有信号放大信号放大作用，作用，微量微量样品样品即可进行诊断，即可进行诊断，灵敏度高灵敏度高。在疾病尚在疾病尚无临床表现前无临床表现前和和产前产前，以及，以及特定人群特定人群的筛查等，的筛查等，针对性强针对性强。检测样品获得便利，不受个体检测样品获得便利，不受个体发育阶段性发育阶段性和和基基因表达与否因表达与否限制，限制，适应广泛适应广泛。基因突变具多样性，除基因突变具多样性，除缺失、缺失、倒位、点突变、倒位、点突变、动态突变动态突变可进行基因检测外，大多数基因突变可进行基因检测外，大多数基因突变的的分析复杂而繁琐分析复杂而繁琐，有较高的难度。，有较高的
26、难度。第二十八页，讲稿共一百三十九页哦二、基因诊断的基本途径二、基因诊断的基本途径 2 2、致病基因未知或不清的致病基因未知或不清的-间接诊断间接诊断分分直接诊断直接诊断和和间接诊断间接诊断两种；两种；1 1、致病基因已知的疾病致病基因已知的疾病-直接诊断直接诊断 使用使用基因本身基因本身或或紧邻的紧邻的DNADNA序列序列为探针，检测为探针，检测 有无突变、缺失等异常。有无突变、缺失等异常。致病基因不清时，不能直接检测，可采用致病基因不清时，不能直接检测，可采用DNADNA 多态性标记多态性标记的检测法，利用的检测法，利用已知多态性遗传标已知多态性遗传标记记与与疾病的连锁关系疾病的连锁关系间
27、接诊断疾病。间接诊断疾病。第二十九页，讲稿共一百三十九页哦 （2 2）基因突变诊断举例基因突变诊断举例RFLPRFLP对对PKU(PKU(ARAR)的的基因诊断基因诊断用克隆的用克隆的PAHPAH基因基因(苯丙氨酸羟化酶苯丙氨酸羟化酶)做探针，做探针，SouthernSouthern杂交：杂交：用用3 3种限制酶种限制酶(MapI(MapI、SphI)SphI)对对7 7个个PKUPKU家系家系进行进行长长度片段多度片段多态态性性(RFLP)(RFLP)分析。分析。第三十页，讲稿共一百三十九页哦MspMsp酶切显示；仅有酶切显示；仅有1919kbkb片片段是段是患者患者,说明说明19kb19k
28、b片段与片段与PKUPKU致病基因连锁致病基因连锁。含含23kb23kb片段者片段者正常正常；同；同 时时有有1919kbkb和和2323kbkb是是携携带带者者。1 2 1 21 2 1 2MM2323/MM19 19 MM2323/MM1919 S S9.7/9.7/S S7.07.0 S S9.7/9.7/S S7.07.0 3 343 34MM1919/MM1919 MM2323/MM23 23 S S9.7/9.7/S S9.9.7 7 S S7.0/7.0/S S7.07.0MspMsp酶切酶切SphSph酶切酶切2323kb11kb11kb1919kb9.7kb9.7kb7.0k
29、b7.0kb1 2 3 4 1 2 3 41 2 3 4 1 2 3 4 SphI SphI酶切酶切结结果果显显示示;9.79.7kbkb片段片段与与致病基因致病基因 连锁连锁，7.0Kb7.0Kb正常，正常，仅仅 有有9.79.7kbkb片段是片段是患者患者。第三十一页，讲稿共一百三十九页哦 现现在在对对PAHPAH基因已有了更深入了解，基因已有了更深入了解，它它位位 于于1212q q22-24.122-24.1，长约长约9090kbkb，PKUPKU的基因的基因诊断诊断 就不就不仅仅限于使用限于使用RFLPRFLP法，也可用法，也可用SSCPSSCP技技术术 直接直接检测检测基因的突基因
