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1、免疫缺陷动物与转基因动物第一页，讲稿共七十页哦主要内容v一、免疫缺陷动物一、免疫缺陷动物v基本概念v免疫缺陷动物的分类v常用免疫缺陷动物的特点和应用v二、二、转基因动物转基因动物v基本概念v转基因动物的命名v目前制作转基因动物的主要方法v转基因动物研究的意义及应用第二页，讲稿共七十页哦第一节免疫缺陷动物v一、基本概念一、基本概念v免疫缺陷免疫缺陷（immunodeficiency diseases)immunodeficiency diseases)是免疫系统中任何一个环节或其组分因先是免疫系统中任何一个环节或其组分因先天发育不全或后天因各种因素所致损害而天发育不全或后天因各种因素所致损害而使
2、免疫活性细胞的发生发展、分化增殖和使免疫活性细胞的发生发展、分化增殖和代谢异常并引起免疫功能不全所出现的临代谢异常并引起免疫功能不全所出现的临床综合征。床综合征。第三页，讲稿共七十页哦v免疫缺陷动物（免疫缺陷动物（immunodeficientanimal)是指由于先天性遗传突变或用是指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。成成分缺陷的动物。第四页，讲稿共七十页哦免疫缺陷病大体分为两类：v1、先天（或原发）性免疫缺陷，可导、先天（或原发）性免疫缺陷，可导致对病原微生物的高度易感性；致对病原微生物的高度易感性；v2、获得（或继发）
3、性免疫缺陷，可由、获得（或继发）性免疫缺陷，可由于营养不良、恶性肿瘤、免疫抑制药于营养不良、恶性肿瘤、免疫抑制药物治疗或是免疫活性细胞受到病毒的物治疗或是免疫活性细胞受到病毒的感染。如感染。如HIVAIDS。第五页，讲稿共七十页哦二、免疫缺陷动物的分类v1 1、先天性免疫缺陷动物、先天性免疫缺陷动物v2 2、获得性免疫缺陷动物、获得性免疫缺陷动物v目前，世界各国相继培育出一系列免疫缺陷动物，目前，世界各国相继培育出一系列免疫缺陷动物，从啮齿类扩展到马和牛等大型哺乳类动物；从单一从啮齿类扩展到马和牛等大型哺乳类动物；从单一的的T淋巴细胞免疫缺陷到几种免疫细胞联合缺陷。淋巴细胞免疫缺陷到几种免疫细
4、胞联合缺陷。第六页，讲稿共七十页哦v第七页，讲稿共七十页哦三、常用免疫缺陷动物的特点和应用三、常用免疫缺陷动物的特点和应用v1、裸小鼠（、裸小鼠（Nude mice）v即先天性无胸腺裸小鼠，由即先天性无胸腺裸小鼠，由11号染色体上号染色体上nu隐性隐性基因突变导致。基因突变导致。该基因已回交到不同品系，包该基因已回交到不同品系，包括：括：NIH-nu/nu、BALB/c-nu/nu、C3H-nu/nu、C57BL/6-nu/nu。第八页，讲稿共七十页哦具有纯合裸基因（具有纯合裸基因（nu/nu)的小鼠主要的的小鼠主要的缺陷特征缺陷特征：v1、毛发生长发育异常，表现为全身形似无毛发生长发育异常，
5、表现为全身形似无毛，呈裸体外表；毛，呈裸体外表；v2、无胸腺，仅有胸腺残迹或异常的胸腺上无胸腺，仅有胸腺残迹或异常的胸腺上皮，这种上皮不能使皮，这种上皮不能使T细胞正常分化，缺乏细胞正常分化，缺乏成熟成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞免疫力低下，不能执行正常细胞免疫力低下，不能执行正常T细胞功能。细胞功能。第九页，讲稿共七十页哦BALB/c-nu的胸腺的胸腺昆明小鼠的胸腺昆明小鼠的胸腺第十页，讲稿共七十页哦v3、裸小鼠的、裸小鼠的B细胞功能基本正常，成年细胞功能基本正常，成年裸小鼠（裸小鼠（68周龄）较普通鼠有较高水周龄）较普通鼠有较高水平的平的NK细胞
