植物组织培养教材.docx

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1、编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第31页 共31页第一章 植物组织培养的应用植物组织培养可应用于以下几个方面 ：1挽救濒于灭绝的植物；2快速繁殖稀有植物或有较大经济价值的植物；3、生产脱毒苗；4、利用组织培养的材料作为植物生物反应器；多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产；可不再依附于自然环境，不仅可以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系，来提高其药用价值。如用培养的人参悬浮细胞来生产人参皂苷。利用培养的植物细胞和组织作为生物反应器，也可生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等。5、组织培养结合超低温可经

2、济有效地保存植物种质资源 6、组织培养是转基因技术不可或缺的组成部分；7、作物育种（1）单倍体育种：采用花药培养可缩短杂合体纯化所需的时间，节省土地，假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同，通过花药培养，在理论上只要有2n个F1代花粉植株，就有可能得到一个所需要的基因组合，而传统育种方法，则至少要有4n个F1植株才能得到一个所需要的基因组合。（2）在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合有可能克服受精前障碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。（3）通过细胞培养，在细胞水平上进行突变体选择，可在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化，从而提高选

3、择效率，节省时间和土地面积。 （4）体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源。 8、用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子，为稀有和珍贵物种的繁殖提供了一种高效的手段。9、用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、胚胎学、基因工程、植物发育等的基础研究。10、试管花第二章 植物组织培养的发展简史一、 探索阶段(20世纪初至20世纪30年代中) 20世纪初，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可不断分割，直至分到单个细胞的观点，并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。Haberlandt首次进行了离体细胞培养的实验，在1902年发表的“植物离体细胞培养实验”报告中

4、，提出了胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法等科学的预见。 1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。Laibach(1925，1929)把由亚麻种间杂交形成的不能成活的胚剖出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功。1934年，White成功离体培养了番茄的根尖。 二、 奠基阶段(20世纪30年代中至50年代末) 1、White（1934年）在番茄根培养实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。他后来(1937)用3

5、种B族维生素（吡哆醇、硫胺素和烟酸），取代酵母浸出液获得成功。认识了B族维生素对植物生长的重要意义。2、Gautheret(1934)在山毛柳等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，形成层组织的生长才能显著增加。1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜，也建立了类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautheret、White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。3、Skoog(1944

6、)以及Skoog和崔澂等(1951)发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。 4、1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。 5、1953-1954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。把万寿菊和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，形成了由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液。Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎的愈伤组织中分离得到单细胞，把它们置于一张铺在愈伤组织上面的

7、滤纸上培养，使细胞发生了分裂。 6、1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并把它定名为激动素(kinetin)。7、1957年，Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数。8、1958年，Steward等以胡萝卜为材料，首次通过实验证实了Haberlandt关于细胞全能性的设想，成为了植物组织培养研究历史中的一个里程碑。9、1958-1959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。 三、迅速发展阶段(20世纪60年代至现在) 1、

8、基础研究： 1965年，Vasil和Hildebrandt用一种化学成分确定的培养基，由分隔培养的烟草单细胞获得了完整的再生植株，进一步证实了植物细胞的全能性 。2、原生质体培养取得重大突破： 1960年Cocking等用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971年，Takebe等首次获得了烟草原生质体再生植株。1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。3、花药培养取得显著成绩： 1964年，Guha和Maheshwari报道，在毛曼陀罗中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。 1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟

9、草植株。 4、微繁技术得到广泛应用 1960年，Morel建立了一个离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业” 。第三章 植物组织培养有关的基本概念一、植物细胞全能性(totipotency) 细胞全能性:指一个活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整植株。从理论上讲，只要是一个活的细胞，都有再生出一个完整植株的潜力，但实际情况并非如此简单。就目前所知，细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关，就是说细胞分化程度越高其再生能力越低，所

10、以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的实验材料。 二、细胞分化、脱分化与再分化 细胞分化分生性细胞在形态结构和功能上发生永久性(不可逆转性)适度变化的过程。脱分化由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团（即愈伤组织）的过程。 再分化由无分化的愈伤组织细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，构成一个完整的植物体或植物器官的过程。 三、器官发生 器官发生由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽(或根)，再在另一种培养基上产生根(或芽)，形成一个完整植株。第四章 植物组织培养所需的基本设备与条件一个理想的植物组织培养室应包括：1、化学药品室；2、培养基配制室；3、