30、的突变变。在高加索人中已在高加索人中已发现发现4040多多种种由由点突点突变变及及缺缺 失失引起的引起的PAHPAH突突变变基因，在中基因，在中国国PKUPKU患者中患者中 检检出了出了1414种种点突点突变变。第三十二页，讲稿共一百三十九页哦 2 2、血友病血友病A A的基因诊断的基因诊断 血友病血友病A A是是凝血因子凝血因子(F F)基因缺陷，主要为碱基因缺陷，主要为碱基取代或碱基缺失、插入，这些突变产物是基取代或碱基缺失、插入，这些突变产物是不完整、不完整、无活性无活性或或不稳定不稳定F F肽链，故临床症状轻重不一。肽链，故临床症状轻重不一。基因诊断法可检出有基因诊断法可检出有部分缺失
31、部分缺失的的患者患者和和女携带者女携带者。产前基因诊断可通过产前基因诊断可通过RFLPRFLP连锁分析连锁分析。目前多采用目前多采用PCRPCR与与RFLPRFLP相结合方法，先用相结合方法，先用PCRPCR技术技术将包含将包含突变突变DNADNA片段扩增片段扩增，然后用识别该位点的，然后用识别该位点的限制限制酶酶来来酶解，酶解，电泳后电泳后直接检测多态性位点直接检测多态性位点的状态。的状态。第三十三页，讲稿共一百三十九页哦1 21 21 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 75/5/5 5 5 5/-5/-5/5 5 5/20 5/-5/20 5/-5 5/20 20/-5/-20
32、/-/20 20/-5/-20/-20Kb 20Kb -5 Kb 5 Kb-A AB B上图可知；母亲是上图可知；母亲是5.05.0和和2020杂杂合体；合体；6 6得到得到5.05.0片段片段 是患者，是患者，7 7得到得到2020片段正常；片段正常；说说明明5.05.0是是带带致病基因致病基因 片段；片段；1 1、3 3是是5.05.0纯纯合子合子,其父其父2 2具有具有5.05.0等位片等位片 段段(功能正常功能正常)，故，故2 2正常。正常。从检测结从检测结果提示；果提示；1 1、3 3是是5.05.0/5.05.0，如，如怀怀孕，孕，应应做做产产前基因前基因诊断诊断。血友病血友病A
33、A系谱系谱 Bgl酶切酶切？第三十四页，讲稿共一百三十九页哦3 3、DNADNA序列测定技术序列测定技术目前的两种序列测定技术是目前的两种序列测定技术是SangerSanger等等(1977)(1977)提出的提出的 酶法及酶法及MaxamMaxam和和Gilbert(1977)Gilbert(1977)提出的化学降解法。提出的化学降解法。两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性 标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但 却随机终止于特定的一种或者多种残基上。却随机终止于特定的一种或者多种残基上
34、。由于由于DNADNA上的每个上的每个bpbp出现在可变终止端的机会均等，出现在可变终止端的机会均等，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNADNA全片全片 段上的位置所决定。段上的位置所决定。然后在可区分长度仅差一个核苷酸的不同然后在可区分长度仅差一个核苷酸的不同DNADNA分子的分子的 条件下条件下,对各组寡核苷酸电泳分析对各组寡核苷酸电泳分析,只要把几组寡核苷只要把几组寡核苷 酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从 凝胶的放射自影片上直接读出凝胶的放射自影片上直接读出DNADNA上的核苷酸顺序