6、活性，但幼鼠（细胞活性，但幼鼠（34周龄）周龄）的的NK细胞活性低下，裸小鼠粒细胞数细胞活性低下，裸小鼠粒细胞数比普通小鼠低。比普通小鼠低。第十一页，讲稿共七十页哦v4、繁育能力差，乳腺发育缺损，以雄繁育能力差，乳腺发育缺损，以雄性纯合子与雌性杂合子繁育。性纯合子与雌性杂合子繁育。v5、T细胞缺陷可通过移植成熟细胞缺陷可通过移植成熟T细胞、细胞、胸腺细胞或正常胸腺上皮得到校正。胸腺细胞或正常胸腺上皮得到校正。第十二页，讲稿共七十页哦v裸鼠作为实验动物是一种奇迹，在研究人癌方面具有独一无二的特点，它是人癌研究的“活试管”，为人们研究肿瘤提供美妙的动物模型原来科学家们先用一种高分子材料做成“人耳”
7、的模型支架，然后让人体的软骨组织细胞在这个支架上繁殖生长。一周后，在裸鼠的背上割开一个口子，将培育过的这个“人耳”模子植入缝合，随着人体软骨细胞不断增殖，支架慢慢地被机体降解吸收，使“人耳”和裸鼠融为一体。当然，这个“人耳”的软骨组织来自人体，而“人耳”外的皮肤则来自裸鼠第十三页，讲稿共七十页哦裸小鼠（裸小鼠（Nudemice）裸大鼠裸大鼠(NudeRats)第十四页，讲稿共七十页哦2、裸大鼠（Nude rat）v裸大鼠的基因符号为裸大鼠的基因符号为rnu。纯合子裸大鼠纯合子裸大鼠（rnu/rnu），），一般特征似裸小鼠。一般特征似裸小鼠。发育迟缓，体重为正常大鼠的发育迟缓，体重为正常大鼠的7
8、0%。裸大鼠较裸小鼠对多种传染病更敏感。裸大鼠较裸小鼠对多种传染病更敏感。比裸小鼠更强壮、寿命更长。比裸小鼠更强壮、寿命更长。体型较大，可体型较大，可提供足够的血样、也可为各种研提供足够的血样、也可为各种研究提供足够的瘤组织及究提供足够的瘤组织及对大范围的外科手术方对大范围的外科手术方法较有利。法较有利。第十五页，讲稿共七十页哦v裸大鼠裸大鼠(NudeRats)v封闭群（封闭群（OutbredMice）来源：）来源：1979-1980年期间，含有裸基因的8个近交系大鼠(BN、MR、BUF、WN、ACI、WKY、M520、F344)在一系列交配之后育成了NIH裸大鼠。2001年CharlesRi
9、ver从NIH引入，命名为Crl:NIH-Foxn1rnu。该品系没有胸腺，缺乏T细胞，在胸腺外周淋巴器官的主要区域表现为细胞群体衰竭特征第十六页，讲稿共七十页哦3、性连锁免疫缺陷小鼠v性连锁免疫缺陷小鼠（Xlinkedimmunedeficiencymouse,XID)起源于CBA/N小鼠，v其B细胞功能缺陷，基因符号xid位于X性染色体上。v纯合子雌鼠（xid/xid）和杂合子雄鼠（xid/y)对非胸腺依赖性型抗原没有体液免疫反应，血清中IgM和IgG含量降低，其T细胞功能基本正常。v该模型是研究B淋巴细胞的发生、功能与异质性理想的动物。第十七页，讲稿共七十页哦4、Biege(bg)小鼠v
10、为NK细胞活性缺陷的突变系小鼠，隐性突变基因bg位于第13号染色体上。v目前常使用的主要为C57BL/6J系beige小鼠v纯合鼠被毛完整，但毛色变浅，耳廓和尾尖色素减少，出生时眼睛颜色很淡。v此小鼠表型特征与人的齐希二氏综合症（ChedianHigashisyndrome)相似。第十八页，讲稿共七十页哦5、严重联合免疫缺陷小鼠vSCID小鼠，是位于第小鼠，是位于第16号染色体的号染色体的scid单个隐性突变基因所导致。单个隐性突变基因所导致。v外观与正常小鼠无异，生长发育正常v胸腺、脾、淋巴结的重量一般为正常小鼠的30%，组织学上表现为淋巴细胞缺失。v所有T、B细胞功能测试均为阴性。第十九页
11、，讲稿共七十页哦vSCID是由SevereCombinedImmune-deficiency缩写而来，最早此一症状是1950年在人类的婴儿中发现。直到1983年才首次在首次在CB-17品系品系小鼠中发现SCID症状。vSCID的特征为丧失B与T淋巴球的功能，造成低免疫球蛋白血症，但不意味在SCID小鼠体内完全没有B与T淋巴球，应该说SCID小鼠体小鼠体中没有成熟的中没有成熟的B与与T淋巴球淋巴球，来足以担当有效的免疫功能。第二十页，讲稿共七十页哦vSCID小鼠巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、小鼠巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、红细胞等均呈正常状态，红细胞等均呈正常状态，NK细胞及淋巴细胞及淋巴激活因子