11、灭菌室；4、接种室；5、培养室；6、培养物的检测和观察记录室。 一、化学药品室 应配置几个药品橱、实验台、万分之一和百分之一的电子天平。室内还应放一台大容量的冰箱，用来分门别类地保存激素、抗生素和各种需低温保存的物品。组织培养所需主要药品的存放要求如下： 1、可室温存放的药品：无机物、蔗糖、 盐酸、氢氧化钠，95酒精，琼脂。 2、宜于零上低温存放的化学药品: 有机物、激素3、应当在一20下保存的药品： 液体抗生素等。 二、培养基配制室 需要大于40m2的一个房间或更大些，为了方便起见可将房间分为两个区:一是玻璃器皿的清洗、消毒、干燥区：二是培养基配制区：应有大型实验台若干个，还应配备常温冰箱一

12、台，电炉(1000W，2000W)，微波炉，放置移液管、微量移液器的架子，酸度计等。 三、灭 菌 室 灭菌室面积可小一些，其内除放灭菌锅外，最好还有临时存放培养基、培养器皿的架子，也应有自来水装置。灭菌室可根据灭菌锅的多少，工作量大小来确定面积，要求房间能有较好的通风散热条件，且要配备专门的电源线路，因为电热灭菌锅的耗电量很大。 四、接 种 室 接种室是对培养的植物材料进行无菌操作的地方，应有超净工作台、放置培养容器的架子等。整个房间最好设有缓冲间和双层门窗，以防灰尘和微生物。房间内最好装有紫外灯或经常喷洒杀菌剂，以抑制过多微生物生长。工作人员在进入接种室之前在缓冲间内更换衣服、鞋帽、穿好工作

13、服，戴上口罩、防尘帽，换上拖鞋才能进入接种区，进入接种区之后随手把活动门关上。 五、培养室 培养室最重要的是要恒温、恒湿，无尘且空气流通。温度应维持在(253)，相对湿度应在5060%。培养室内有规律地安放培养架或摇床。培养室内所有光照和黑暗应由定时器自动控制。整个培养室内还应装有一个或多个紫外灯，以便能定时对整个房间进行杀菌处理，特别是在夏天潮湿、霉雨季节，最好每天在晚上用紫外灯杀菌30 min以上。培养室内的地面、墙壁、培养架及所有器物的表面都应经常清洗、擦拭以防过多灰尘和微生物滋生。 六、培养物的检测与观察记录室 对培养物进行及时的检测和观察记录是研究植物组织培养的重成部分之一，如不及时

14、观察记录或对培养物的形态、结构、生理变化以及培养基变化等进行及时检测，就不可能获得准确有效一手资料，也就不能及时地发现和找出问题，提出解决问题的方法和改进培养的方案。检测与观察记录室最好单独设立一个房里面摆放实体解剖镜、普通光学显微镜、显微照相和记录设备 。第五章 植物组织培养常用培养基成分及培养基配制目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。例如，White培养基是Uspenski和Uspenskaia(1925)的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养；Gautheret培养基是建立在Knop营养液(1865)基础上的。以后的培养基大部分是在

15、White和Gautheret培养基的基础上改进而成。一、培养基的成分（一）、无机营养成分(包括大量元素，微量元素和铁盐)1、大量元素：一般指在培养基中的浓度大于O.5mmolL的元素。氮：常以硝态氮(N03)或氨态氮(NH4)，或两者相互配合的形式存在。缺氮时愈伤组织会出现花色素苷的颜色，愈伤组织内部不能形成导管。 磷：常以NaH2P04H2O、KH2P04或(NH4)H2P04的形式提供。钾：常以KCl、KN03或KH2P04形式。 钙：常以CaCl22H2O、Ca(N03)2。镁：常以MgS047H2O的形式，既提供了镁也提供了硫。缺硫时培养的植物组织会明显的退绿；缺磷或钾时细胞会过度生