35、。上的核苷酸顺序。第三十五页，讲稿共一百三十九页哦为适应大规模测序的需要，高速为适应大规模测序的需要，高速DNADNA测序技术在不断测序技术在不断发展，发展，19871987美国应用生物系统公司美国应用生物系统公司(AppliedBiosystem)(AppliedBiosystem)年推出年推出自动自动DNADNA序列测定仪序列测定仪(370(370和和373373型型)。90 90年代初，欧洲分子生物学实验室年代初，欧洲分子生物学实验室(EMBL)(EMBL)与瑞典的与瑞典的PharaciaPharacia公司也联手推出最新型的公司也联手推出最新型的全自动激光序列分全自动激光序列分析仪析仪
36、(A.L.F)(A.L.F)，使用该仪器每克隆能分离到，使用该仪器每克隆能分离到1000bp,1000bp,两条两条DNADNA模板分别测序后精确率模板分别测序后精确率 99.17%99.17%。完成了。完成了DNADNA序列测定序列测定的又一次重大突破。的又一次重大突破。第三十六页，讲稿共一百三十九页哦 4 4、基因芯片、基因芯片基因芯片基因芯片又称又称DNADNA芯片芯片(DNA chipDNA chip)或或DNADNA微阵列微阵列(DNA DNA microarraymicroarray)。其其原理原理是采用是采用光导原位合成光导原位合成或或显微印刷显微印刷等方法将等方法将 大量特大量
37、特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上，然后加入标记的待测样品，进玻片、硝酸纤维素膜等载体上，然后加入标记的待测样品，进行多元杂交，通过杂交信号的强弱及分布，来分析行多元杂交，通过杂交信号的强弱及分布，来分析目的目的DNADNA的有的有无、数量及序列，从而获得受检样品的遗传信息。无、数量及序列，从而获得受检样品的遗传信息。其工作原理是应用已知核酸序列与互补的靶序列杂交，根据其工作原理是应用已知核酸序列与互补的靶序列杂交，根据杂交信号进行定性与定量分析。杂交信号进行定性与定量分析。第三十七页，讲稿共
38、一百三十九页哦 基因芯片能够同时平行分析数万个基因基因芯片能够同时平行分析数万个基因,进行高通量筛进行高通量筛选与检测分析。选与检测分析。根据所用根据所用探针类型探针类型,基因芯片可分为基因芯片可分为cDNA(cDNA(comp lement comp lement DNADNA)芯片芯片和和寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片。根据根据检测目的检测目的又可分为又可分为表达谱芯片表达谱芯片和和单核苷酸多态性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPsingle nucleotide polymorphisms,SNP)芯片芯片。随着芯片技术在其他生命科学领域的延
39、伸随着芯片技术在其他生命科学领域的延伸,基因芯片的基因芯片的概念已泛化为生物芯片；包括基因芯片、蛋白质芯片、概念已泛化为生物芯片；包括基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片、细胞芯片、流式芯片、组织芯片等。糖芯片、细胞芯片、流式芯片、组织芯片等。第三十八页，讲稿共一百三十九页哦基因诊断相关概念基因诊断相关概念1、探针、探针(probe)(probe)带有可以检出标记物的一段特定核苷酸序列带有可以检出标记物的一段特定核苷酸序列。可以是可以是基因本身基因本身或或基因的一部分基因的一部分，也可是，也可是与目与目的基因紧密连锁的遗传标记的基因紧密连锁的遗传标记，它能专一地与目的它能专一地与目的基因或标记互补结合