12、（激活因子（LAK）也呈正常。其外周血也呈正常。其外周血白细胞较少，淋巴细胞占白细胞总数的白细胞较少，淋巴细胞占白细胞总数的10%-20%，而正常小鼠应占约，而正常小鼠应占约70%。第二十一页，讲稿共七十页哦vSCID小鼠需要饲养于小鼠需要饲养于SPF屏障系统环境。屏障系统环境。vSCID小鼠的肿瘤移植率高，对白血病和小鼠的肿瘤移植率高，对白血病和恶性肿瘤不但转移率高，而且能广泛扩恶性肿瘤不但转移率高，而且能广泛扩散，与人体肿瘤生物学行为极为相似。散，与人体肿瘤生物学行为极为相似。第二十二页，讲稿共七十页哦vSCID小鼠的小鼠的Leaky现象现象：v在临床表现上，约有2-23%子代具有少量的淋
13、巴样细胞，并产生少量的免疫球蛋白的现象。v随着SCID小鼠年龄的增长与暴露于抗原刺激下，会增加其Leaky现象。v饲养在SPF环境中，借干净的环境、较少的抗原刺激，减缓Leaky现象出现，争取可供实验的时间。v在繁殖SCID小鼠时，监测血清IgM为一种有效的筛选种鼠的方式。第二十三页，讲稿共七十页哦SCIDhu小鼠小鼠v是科学家通过移植人免疫组织或免疫细是科学家通过移植人免疫组织或免疫细胞，使胞，使SCID小鼠具有了部分人类免疫系小鼠具有了部分人类免疫系统，称为统，称为SCIDhu小鼠。该小鼠用途也小鼠。该小鼠用途也十分广泛。目前已用于人类生理学、病十分广泛。目前已用于人类生理学、病理学、病毒
14、学、免疫学和血液学的研究。理学、病毒学、免疫学和血液学的研究。它也用于药物筛选和疫苗效应与安全性它也用于药物筛选和疫苗效应与安全性的试验。的试验。第二十四页，讲稿共七十页哦SCID小鼠小鼠SHOv无毛封闭群小鼠模型无毛封闭群小鼠模型SHO（SCID Hairless Outbred）vCrl:HA-Prkdcscid和Crl:SKH1-Hrhr杂交而成v美国CharlesRiverLab自2007年开始培育，在2008年得到了两条染色体上均带有SCID基因的无毛的SCID小鼠。v将人前列腺癌细胞株PC-3分别接种到SCID和SHO身上对比，研究发现，SHO除去具有与SCID小鼠相同的肿瘤生长特
15、性之外，还摒除了Nu/Nu裸鼠接种PC-3时出现的皮肤溃疡现象。第二十五页，讲稿共七十页哦SCIDBeigev专业名称：专业名称：CB17.B6-PrkdcscidLystbg/CrlVr近交系（近交系（InbredMice）v来源：来源：该品系为scid和beige常染色体隐性突变同类系小鼠v该品系由Croy等在Guelph大学通过C.B-17scid/scid和C57BL/6bg/bg小鼠的杂交得到v该品系B、T淋巴细胞功能缺失，同时自然杀伤细胞(NK细胞)功能低下1993年CharlesRiver引入该品系第二十六页，讲稿共七十页哦NODSCIDvJaksonLabv用非肥胖糖尿病小鼠N
16、OD/Lt与SCID小鼠杂交得到v降低了Nk细胞活性，杂交双突变小鼠NOD/Lt-SCID表达了NK细胞活性相对低的特性。第二十七页，讲稿共七十页哦Nu/Nu裸鼠v封闭群（封闭群（OutbredMice）v来源：来源：此免疫缺陷鼠来源于NIH开始被认为是BALB/c的同类系后来表明此鼠不是近交小鼠，并以远交方式保存下来此小鼠没有胸腺，是免疫缺陷鼠，不能产生T细胞第二十八页，讲稿共七十页哦国内常用免疫缺陷大小鼠对比国内常用免疫缺陷大小鼠对比第二十九页，讲稿共七十页哦v（1）BALB/c-nu来源于BALB/C小鼠基因突变v（2）Nu/Nu裸鼠（注意首字母大写）由NIH培育成功，是一个独立的品系v