16、长，愈伤组织表现出极其蓬松状态。 2微量元素：指小于O.5mmolL的元素。 主要包括铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、氯(C1)、硼(B)和钼(Mo)等。 铁作为一种微量元素，对植物也是必需的，但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制，且常以螯合物的形式，把FeS04和它的螯合剂乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA)先分别配成溶液，再相互混合使形成螯合铁，以防止沉淀和帮助被植物吸收。 （二）、有机营养成分 维生素: 除维生素B1、维生素B6、烟酸之外，在部分培养基中还添加维生素C(抗坏血酸)、维生素H(生物素)等。甘

17、氨酸(氨基乙酸)和肌醇(环己六醇):肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。另外，在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。 （三）、碳水化合物用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或葡萄糖，用量通常为24%，高者可达5，亦可用市售的白糖所代替。 几乎所有的培养物在蔗糖作为碳源时生长都比较好，只有少数植物或组织在葡萄糖或果糖作为碳源的培养基上生长更合适。也有用麦芽糖、半乳糖、甘露糖、山梨醇和乳糖作为碳源的。 （四）、植物生长调节物质 在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养

18、基中还添加赤霉素GA3等。1生长素：主要被用于诱导刺激细胞分裂和根的分化。常用的生长素有：NAA(萘乙酸)，IAA(吲哚乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，NOA(萘氧乙酸)，2，4一D(2，4一二氯苯氧乙酸)，2，4，5一T(2，4，5一三氯苯氧乙酸)。对愈伤组织增殖最有效的是2，4一D，特别是对单子叶植物。但2，4-D是一种极有效的器官发生抑制剂，不能用于启动根和芽分化的培养基中。 2细胞分裂素 使用细胞分裂素的主要目的是刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。 常用的天然CTK主要有：玉米素,玉米素核苷，二氢玉米素 。常用的人工合成CTK主要有: 激动素(KT)、6-苄基腺嘌

19、呤(6-BA)、2ip(异戊烯氨基嘌呤)、和TDZ(thidiazuron，噻二唑苯基脲)等 。3赤霉素 ：主要是GA3。用时需过滤灭菌；促进试管苗伸长。 （五）、琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外，所有的培养物都应生长在固体或半固体的培养基上,以防止培养物沉人液体培养基，因缺氧而死亡。琼脂是一种极为理想的支持物。它是由海藻得来的多糖类物质，但并不是培养基中的必需成分，只是作为一种凝固剂使培养基变成固体或半固体状态。（六）、其他添加物 ：酵母提取物，椰乳，香蕉粉，橘子汁，活性炭，渗透调节剂、水解酪蛋白、水解乳蛋白等。1活性炭：能从培养基中吸附许多有机物和无机物分子，可清除培养中植物组织在代谢过

20、程中产生的、对培养物有不良或毒副作用的物质，也可以调节激素的供应。活性炭还有刺激胚胎发生(如烟草花药培养)或组织生长和形态发生的作用。2渗透调节剂：常选用一些代谢微弱的糖来充当，如甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇等，这些糖基本上不被培养的植物组织所吸收，而只存留在培养基中，起到调节渗透的作用。3抗生素：培养的植物组织内部携带有病原物，表面消毒不解决问题时，可在配置培养基时添加抗生素，如加200300U的庆大霉素可使细菌污染受到很好的控制。 二、培养基的选择 1选择合适的培养基 基本培养基： MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合于许多单子叶植物， White培养基适于根的培养 激

21、素浓度和相对比例的确定 先参考已有的报道，看是否有用相同植物、相同组织或相近者做过成功或失败的试验，如果有则直接作为参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择35个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案。 三、培养基的配制 （一）、配制母液（二）、配制培养基 (三)、配制培养基时应注意的有关问题 1、高温灭菌的基本过程 检查灭菌锅内有无足够量的水，最好用蒸馏水或去离子水，因为自来水含有较多的矿物质，容易使锅内形成水垢，影响锅的使用寿命。将需要灭菌的器皿、培养基等放入锅内，不要装得太满，以不超过锅的容量34为宜。 2、高温下培养基成分的降解 经高温灭菌后赤霉素GA3的活性

