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1、关于关于总提取及免疫提取及免疫组化化现在学习的是第1页，共49页一、真核细胞的总一、真核细胞的总RNA 1、mRNA:1-5%2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大大亚亚基基60S:28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小小亚亚基基40S:18S=1874nt现在学习的是第2页，共49页二、二、RNA提取的注意事项提取的注意事项 RNARNA酶酶酶酶：广泛存在：灰：广泛存在：灰尘尘、人体唾液、人体唾液、实验实验器材表面。器材表面。生物活性非常生物活性非常稳稳定：耐定：耐热热、耐酸、耐碱。、耐酸、耐碱。1、尽量避免尽量避免外外源性源性RNase 污污染染
2、A.操作操作环环境空气境空气洁净洁净。带带手套、口罩。手套、口罩。B.用新开封的化学用新开封的化学试剂试剂。（。（试剂应该专试剂应该专用）用）C.一次性塑料器材最好是新开封，一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水水处处理后）高理后）高压灭压灭菌。菌。D.玻璃器材、水都玻璃器材、水都应该经过应该经过去去RNase 处处理。理。对对玻璃器材玻璃器材还应该进还应该进行高温烘烤。行高温烘烤。2、抑制、抑制内内源性源性RNase 活性：活性：RNase 抑制抑制剂剂。RNA分离的关键因素：避免分离的关键因素：避免RNA酶的污染。酶的污染。现在学习的是第3页，共49页1)1)样品处理：样品处理：（）培养
3、细胞：收获细胞（）培养细胞：收获细胞 1-510 7 1-510 7，移入，移入 1.5ml 1.5ml 离心管中，加入离心管中，加入 1ml Trizol 1ml Trizol，混匀，室温，混匀，室温静置静置 1010min min。（）组织：取（）组织：取 50-100mg 50-100mg 组织（新鲜或组织（新鲜或-70 -70 及液及液氮中保存的组织均可）置氮中保存的组织均可）置 1.5ml 1.5ml 离心管中，加入离心管中，加入 1ml 1ml Trizol Trizol 充分匀浆，室温静置充分匀浆，室温静置1010 min min。三、三、RNA提取的实验操作提取的实验操作 现在
4、学习的是第4页，共49页2 2)加入加入200 200 l l氯仿氯仿氯仿氯仿，震荡混匀震荡混匀20-30s20-30s，室温放置室温放置5min5min（此期间液体开始（此期间液体开始分层分层分层分层，此时不此时不要轻易搅动液体要轻易搅动液体）。）。3 3)10000 rpm)10000 rpm，离心，离心5min5min。RNA(清澈透明清澈透明)DNAProtein4 4)将清澈透明的将清澈透明的上上层水相层水相层水相层水相 转移至另一离心管中。转移至另一离心管中。三、三、RNA提取的实验操作提取的实验操作 现在学习的是第5页，共49页5 5)沉淀沉淀RNARNA：加入加入0.5ml0.
5、5ml异丙醇异丙醇异丙醇异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置，上下颠倒混匀，室温放置10min10min。10000rpm 10000rpm，离心，离心10min10min。弃上清。弃上清。6 6)加加1ml1ml 75%75%乙醇乙醇洗涤管壁。洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)7 7)7500rpm)7500rpm离心离心1min1min，弃上清。，弃上清。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。用用TriZol试剂提取总试剂提取总RNA时，全程均在时，全程均在室温室温进行。进行
6、。当当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在沉淀用水溶解后，应该注意在冰上冰上操作，操作要迅速。操作，操作要迅速。现在学习的是第6页，共49页8 8)室温干燥室温干燥3 35min5min。（干燥的时间由（干燥的时间由RNARNA沉淀大小决定）沉淀大小决定）（干干燥燥后后的的沉沉淀淀应应该该是是无无无无色色色色胶胶胶胶样样样样透透透透明明明明状状状状，沉沉淀淀要要充充分分干干燥燥但避免过分干燥，此步骤非常关键但避免过分干燥，此步骤非常关键）注意事项注意事项：RNA:避免放在避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无法溶解。孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容沉淀必须绝对干燥
7、，微量乙醇残留，容易造成易造成RT的失败，但过分干燥又是造成的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶不溶解的主要原因解的主要原因。判断判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥是逆转录成功的关键环节。RNA pellet：透明胶样：透明胶样干燥后应该无色透明干燥后应该无色透明现在学习的是第7页，共49页9 9）RNARNA的的溶溶解解：用用加加样样器器吸吸取取冰冰冷冷DEPC-HDEPC-H2 2O O 20-3020-30 l l，加加到到RNARNA上上，反反复复吹打溶解吹打溶解RNARNA沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNARNA应置冰上保存