17、（3）CD-1裸鼠，将nu基因导入CD-1小鼠获得该品系。vNu/Nu、CD-1裸鼠为封闭群，随机交配方式进行繁殖，后代基因纯合程度低，个体间差异大第三十页，讲稿共七十页哦第二节转基因动物v随着现代高新科学技术的发展，现代实验动物学已从随着现代高新科学技术的发展，现代实验动物学已从过去注重于动物饲养管理和实验操作的宏观向微观过去注重于动物饲养管理和实验操作的宏观向微观方向发展。方向发展。v对小鼠基因组研究的目的不仅在于了解小鼠本身的对小鼠基因组研究的目的不仅在于了解小鼠本身的基因结构，更主要的是为人类基因组研究、人类遗基因结构，更主要的是为人类基因组研究、人类遗传疾病研究提供动物模型。传疾病研
18、究提供动物模型。第三十一页，讲稿共七十页哦一、基本概念v转基因动物（转基因动物（Transgenic animal）:是指以实验方是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。能遗传给后代的一类动物。v外源基因随细胞分裂分配到外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞所有子细胞中并遗传给中并遗传给后代后代v严格说，转基因动物有别于嵌合体。严格说，转基因动物有别于嵌合体。v基本原理基本原理:目的基因或基因组片段目的基因或基因组片段 受精卵或着床前胚胎细受精卵或着床前胚胎细胞胞 受体动物的输卵管或子宫中受体动物的输卵管或子宫中
19、携带有外源基因携带有外源基因的转基因动物的转基因动物第三十二页，讲稿共七十页哦v嵌合体动物：嵌合体动物：只有部分组织细胞整合有外源基因的动物，称嵌合体动物嵌合体动物。v基本原理：vA动物的ES细胞B动物动物的囊胚代孕鼠的子宫生产出嵌合体动物v与杂合体的区别与杂合体的区别，杂合体是由来自不同的物种的两个配子形成的，如骡子是驴与马结合创造的一个杂合体，而不是嵌合体。v马（2n=64）驴（2n=62)第三十三页，讲稿共七十页哦克隆动物（clone）v概念概念：指动物通过体细胞进行的无性生殖以及由无性生殖形成的基因型几乎完全相同的后代个体组成的群体。v原理原理第三十四页，讲稿共七十页哦v1982年年第
20、一只转基因小鼠第一只转基因小鼠vRichard Palmiter和Ralph Brinster领导的一个小组将一个能够被锌调控的DNA元件与大鼠的生长激素基因连在一起，并将其注射到了受精了的小鼠胚胎中，从而培育出了第一批转基因小鼠第一批转基因小鼠。这些转基因小鼠长期取食含有足量锌的食物后，就会长得非常大。转基因小鼠的出现掀起了遗传学研究的新的浪潮。第三十五页，讲稿共七十页哦v1983年年PCRvKaryMullis发明了聚合酶链式反应（PCR），这是一种能够极其快速的获得特定DNA片段的方法。目前PCR已成了生物学实验室中的不可缺少的常规技术，在全世界都被广泛使用。Millis因这项了不起的发
21、明获得了1993年的诺贝尔奖。第三十六页，讲稿共七十页哦v1987-89年年第一只基因敲除小鼠第一只基因敲除小鼠vMartin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几个研究小组对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。第一只基因敲除小鼠。这三位科学家因为这项工作在2001获得了Lasker奖。接下来，科学家们用同样的技术又培育出了几千只基因敲除小鼠。于。于20072007年获诺贝尔奖。年获诺贝尔奖。第三十七页，讲稿共七十页哦v1998年年第一只克隆鼠第一只克隆鼠v在1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出了第一