22、仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10。NAA、2，4一D、激动素和玉米素在高温下是比较稳定的。蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质。高温可使碳水化合物和氨基酸发生反应。维生素具有不同程度的热稳定性，但如果培养基的pH值高于5.5，则维生素B1会被迅速降解。 第六章 无菌操作技术与设备一、干热灭菌 干热灭菌就是在180的烘箱内对器皿进行杀菌处理，是一种彻底杀死微生物的方法。适合于干热灭菌的器皿和物品有：玻璃器皿，如三角瓶、烧杯、量筒等；金属物品，如镊子、解剖刀、剪刀等；可以高温灭菌的塑料制品。二、湿热灭菌湿热灭菌就是人们平时所说的蒸汽灭菌

23、。灭菌的温度为121，压力为103.4 kPa，灭菌时间除液体外要求在121下维持15 min以上。液体灭菌时间可依据体积而定，体积越大，需要时间越长，如2.5L需20min，10L需28min，25L需31min。 湿热灭菌时应注意以下问题：1、不能随意延长灭菌时间，因为延长时间会使一些化合物过多分解，特别是蔗糖会分解为单糖，使培养基pH降低，琼脂不能很好的凝固；2、如果灭菌锅没有吹干程序，从锅内取出的纸制品、纱布等最好立即转到60的温箱中吹干；3、由于锡箔纸不透气，推荐使用牛皮纸或报纸等包装物品，以利于水分快速蒸发；4、灭菌锅所装蒸馏水或去离子水应经常更换，以防止微生物污染和水中杂质过多，

24、给灭菌锅和要灭菌的物品带来不利影响； 三、微过滤灭菌是使需要灭菌的液体通过一个微孔滤膜，以除去液体中的微生物、微颗粒等，过滤的范围是0.025lOm。这种方法对于高温灭菌容易引起分解的物质最为适宜，如容易分解的维生素、激素、植物组织提取物、抗生素等。微过滤灭菌的关键部分是微孔滤膜，如要彻底清除细菌、酵母等微生物，最好使用0.22m的滤膜。如要获得原生质体，则可使用O.45m的滤膜。 四、化学药物灭菌 1、镊子、解剖刀等器具的灭菌：将准备使用的镊子、解剖刀等浸入75%酒精中，器具的大半部分都被酒精浸泡。使用时取出镊子或解剖刀，放在酒精灯上加热至酒精完全除去为止，用完后再放回75%酒精中。2、外植

25、体的灭菌：将植物材料先用自来水加洗洁精少许浸泡10min以上，浸泡期间要轻轻搅动几次，以便使植物材料与溶液充分接触，然后用自来水冲洗10 min左右。在超净工作台上，将材料在70酒精中进行表面预消毒30秒，倒掉酒精，再用O.1升汞(HgCl2)进行消毒8分钟左右，或用1次氯酸钠(NaOCl)或次氯酸钙Ca(OCl)2消毒20 min左右，具体时间要根据材料而定。然后用无菌水冲洗34次，每次2 min左右。次氯酸盐在pH6.O左右时活性较高，高于8.0时几乎无活性；通常往消毒液中添加几滴吐温20或吐温80等表面活性剂，以提高灭菌效果。 五、抗生素灭菌 首先必须弄清楚要杀死的是真菌、细菌还是病毒，

26、是哪类真菌、哪类细菌或病毒；其次应知道使用的抗生素是否对培养的植物组织有不良影响；最后要确定抗生素的使用浓度、使用时期和处理时间的长短。抗生素的使用只能是用作预防微生物污染的方法，而不能用于杀死微生物，因此在使用时最好加在培养基当中，而不宜作为一种杀菌剂单独使用。因为农杆菌介导法已成为植物基因转移的一个主要方法，在转基因过程中的除菌和抑菌都离不开抗生素，所以使用抗生素已逐渐成为植物组织培养中的灭菌技术之一。六、无菌操作中其他应注意的问题 注意防止紫外线的危害 植物组织培养室和超净工作台上的紫外灯开放时间不可太长，最好在30min之内。超净工作台上的紫外灯关闭以后不要立即走近工作台，最好让无菌风

27、吹23 min后再开始操作。 第七章 离体快速繁殖方法微繁在无菌条件下进行植物的无性繁殖。1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。使微繁技术真正实用化。 一、无菌培养物的建立 1、外植体的选择：茎段、茎尖、叶片、嫩芽、鳞茎的鳞片、花器官等。 注意：（1）、在生长季节开始时由活跃生长的枝条上切取的外植体，通常能产生最好的效果。（2）、对于需要低温、高温或特殊的光周期才能打破休眠的鳞茎、球茎、块茎和其他器官，应当在取芽之前进行必要的处理。2、消毒二、茎芽的增殖（一）茎芽增殖的类型1、器官型(organ type) 以芽增殖芽的方法，其遗传性状稳定，成为目前快速繁殖中采