8、应置冰上保存。1010)吸出吸出 2-32-3 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用(将用于将用于电泳电泳)。1111)剩余溶液放到冰上备用剩余溶液放到冰上备用 （将用于（将用于RTRTPCRPCR）。）。v注意：注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，沉淀的溶解一定要耐心充分，一定一定要用加要用加样样器器反复反复多次吹打方可。但由多次吹打方可。但由于溶液体于溶液体积积非常小，要避免出非常小，要避免出现现气泡影响气泡影响RNA的溶解。的溶解。避免气泡的方法：避免气泡的方法：用加样器的第一挡用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：判断溶解程度：吹打时液体流动不拐
9、弯为吹打时液体流动不拐弯为止。止。现在学习的是第8页，共49页 将将 RNA 进进行行 1%琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳 9 l RNA 样样品品 23 l 上上样样液液轻轻轻轻混匀，混匀，上上样样 电电泳泳:120伏，伏，1020分分钟钟 注意注意:电电泳槽的清泳槽的清洁洁及新的及新的电电泳液！泳液！琼琼脂糖凝胶要新脂糖凝胶要新鲜鲜配制！配制！紫外透射紫外透射仪观仪观察察电电泳泳结结果果现在学习的是第9页，共49页RNA电电泳泳结结果果 rRNA可以作可以作为为内部内部Marker分子，通分子，通过观过观察察rRNA的两条的两条带带（28S和和18S）的比例，可以判断所提取）的比例，可以判断
10、所提取mRNA是是否存在降解。否存在降解。RNA电电泳并不能判断泳并不能判断mRNA是否是否提取成功，也不作提取成功，也不作为鉴为鉴定定RNA提取提取质质量的常量的常规规方法，因方法，因为为在在电电泳泳过过程程中中RNA可能可能发发生降解生降解。现在学习的是第10页，共49页RNA纯度的判断 280、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白等有机物的值 A260/A280 1.82.0 1.8表明有蛋白质、苯酚的污染 2.2表明RNA已经水解成单核酸 A260/A230 2.0 2.0表明酚盐离子，硫氰酸盐或其他有机化合物污染现在学习的是第11页，共49页免疫组化的原理及流程介
11、绍免疫组化的原理及流程介绍2015-07-21现在学习的是第12页，共49页主要内容主要内容免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一.免疫组化的原理免疫组化的原理二二.免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程三三.免疫组化的结果分析免疫组化的结果分析现在学习的是第13页，共49页免疫组化的原理免疫组化的原理 应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍现在学习的是第14页，共49页直接法直接法Tissue Antig
12、enLabeled Antibodyq将荧光、酶直接标记在一抗上优点：q简单方便缺点：q灵敏度低q每种一抗都需要进行标记 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍直接法直接法现在学习的是第15页，共49页间接法间接法Tissue AntigenPrimary AntibodySecondary Antibodyr将荧光、酶等标记在二抗上优点：r灵敏度高r只需要少数标记的二抗可以和相应的一抗反应 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍间接法间接法现在学习的是第16页，共49页免疫组化SP法SPSP法法-链霉素抗生物素蛋白链霉素抗生物素蛋白-过氧化物过氧化物酶法酶法（streptavid
13、in-peroxidase）l一抗一抗l生物素标记的二抗生物素标记的二抗lStreptavidin-HRPStreptavidin-HRP（HRPHRP标记的链霉亲和素）标记的链霉亲和素）简化实验步骤减少非特异性背景免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化SP法现在学习的是第17页，共49页 ABC ABC法法(Avidin Biotin-peroxidase Complex)l一抗一抗l生物素标记的二抗生物素标记的二抗lAvidin-Biotin-HRP ComplexAvidin-Biotin-HRP Complex（亲和素（亲和素-HRP-HRP标记的生物素）标记的生物素）v
14、亲和素与HRP标记的生物素混合，放置30分钟。v一个亲和素分子具有可与生物素结合的四个部位。v大大增加了结合到生物素上的过氧化物酶，提高了显色反应的 灵敏度。免疫组化ABC法免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化ABC法现在学习的是第18页，共49页三三 免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.3.抗原修复、暴露抗原修复、暴露抗原决定簇抗原决定簇 4.4.封闭非特异性蛋封闭非特异性蛋白白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反应反应 8.