22、批克隆鼠克隆鼠“Cumulina”和她的姐妹们。第三十八页，讲稿共七十页哦v1999年年-小鼠基因组测序协会小鼠基因组测序协会v在1990年人类基因组计划启动之初，该计划就将小鼠列为了必须进行测序的五个重要的模式生物之一。1999年，人类基因组三个主要测序中心成立了一个相互协作的小鼠基因组测序机构，取名为小鼠基因组测序协会（MGSC）。小鼠基因组测序项目正式启动，到2002年，MGSC已经发展到了拥有6个国家的26个研究机构。第三十九页，讲稿共七十页哦v2001年年2月月-人类基因组人类基因组v在人类基因组计划正式启动之后的第十一年，人类基因组的第一张测序草图完成并公布于众。v同时发表的人类基
23、因组草图有两份，一份由公共基金资助的国际人类基因组测序协会完成，发表在Nature上，另一份由CraigVenter领导的一家美国私人测序公司CeleraGenomics完成，发表在Science上。第四十页，讲稿共七十页哦v2001年年6月月-散弹法散弹法v美国公司CeleraGenomics使用散弹法测得了用于销售的小鼠序列草图。v散弹法是一种一次性测得基因组全序列的技术。签订一份三年的合同后，私人客户只用45000美元就可以得到5倍覆盖率的小鼠基因组序列数据。vCelera公司的序列基于四个小鼠株系，其中包括了DBA株系，但不包括公共基金项目已经在测的C57BL/6J株系。第四十一页，讲
24、稿共七十页哦v2002年年5月月16号染色体号染色体vRichardMural等人对Celera公司测得的小鼠16号染色体序列作了分析，并将结果发表在Science上。他们发现该染色体上有一大段区域与已被分析的人类21号染色体序列高度相似。第四十二页，讲稿共七十页哦v2002年年8月月小鼠基因组物理图谱小鼠基因组物理图谱v一个国际协会提供了通过构建基因组物理图谱来详细确定DNA序列的框架。小鼠和人类间大量序列的相似性使得解码小鼠序列变得相对容易；反过来，小鼠的图谱也能用来填补人类基因组序列中存在的空缺。第四十三页，讲稿共七十页哦v2002年年12月月小鼠基因组小鼠基因组v小鼠基因组测序协会发表
25、了一份高质量的小鼠基因组序列草图，同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个基因组大小约为2.5Gb，比人类基因组要小，预计的基因也少于30000个。约有40%的小鼠和人类基因组序列相高度似性，80%的人类基因在小鼠基因组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组成的其它方面做了详细讨论。在日本RIKEN基因组科学实验室的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。第四十四页，讲稿共七十页哦v转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动，它将对整个生命科学产生全局性影响。因此转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体
26、细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展史上126年中第14个转折点。第四十五页，讲稿共七十页哦二、命名1符号符号(1)一个转基因符号由以下三部分组成：vTgX (YYYYYY)Zzz，vTgX=方式；v(YYYYYY)=插入片段标示；v=实验室指定序号；vZzz=实验室注册代号；第四十六页，讲稿共七十页哦(2)方式方式TgX 转基因符号通常冠以Tg字头。随后的一个字母X，表示DNA插入的方式：H 代表同源重组；R 代表经过逆转录病毒载体感染的插入；N 代表非同源插入。第四十七页，讲稿共七十页哦（3）插入片段标示）插入片段标示(YYYYYY)是由研究者确定的表明插入基因显著特征的符