28、用的主要方法。2、器官发生型(organogenesis type) 外植体先脱分化形成愈伤组织，再分化出器官的方式。3、胚状体发生型(embryoid type) 体细胞增殖发育的顺序与受精卵发育极为相似，经过原胚一球形胚一心形胚一鱼雷胚一子叶胚5个时期，最后发育成完整的植株。胚状体可从愈伤组织形成，也可不经过脱分化直接从子叶、下胚轴和花药培养形成。通过胚状体的培养可以获得大量的植株，大大提高繁殖率4、原球茎型(protoeomb type) 目前兰花的快速繁殖主要靠原球茎的分化方式。 5、球茎芽型(globose stem bud type) 观叶海棠的叶柄表面可产生一个个圆球形的小突起（

29、球形茎），小突起的一端产生芽和叶片，另一端长出根，最后形成完整的小植株。 6 块茎型(tuber type) 花叶芋的叶片或叶柄上，先形成类似愈伤组织的小硬粒突起，并逐渐形成粒状的芋块。随后粒状芋块上分化出新的14个小突起。由小突起上分化出芽原基。随着小芋块的增大，分化出的芽也越密集并形成许多小苗，在小苗基部与芋块交界处分化出白色的根。 7 鳞茎型(bulb type) 百合的鳞茎切块基部近轴面或在边缘直接形成带根的小鳞茎。如卷丹鳞片的顶部、中部和基部均能诱导分化出小鳞茎。郁金香鳞茎旁又会分化出小鳞茎。（二）器官发生型 1 愈伤组织形成的条件 诱导愈伤组织常用的生长素是2，4一D，IAA和NA

30、A，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。在禾谷类植物中，只用2，4一D就能成功地诱导愈伤组织。多数情况下诱导愈伤组织既需要生长素，也需要细胞分裂素。黑暗条件下有利于愈伤组织的形成，光照对组织的愈伤化有抑制作用。 2 愈伤组织状态的调控 优良愈伤组织须具备的特性： (1)高度的胚性或再分化能力，以便得到再生植株；（2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系；（3）旺盛的自我增殖能力，以便建立大规模的愈伤组织无性系。（4）经过长期继代保存不丧失胚性，以便对它们进行各种遗传操作。 愈伤组织状况调整的策略 （1）选择适当的基因型和外植体。如禾谷类植物愈伤组织培养的成功，是由于选择了未成熟胚和幼穗作

31、为外植体，它们的根和幼叶虽然也能形成愈伤组织，但都是非胚性的。（2）选择正确的培养基，特别是正确的植物激素种类和浓度，及二者之间正确的配比。 （3）采用某些特殊的理化因素，改变愈伤组织诱导培养基和培养条件。如在玉米幼胚愈伤组织培养中，通过在培养基中添加5mgL或10 mgL AgNO3，抑制组织内乙烯的作用。（4）还原态氮具有促进细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。增加培养基中的氨态氮(或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有机形式的还原态氮)可明显促进细胞分裂；增加培养基中的硝态氮或减少还原态氮，可显著抑制细胞分裂。 3 影响茎芽分化的因素 化学因素 （1）细胞分裂素/生长素 在茎芽诱导

32、中，2ip在通常情况下是最为有效的。（2）生长素能抑制芽的形成: 在烟草中，浓度低到5molL的IAA即足以完全抑制茎芽的自发分化。当与激动素或腺嘌呤结合使用时，生长素可以抵消它们促进茎芽形成的作用。（3）赤霉素对于茎芽的分化有抑制作用:在烟草中，若把正在分化的愈伤组织在黑暗条件下以GA3处理，时间即使短至3060min，也会减少芽的分化，而且在处理之后48h，所有的拟分生组织或茎芽全都不复存在。 物理因素 （1）琼脂浓度： 在培养烟草薄层组织时，当琼脂为l时，只能形成花；随着琼脂浓度的下降，花的形成频率减少，营养芽的分化出现。在液体培养基中，则只能愈伤化和分化营养芽 ；（2）渗透压： 在由马