15、8.显色显色 9.9.复染、脱水、透复染、脱水、透明、封片明、封片 2.2.细胞通透、封闭内细胞通透、封闭内源性过氧化物酶源性过氧化物酶 现在学习的是第19页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化 脱蜡与水化的脱蜡与水化的目的目的是确保抗体等其他试是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。不全，而产生非特异性背景着色。现在学习的是第20页，共49页1)60 20 minXylene：2 10 m
16、inutes；2)100%absolute ethanol：2 5 minutes；3)95%ethanol 2 minutes；4)80%ethanol 2 minutes；5)70%ethanol 2 minutes；6)distilled water:5 min；7)PBS 洗 3 3 min。具具体体操操作作现在学习的是第21页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍2.2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的是使抗体能够充分地进入胞内进目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用行结合反应。一般用Triton X-100Triton X-
17、100、蛋白酶、蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)细胞通透细胞通透现在学习的是第22页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(2)(2)封闭内源性过氧化酶封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧化物其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的酶的活性。在传统的ABCABC法和法和SPSP法中，法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。进行灭活。现在学习的是第23页，共49页1)1)用封闭通透液浸润切片用封闭通透液浸润切片 30 min 30 min（RT R
18、T 避光）。避光）。其配法是用预热其配法是用预热 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul TritonX-120ul TritonX-100 100 加热几分钟，在临用前加加热几分钟，在临用前加 400 ul 400 ul的的3030H H2 2O O2 2。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作具体操作:现在学习的是第24页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3.3.抗原修复抗原修复 暴露抗原决定簇暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚由于组织中部分抗原在甲醛或多聚
19、甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。重新暴露，提高抗原检测率。现在学习的是第25页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般分常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复。抗原修复的主要方法抗原修复的主要方法:酶消化方法酶消化方法一般用于细一般用于细胞内抗原胞内抗原应用高频电磁波打应用高频电磁波打开蛋白质间
20、的交联开蛋白质间的交联键键现在学习的是第26页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍将将切切片片放放入入 0.01 0.01 M M 柠柠檬檬酸酸钠钠缓缓冲冲 溶溶液液（pH6.0pH6.0）后后，在在微微波波炉炉里里高高火火 4 4 min min 至至沸沸腾腾后后，取取出出，冷冷却却至至室室温温，再再加加热热，约约4 4次，每次间隔补足液体，防止干片。次，每次间隔补足液体，防止干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。具体操作（微波修复）：具体操作（微波修复）：1)现在学习的是第27页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍
21、4.4.封闭特异性蛋白封闭特异性蛋白组织切片上有些组织切片上有些剩余剩余的位点可以与一抗的位点可以与一抗非非特异性结合特异性结合，造成后续结果的，造成后续结果的假阳性假阳性。封封闭闭血血清清一一般般是是和和二二抗抗同同一一来来源源的的，血血清清中中有有一一些些动动物物自自身身的的抗抗体体，预预先先能能和和组组织织中中有有交叉反应的位点发生结合。交叉反应的位点发生结合。现在学习的是第28页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 将切片取出将切片取出,周围水分用滤纸吸干周围水分用滤纸吸干,用组化笔在用组化笔在组织周围画上圈组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入在圆圈内组织滴入 5%5%羊
22、血清（与羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中二抗来源一致）后放入湿盒中,室温室温(约约30)30)下下101030min30min。具体操作：具体操作：大一点现在学习的是第29页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗:可以特异结合底物，就是识别出我可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。用肉眼是看不出来的。现在学习的是第30页，共49页 一一抗抗孵孵育育条条件件在在免免疫疫组组化化反反应应中中最最重重要要，包括孵育时间和抗体浓度。包括孵育时间和抗体浓度。一一抗抗孵孵
23、育育温温度度有有几几种种：4 4度度、室室温温、3737度度，其其中中4 4度度效效果果最最佳佳；孵孵育育时时间间：这这与与温温度度、抗抗体体浓浓度度有有关关，一一般般3737度度1-2h1-2h，然然后后4 4度度过过夜夜和和从从冰冰箱箱拿拿出出后后3737度复温度复温45min45min。具体条件还要摸索。具体条件还要摸索。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；防止脱片；2.使抗原抗使抗原抗体结合更稳定。体结合更稳定。现在学习的是第31页，共49页 甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（留血清，直接加
24、入已稀释的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入湿盒中室温）后，放入湿盒中室温 1 1 小时，然后小时，然后 4 4 度度过夜，冰箱中取出后需过夜，冰箱中取出后需37 37 复温复温 45 min 45 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体做法：具体做法：现在学习的是第32页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记测出的标记(如带荧光、放射性、化学发如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。光或显色基团），作用是检
25、测一抗。现在学习的是第33页，共49页 二二抗抗孵孵育育条条件件：二二抗抗一一般般室室温温或或3737度度30min-30min-1h1h，具体时间需要摸索。，具体时间需要摸索。但但在在免免疫疫组组化化中中我我们们一一般般先先把把二二抗抗浓浓度度和和孵孵育育时时间间先先定定下下，然然后后去去摸摸索索一一抗抗浓浓度度和和孵孵育育时间。时间。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍现在学习的是第34页，共49页 1)1)将一抗倒掉并用将一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5 min5 5 min5 次；次；2)2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放