27、号。通常由放在圆括号内的字符组成：可以是字母（大写或小写），也可由字母与数字组合而成，不用斜体字，上下标、空格及标点等符号。第四十八页，讲稿共七十页哦v应注意以下几点：应注意以下几点：v1）标示应简短，一般不超过六个字符。v2）如果插入序列源于已经命名的基因，应尽量在插入标示中使用基因的标准命名或缩写，但基因符号中的连字符应省去。v3）插入片段标示只表示插入的序列，并不表明其插入的位置或表型。第四十九页，讲稿共七十页哦v一些标示的标准命名缩写：An 匿名序列；Ge 基因组；Im 插入突变；Nc 非编码序列；Rp 报告基因；Sn 合成序列；Et 增强子捕获装置；Pt 启动子捕获装置。第五十页，讲
28、稿共七十页哦v（4）实验室指定序号及实验室注册代号）实验室指定序号及实验室注册代号v实验室指定序号：实验室指定序号：是由实验室对已成功的转基因系给予的特定编号，最多不超过5位数字。而且，插入片段标示的字符与实验室指定序号的数字位数之和不能超过11。v实验室注册代号：实验室注册代号：是对从事转基因动物研究生产的实验室给予的特定符号。第五十一页，讲稿共七十页哦2.举例举例 C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23 Jwg：来源于美国杰克逊实验室（J）的C57BL/6品系小鼠被转入人的CD8基因组（Ge）；转基因在Jon W.Gordon(Jwg)实验室完成，获取于一系列显微注射后得到的序号为23
29、的小鼠。转基因符号缩写转基因符号缩写:C57BL6J-TgN23Jwg第五十二页，讲稿共七十页哦vTgN(GPDHIm)1Birv以人的甘油磷酸脱氢酶基因（GPDH）插入（C57BL/6J X SJL/J）F1代代雌鼠的受精卵中，并引起插入突变（Im），这是Edward H.Birkenmeier(Bir)实验室命名的第一只转基因小鼠。v根据转基因动物命名原则，如果转基因动物的遗传背景由不同近交系或远交群混合而成时，该转基因符号不使用动物品系或种群的名称。v缩写：TgN1Bir第五十三页，讲稿共七十页哦三、遗传修饰动物模型的建立方法v1、转基因技术转基因技术：目的基因整合受精卵（或胚胎干细胞）
30、导入受体子宫发育成含目的基因的个体，此个体能把目的基因遗传下去。v2、核移植技术核移植技术:又称动物整体克隆技术。将一个体细胞的核导入另一个体的去核卵细胞中，使之发育成个体。v3、基因剔除技术基因剔除技术：又称基因靶向灭活。指有目的地去除动物体内某种基因的技术。基本原理是同源重组技术。第五十四页，讲稿共七十页哦导入基因的主要方式v显微注射法vES细胞法v电穿孔v脂质体v逆转录病毒感染法v精子载体导入法等第五十五页，讲稿共七十页哦（一）雄原核显微注射法（一）雄原核显微注射法以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体术将构建好的载体DNA直接注射入
31、受精卵的直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。目前应用较广泛，最早最经典的方法。第五十六页，讲稿共七十页哦v一、设计转基因构件设计转基因构件1、目的基因的获取 2、基因载体（复制子）的选择与构建 3、目的基因与载体的连接（连接酶）：重组DNA 分子v二、动物操作动物操作 1、准备假孕母鼠（养母）2、受精卵的准备 3、基因导入 4、胚胎移植 5、对幼鼠的鉴定 第五十七页，讲稿共七十页哦转基因工作需要的动物v1、需要的野生型小鼠类型包括：v幼