33、铃薯叶肉原生质体获得的愈伤组织中，只有在培养基里加入0.2O.3 molL甘露醇以使渗透压保持在200到400毫渗透压摩尔时，才可能出现茎芽的分化。 （3）光照： 高强度的光照对烟草茎芽的形成有抑制作用。天竺葵愈伤组织只有在光照和黑暗周期交替(1516 h光照最好)条件下才能分化茎芽，培养在连续光照下的愈伤组织总是白色的，不表现器官发生。光质对器官分化也有影响。在烟草中蓝光促进茎芽分化，红光刺激生根。 （4）温度： Skoog(1944)在533的范围内研究了温度对烟草愈伤组织生长和分化的影响，发现直到33时愈伤组织的生长都随温度的上升而增加，但只有在18时最适合茎芽的分化，在33时不能形成茎

34、芽。 其他因子：培养材料的染色体组，供体植株和外植体的生理状态，外植体的细胞发育状态，培养物的历史以及内生激素水平。 （三）影响茎芽增殖的因素1、无机盐水平 对有些植物来说，MS培养基中的无机盐水平或有毒或太高。如乌饭树的茎芽在只含14强度MS无机盐的培养基中能长得很好，无机盐水平再高或是有毒或是并没什么好效果。2、激素 CTK 为了获得健壮的茎芽应适当降低细胞分裂素浓度。细胞分裂素使用的 浓度范围是O.55 mgL，大多数适当的浓度是1 2 mgL。GA 为促使茎的伸长，有时加入GA； 生长素 在进行茎芽繁殖时，IAA、NAA使用的浓度范围是0.11mgL。3、琼脂 微繁所用的培养基通常都用

35、0.6 %O.8的琼脂固化。但在卡特兰和大多数凤梨科植物中，只有在液体培养基中才能把培养建立起来。应用液体振荡培养的一个特殊优点是茎芽一边增殖一边彼此离散，不必用人工把成簇的茎芽切开。4、光照和温度光的作用只是满足某些形态发生过程的需要，因此10005000 lx的光强即已足够。光周期严格地说也是不重要的。每天16 h光照8 h黑暗交替照明，即可产生令人满意的效果。培养室的温度一般恒定在25左右。 三、离体枝条的生根 1、试管内生根 1）生根培养基应降低盐的浓度，减少到12MS或14MS。 2）诱导生根需要有适当的生长素，最常用的是NAA和IBA，浓度一般为O.1 10.O mgL。3）对于难

36、生根的植物，可尝试把它们的下端浸在高浓度生长素溶液中若干时间(由几秒到几小时)之后，再插于无激素培养基中。4）在生根培养基中减少蔗糖浓度(如减到1)和增加光照强度，能刺激小植株通过光合作用制造食物的能力，以便由异养型过渡到自养型。5）枝条在离体条件下生根所需的时间由10d到15d不等。根长15mm左右时移栽最为方便，更长的根在移栽时易断，会降低植株的成活率。 2、试管外生根 在有些植物中，可以把在离体条件下形成的枝条当做微插条处理，使它们在土中生根。在这种情况下，须把插条的基部切口先用标准的生根粉或混在滑石粉中的IBA处理；有些植物如月季，则可先在试管内诱导枝条形成根原基，然后再移栽土中，遮荫

37、保湿，待其生根。试管外生根由于减少了一个无菌操作步骤，因而可降低成本。 无根苗的嫁接 试管内嫁接(微体嫁接): 即以试管苗的0.1O.2mm长的茎尖为接穗 ，以在试管内预先培养出来的带根无菌苗为砧木，在无菌条件下借助显微镜进行嫁接，之后继续在试管内培养，愈合后成为完整植株再移入土中。 试管外嫁接: 无籽西瓜试管苗嫁接到瓠子上后，在温度为2530，相对湿度基本饱和的条件下，3d后伤口长出愈伤组织，1周后成活并长出新叶。 四、壮苗、炼苗和移栽 需壮苗、炼苗的原因 ：试管苗生长在恒温、高湿、弱光、无菌和有完全营养供应的条件下，虽有叶绿素，但营异养生活，在形态解剖和生理特性上都有很大脆弱性，如无角质层