40、。基因或标记互补结合。探针贮存形式有探针贮存形式有重组质粒重组质粒和和含重组质粒的细菌含重组质粒的细菌或噬菌体或噬菌体两种。依探针来源的不同，可分为两种。依探针来源的不同，可分为5 5种：种：第三十九页，讲稿共一百三十九页哦基因组探针；基因组探针；从基因组中分离制备出的探针从基因组中分离制备出的探针。cDNAcDNA探针；探针；以以mRNAmRNA为为模板模板，反转录得到反转录得到cDNAcDNA制成的探针。制成的探针。人工合成的寡核苷酸探针；人工合成的寡核苷酸探针；病毒的病毒的DNADNA或或RNARNA片段；片段；人类特定人类特定RNARNA探针；探针；第四十页，讲稿共一百三十九页哦标记：
41、标记：放射性同位素放射性同位素：3232P P、3 3H H、1414C C、3535S S、125125I I、检测：检测：液闪仪记数：液闪仪记数：适于点杂交。适于点杂交。放射自显影：放射自显影：X X光片；乳光片；乳胶胶(适于原位适于原位杂杂交交)。标记：标记：非放射性：非放射性：银银、二硝基苯、磺基二硝基苯、磺基。荧光物质：荧光物质：罗罗丹明丹明(FITC(FITC)、半抗原、半抗原、毛地黄毛地黄甙、三硝基苯酚、生物素甙、三硝基苯酚、生物素。酶：酶：辣根辣根过氧过氧化物酶化物酶(HRP)HRP)、碱碱性磷酸酶性磷酸酶(ARP)ARP)。第四十一页，讲稿共一百三十九页哦 2 2、限制性内切
42、酶限制性内切酶(RestrictionEndozymes；RERE）RE RE是一类具有严格识别位点的酶类，属水解酶是一类具有严格识别位点的酶类，属水解酶类，均从细菌中提取而来。类，均从细菌中提取而来。依识别位置和切割位置的相关性可分三类；依识别位置和切割位置的相关性可分三类；即即型、型、型、型、型。型。型型识别与切割位点一致，为识别与切割位点一致，为基因工程使用基因工程使用。RERE的命名；依来源菌株命名；的命名；依来源菌株命名；属名属名+种名种名+株名株名-酶酶编号缩写字符编号缩写字符组合而成。组合而成。如如EcoR；来自大肠杆菌；来自大肠杆菌(Escherichia coli)R菌菌株、
43、分离到的第一种酶。株、分离到的第一种酶。第四十二页，讲稿共一百三十九页哦限制性内切酶限制性内切酶(Type(Type RERE）最常用的是最常用的是限制性内切酶限制性内切酶，它可以特异地识别和，它可以特异地识别和切割核苷酸序列，其识别接合与切割均在同一位切割核苷酸序列，其识别接合与切割均在同一位（迴（迴 文文结构结构，4 477个个核核苷苷酸）酸）点点，该位点称为限制性酶该位点称为限制性酶酶酶切位点切位点或或切点切点。在利用在利用DNADNA多态性进行的基因诊断中，限制性内切多态性进行的基因诊断中，限制性内切酶的选择是否正确有效酶的选择是否正确有效，以及酶解的好坏直接决定了，以及酶解的好坏直接
44、决定了基因诊断的基因诊断的准确与否准确与否。第四十三页，讲稿共一百三十九页哦 3 3、分子杂交分子杂交同源或异源的两条同源或异源的两条DNADNA单链，依据碱基配单链，依据碱基配 对原则形成一条双链对原则形成一条双链DNADNA的过程。的过程。分子分子杂交杂交按杂交按杂交介质分介质分按杂交按杂交体系分体系分液相杂交液相杂交固相杂交固相杂交膜上杂交膜上杂交(印迹杂交印迹杂交)斑点杂交斑点杂交转膜杂交转膜杂交菌落杂交菌落杂交玻片或乳胶杂交玻片或乳胶杂交甲酰胺体系甲酰胺体系无甲酰胺体系无甲酰胺体系第四十四页，讲稿共一百三十九页哦现在常用的是现在常用的是固相杂交固相杂交，特别是在人工生物膜上，特别是在
45、人工生物膜上进行的膜上印迹杂交，人工生物膜主要有硝酸纤维进行的膜上印迹杂交，人工生物膜主要有硝酸纤维素膜和尼龙膜。素膜和尼龙膜。探针与待测探针与待测DNADNA分子杂交的主要过程分子杂交的主要过程 待测待测DNADNA样本样本限制性内切酶消化限制性内切酶消化 变性成单链变性成单链加入变性好的探针加入变性好的探针杂交杂交 洗脱洗脱(除去未杂交上的样本除去未杂交上的样本DNADNA和探针和探针)分析分析(检测探针信号，确认是否杂交上检测探针信号，确认是否杂交上)第四十五页，讲稿共一百三十九页哦斑点杂交斑点杂交膜上印迹杂交的一种。膜上印迹杂交的一种。用打点器将待测用打点器将待测DNADNA样本样本(