26、入释的二抗后放入 37 37恒温烤箱中恒温烤箱中 30 min。3)3)用用 PBS PBS 洗洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作：具体操作：现在学习的是第35页，共49页7.SP7.SP反应反应 SP SP染色法即链霉素抗生物素蛋白染色法即链霉素抗生物素蛋白 生生物素过氧化酶连接法。物素过氧化酶连接法。该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良，使法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合再结合POPO基。基。现在学习的是第36页，共49页 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原
27、理及流程介绍1 1）加加入入 SP SP 复复合合液液后后放放入入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。2 2）用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5 min。具体操作：具体操作：SPSP染色法的特点染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。灵敏特异性低，成本低。现在学习的是第37页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍8.8.显色显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所形成在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观用，
28、是复合物显色，有利于显微镜下观察察。现在学习的是第38页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（通常在过氧化物酶（HRPHRP）法中，显色剂）法中，显色剂为为DABDAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液二氨基联苯胺显色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法现在学习的是第39页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍9 9、复染、脱水、透明、封片、复染、脱水、透明、封片 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用
29、的试剂为苏木素。对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。洗，在放入氨水中返蓝即可。现在学习的是第40页，共49页1)1)用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用双蒸水洗后，用双蒸水洗 5 min 5 min；加一；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染染 20 s 20 s），自来水冲洗，双蒸水洗），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min 5 mi
30、n，再用，再用 PBS PBS 返蓝返蓝 5 min 5 min。2)2)脱水脱水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absolute ethanol:(1-2)min；100%absolute ethanol:(1-2)min。3)3)透明：透明：Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min 4)4)封片：中性树胶。封片：中性树胶。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍现在学习的是第41页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍
31、四四 免疫组化结果分析免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。现在学习的是第42页，共49页免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1阳性染色特点阳性染色特点 AgAg定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色有结构性。（非特异性染色 细胞与组织细胞与组织无区别）无区别）染色强度不同：颜色深浅不一（非特染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色异性染色 弥散性均匀）。弥散性均匀）。须从
32、以下几个方面综合评价：须从以下几个方面综合评价：现在学习的是第43页，共49页 2 2组织切片制作过程的影响组织切片制作过程的影响 固定不良固定不良非特异性染色，显示不均。非特异性染色，显示不均。边边缘缘干干燥燥非非特特异异性性染染色色（常常见见），加加抗抗体时勿干片。体时勿干片。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3 3人工假象与特异性结果显示不在同一人工假象与特异性结果显示不在同一 平平面上。面上。现在学习的是第44页，共49页1.1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。染色的位置。2.2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖切
33、片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止液前甩干洗涤液，但又防止干片干片 。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍注意事项：注意事项：现在学习的是第45页，共49页3.3.以下原因可能导致片子着色不均匀：以下原因可能导致片子着色不均匀：脱蜡不充分。可以脱蜡不充分。可以 60 60 烤烤 20 min 20 min，立即放入新鲜的，立即放入新鲜的 二甲苯二甲苯中；中；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；二抗等试剂；抗体孵育时
34、，切片放倾斜；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育后抗体孵育后 PBS PBS 冲洗不充分。冲洗不充分。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍现在学习的是第46页，共49页5.PBS5.PBS的的PHPH和离子强度的使用。和离子强度的使用。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍建议建议PH在在7.4-7.6浓度是浓度是0.01M。中中性性及及弱弱硷硷性性条条件件（PH7-8PH7-8）有有利利于于免免疫疫复复合合物物的的形形成成，而而酸酸性性条条件件则则有有利利于于分分解解；低低离离子子强强度度有有利利于于免免疫疫复复合合物物的的形形成成，而而高高离子强度则有利于分解。离子强度则有利于分解。现在学习的是第47页，共49页4.4.一抗的清洗：一抗的清洗：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（1 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；洗方式；（3 3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。合的物质。现在学习的是第48页，共49页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第49页，共49页