38、或蜡质层，气孔开张过大且不具备关闭功能等。这样的试管苗若未经充分锻炼，一旦被移出试管，投入到一个变温、低湿、强光、有菌和缺少完全营养的条件下，必定要被剧变的环境所吞噬。 壮苗： 是移栽成活的首要条件，在培养基中加入一定数量的生长延缓剂如多效唑(PP333)，B9或矮壮素(CCC)等，在很多种植物中都是培育壮苗的一项有效措施。炼苗： 壮苗之后则须开瓶，降低瓶中湿度，增强光照强度，以便促使叶表面逐渐形成角质，促使气孔逐渐建立开闭机制，促使叶片逐渐启动光合功能等。 移栽： 先要轻轻地、彻底地洗掉沾在根上的琼脂培养基，以免栽后发霉。要选用排水性和透气性良好的移栽介质，例如蛭石、河沙、珍珠岩、腐植土等。

39、移栽后，最初1015 d要通过喷雾或罩上透明塑料以保持很高的湿度(90%100)。 五、微繁中存在的一些问题 1、物种的局限性很多难于用传统方法繁殖的重要树木，包括若干裸子植物，离体繁殖技术还未过关。2、无性系变异 在商业性微繁当中，一旦无菌培养已经建立，人们就禁不住以此为起点连续繁殖若干世代，结果就有可能使培养早期发生的变异(芽变或偶然变异)累积起来。如果是通过愈伤组织进行微繁的话，经过长期继代培养之后，再生植株中出现变异的可能性更大。3、培养物污染在植物大规模微繁期间，即使外植体在一开始进行了严格的表面消毒，某些慢速生长的病原菌(特别是内生菌)可能依然存在，但只有在培养物经过多次继代之后，

40、这些污染物才表现出来并被人们所发现。4、玻璃化玻璃化现象是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变，多数发生在植物茎尖培养和离体快繁中。玻璃苗生长繁殖速度下降，最后甚至死亡。玻璃化的诱因 外植体类型、培养基成分和培养条件等各种内外因素都可能是玻璃化现象出现的原因，其中比较重要的如琼脂用量太低或细胞分裂素浓度过高，培养温度过高，光照不足以及乙烯合成增加等。 5、培养基的褐变 褐变的原因： 由外植体的切口表面渗出的酚类物质氧化后成为醌类物质，使培养基变成暗褐色，从而对组织产生毒害作用。 克服培养基褐变的措施 1、以几天的时间间隔将外植体转到新鲜培养基上23次，在这段时间内外植体的切口愈合，酚

41、类物质外渗停止。 2、把由亲本植株上直接采集的茎芽，先在一种液体培养基上培养3d，然后再在半固体培养基上培养。或于接种的第一个星期之内，每天更换一次液体培养基 。3、在培养基中加入一些抗氧化物，如盐酸半胱氨酸(100mgL)、抗坏血酸(50100mgL)或者是柠檬酸(150mgL)。 4、使用能够吸收酚类化合物的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，用量一般为0.01)、活性炭(O.10.5) 。5、由于光能促进酚的氧化，开始时把培养物置于暗处也可能有助于减轻褐变的问题。6、适当降低培养温度。 第八章 体细胞胚胎发生一、体细胞胚(somatic embryo)或胚状体(embryoid)的概念 指在植物组织

42、培养中起源于一个非合子细胞、经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。 胚状体的特点： 1、不是两性细胞融合的产物；2、 不同于孤雌胚或孤雄胚，不是无融合生殖的产物；3、不同于器官发生途径形成的茎芽和根，它的形成须经历与合子胚相似的发育过程，而且成熟的胚状体是一个双极性结构。 二、体细胞胚发生研究的历史离体条件下的体细胞胚胎发生过程最早是在胡萝卜中由Reinert（1958）和Steward等（1958）发现的。 迄今已在分属于40余科（包括裸子植物）的100多个种植物中有过关于体细胞胚胎发生的报道。能产生体细胞胚胎的外植体有：单倍体的小孢子；二倍体组织如茎段、子叶、茎尖、叶柄、贮