46、经经限制性限制性内内切酶消化后切酶消化后)直接点于生物膜上形成圆点直接点于生物膜上形成圆点(斑点斑点)印迹，而后进行印迹，而后进行的杂交称的杂交称-斑点杂交斑点杂交。DNADNA样本若形成样本若形成狭缝状狭缝状称称狭缝杂交狭缝杂交。属于斑点杂交的变型。属于斑点杂交的变型。第四十六页，讲稿共一百三十九页哦SouthernSouthern转移与转移与SouthernSouthern杂交杂交 膜上印迹杂交中的膜上印迹杂交中的转膜杂交转膜杂交。SouthernSouthern转转移移就是将就是将DNADNA从凝胶从凝胶转转移到生物膜上的移到生物膜上的 技技术术，是英国，是英国SouthernSouth
47、ern建立的。建立的。特点是特点是；待待测测DNADNA样样本本点在点在凝胶凝胶上，上，经经SouthernSouthern转转 移，移，将凝胶将凝胶电电泳分离的泳分离的DNADNA样样本片段原位本片段原位转转移到生物移到生物 膜上再膜上再进进行的行的杂杂交。交。Southern Southern杂杂交交即是即是转转移后移后进进行的行的杂杂交。交。第四十七页，讲稿共一百三十九页哦 SouthernSouthern转转移移解决了探解决了探针针与与电电泳分离后在凝胶中的泳分离后在凝胶中的 DNADNA片段片段进进行行杂杂交的交的问题问题（凝胶因（凝胶因软软易碎而不适于作易碎而不适于作杂杂 交介交介
48、质质)，在早期，在早期DNADNA多多态态性分析性分析中中发挥发挥了突出的作用。了突出的作用。后来，有人将后来，有人将RNARNA电电泳泳结结果从凝胶果从凝胶转转移到生物膜上的移到生物膜上的 过过程称程称为为NorthernNorthern转转移，移，经过经过NorthernNorthern过过程而程而进进行的行的杂杂 交称交称为为NorthernNorthern杂杂交交。将蛋白将蛋白质质从凝胶从凝胶转转移至生物膜上移至生物膜上进进行行检测检测的的过过程称程称 为为WesternWestern转转移移。第四十八页，讲稿共一百三十九页哦 4 4、DNADNA多态性多态性 (1)(1)限制性片段长
49、度多态性限制性片段长度多态性(RFLPRFLP）群体中不同个体在用群体中不同个体在用同一限制同一限制酶酶切割和用切割和用同一探同一探针针进进 行行检测时检测时，DNADNA酶酶切片段切片段长长度可能出度可能出现现差异。差异。RFLPRFLP反映了反映了DNADNA多多态态性性，是，是第一代多态性遗传标记第一代多态性遗传标记。因基因突变致限制酶的酶切位点发生改变，从而因基因突变致限制酶的酶切位点发生改变，从而导致酶切片段在长度上表现出的多态性。导致酶切片段在长度上表现出的多态性。第四十九页，讲稿共一百三十九页哦 多态性多态性可能与疾病无关可能与疾病无关或或相关联相关联，当一当一疾病与某疾病与某R
50、FLPRFLP片段紧密连锁，且酶切片段长度及变异可用电片段紧密连锁，且酶切片段长度及变异可用电泳及分子杂交法加以鉴定时泳及分子杂交法加以鉴定时，则可结合家系，利用，则可结合家系，利用RFLPRFLP连锁分析对疾病做出连锁分析对疾病做出基因诊断基因诊断。较准确的较准确的RFLPRFLP诊断诊断，常需，常需2 2或或2 2种以上种以上限制性内切限制性内切酶处理并进行酶处理并进行染色体单体型分析染色体单体型分析。即即对一条染色体上两个或两个以上多态性位点状对一条染色体上两个或两个以上多态性位点状态的组合的分析态的组合的分析。第五十页，讲稿共一百三十九页哦 (2)(2)串联重复序列串联重复序列(VNT