32、龄雌鼠（21-28天）用作胚胎供体；v成年雄鼠；v成年雌鼠，作为胚胎移植的受体；v输精管结扎的雄鼠，用来产生假孕雌鼠；v青年野生型雄鼠和雌鼠，与转基因鼠交配，建立转基因品系。v2、从胚胎移植到成年小鼠总计约11周的时间v胚胎移植约19天幼鼠约21天断乳小鼠约4-5周成年小鼠约19天幼鼠。第五十八页，讲稿共七十页哦原原核核注注射射法法制制备备转转基基因因鼠鼠技技术术路路线线第五十九页，讲稿共七十页哦第六十页，讲稿共七十页哦第六十一页，讲稿共七十页哦第六十二页，讲稿共七十页哦优点：优点：v外源外源DNA大小基本不受限制（大小基本不受限制（1-50kb）；导入）；导入过程直观；过程直观；v整合率高整
33、合率高缺点：缺点：v设备昂贵、环节较多设备昂贵、环节较多v对操作人员有较高的技术要求对操作人员有较高的技术要求v低效率（尤其是大家畜）低效率（尤其是大家畜）v对卵子伤害大，胚胎存活率低对卵子伤害大，胚胎存活率低v基因整合随机性基因整合随机性v转基因沉默转基因沉默第六十三页，讲稿共七十页哦（二）胚胎干细胞（二）胚胎干细胞（ES细胞）法细胞）法ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的
34、功能状态。在在ES细胞上的基因操作细胞上的基因操作：可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。第六十四页，讲稿共七十页哦优点：优点：v外源基因整合情况的可控性高。v可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。v外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。缺点：缺点：vES细胞系建立及培养困难v维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易v所得个体为嵌合体第六十五页，讲稿共七十页哦（三）完全基因剔除转基因动物（三）完全基因剔除转基因动物v完全基因剔除完全基因剔除(entirely knock-out)：又称基因敲除、基因打靶
35、，指应用一段与胚胎干细胞染色体上的一段序列具有高度同源性的灭活外源DNA，通过同源重组取代原有目的基因，使靶基因在动物个体中的活性完全消除，来观察靶基因失活、不表达的情况下会对动物个体产生哪些影响。v基本原理：基本原理：v灭活基因 电穿孔 体外ES细胞 同源重组，筛选 基因定点灭活的细胞 显微注射 小鼠囊胚 胚胎移植 假孕鼠子宫内 发育 嵌合体小鼠 选择培育 基因剔除小鼠 第六十六页，讲稿共七十页哦基基因因剔剔除除的的技技术术路路线线第六十七页，讲稿共七十页哦v转基因动物技术使动物和人体基因工程研究从以往的单基因离体水平的操作，发展到了离体和在体相配合的、分子和细胞水平操作的，有动物整体水平产
36、生效应的崭新阶段，它使得人们能从更完整的系统中去认识生物分子的作用，应用前景广阔。第六十八页，讲稿共七十页哦v转基因动物研究的意义和作用：v1、生命现象的基础研究生命现象的基础研究。转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具，如研究基因的结构与功能的关系，细胞发育的潜能性、细胞核与细胞质的相互关系、胚胎发育调控、肿瘤、神经与发育等。v2、可以用来建立多种动物模型建立多种动物模型，进而研究这些疾病的发病机理、治疗方法及新药的筛选。第六十九页，讲稿共七十页哦v3、可作为医用或食用蛋白的生物反应可作为医用或食用蛋白的生物反应器。器。通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白，一直是转基因动物研究的热点。现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达，这些蛋白可以用于治疗人类相关疾病。v4、利用基因敲除技术提供廉价的异种利用基因敲除技术提供廉价的异种移植器官移植器官。只要将引起强烈免疫排斥反应的异源分子基因敲除掉就可以。例如培育不含免疫排斥的转基因克隆猪。第七十页，讲稿共七十页哦