43、藏根的韧皮部和木质部等；三倍体的胚乳。三、体细胞胚胎发生的方式 1、从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织阶段，如石龙芮再生植株茎表面长出不定胚。 2、外植体先愈伤化，然后由愈伤组织细胞分化成胚，如石龙芮花器愈伤组织成胚，从愈伤组织产生胚状体最为常见。 A、由外植体外层细胞直接产生体细胞胚 B、由外植体组织内的细胞产生体细胞胚C、愈伤组织表层细胞分化为体细胞胚 D，E、多个或单个细胞形成体细胞胚 四、体细胞胚胎发生及植株再生研究的意义 （1）植物细胞分化、全能性表达过程和机理等重大理论问题的研究提供了理想的实验体系 ；（2）人工种子的制作，是促进离体快速繁殖、实现

44、田间和温室栽培的重要途径；（3）胚性愈伤组织可在适宜的条件下长期保存，为解决濒危植物挽救等问题提供了可能；（4）胚性愈伤组织具有遗传稳定、再生频率高的特点，对于基因工程非常适用； （5）体胚发生过程中众多体细胞无性系变异为突变体的筛选提供了新的来源； (6)以胚性细胞为材料制备原生质体，为细胞分化和植株再生等奠定了基础。 五、影响植物体细胞胚发生及植株再生的因素 1、基因型的影响 2、外植体种类：外植体的类型、所处发育和生理状态以及取材部位等因素均影响体胚发生。甚至外植体形态学部位也是影响因素之一。幼嫩的生殖器官较容易由外植体直接产生体细胞胚胎。而幼嫩的营养器官则一般需经愈伤组织途径产生体细胞

45、胚胎。 3、预处理：在一些植物体胚诱导中，如预先低温(48)储藏12个月。4、培养基种类及其成分培养基种类 体胚诱导中70采用MS培养基。MS培养基中含较高水平的NH4NO3和螯合铁。对体胚发生有促进作用。氮源 在胡萝卜叶柄节段培养物中，只有当培养基里含有一定数量的还原态氮时，才能出现胚胎发生过程。在以KN03为唯一氮源的培养基上建立起来的愈伤组织，去掉生长素以后不能形成胚。然而，若在含有55mmolL KNO3的培养基中加入少量(5mmolL)NH4C1形态的氮，胚胎发育过程就会出现。 碳源 作为外植体的渗透压调节物和体胚发育的能源物质，碳源对体胚发生有重要影响。在柑橘体胚发生中，适当浓度的

46、甘油大大刺激了愈伤组织的生长和胚胎发生，而且能获得同步控制。苹果离体叶片培养时，在保证碳源供应的前提下，降低蔗糖浓度有利于直接体胚发生。高浓度的钾 在野生胡萝卜中，高浓度的钾(20mmolL)是胚胎发生所必需的。培养基中溶解氧 在培养基中溶解氧的含量应低于一个临界值(1.5mgL)，否则将有利于生根，而不利于成胚。这是因为低水平的溶解氧在细胞内会导致高水平的ATP。如果加入ATP，则有可能取代对低水平溶解氧的需要。 活性炭 在培养基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率。酵母提取物在培养基中加入酵母提取物能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率。植物激素 (1) 生长素类：多数植物诱导胚性愈伤组织

47、需用2.4一D，特别是单子叶植物。而且胚性细胞发育时还必须及时降低或去掉2，4一D。但低浓度的生长素是大多数植物诱导体胚发生所必需的。(2) 细胞分裂素类：许多植物体胚发生的诱导必须加入外源生长素和细胞分裂素，CTK在裸子植物中起着比生长素更重要的作用。（3）脱落酸：外源ABA可促进枸杞、石刁柏等胚性愈伤组织的形成和体胚的发生。保持籼稻愈伤组织的胚性结构，并使其绿苗分化率明显提高。(4)乙烯及多胺： 低浓度的乙烯利显著刺激胚胎发生，高浓度则抑制胚胎发生。 外源多胺或其前体可使人参体胚发生数增加4倍；外源Put使茄子体胚发生数增加6倍，并伴随内源Put增加，而抑制多胺合成和降解则使体胚发生数减少。（5）赤霉素：抑制许多植物胚状体的发生，但对胚状体的进一步发育成熟及胚的萌发效果很好