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1、脲酶值测定脲酶值测定本讲稿第一页，共十七页1926年，美国生化学家Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，并证明了脲酶的本质是蛋白质。1946年获得诺贝尔化学奖。本讲稿第二页，共十七页酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。本讲稿第三页，共十七页酶的特征常数Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度酶促反应的特征常数只与酶的结构、底物和反应环境（如温度、pH、离子强度）有关，与酶的浓度无关。本讲稿第四页，共十七页实 验 目 的1.阐述酶促反应中特征常数的特点和意义；2.说出利用比色法进行Km值测定的整个操作步骤；3.思考Km值的测定对临床
2、工作中的意义。本讲稿第五页，共十七页一一 、原理、原理O CO C NHNH2 2 NHNH2 2+2H2H2 2OO脲脲脲脲 酶酶酶酶（NHNH4 4）2 2COCO3 3+6NaI+8KI+Na6NaI+8KI+Na2 2COCO3 3+6H+6H2 2OO(NH(NH4 4)2 2COCO3 3+8H 8H2 2O O+4(KI)4(KI)2 2HgIHgI2 2 2O2OHgHgHgHgNHNH2 2I I碘化双汞铵（橙黄色）碘化双汞铵（橙黄色）碘化双汞铵（橙黄色）碘化双汞铵（橙黄色）本讲稿第六页，共十七页米米曼氏方程曼氏方程（Michaelis-Menten equation）V=V
3、max SKm+S米米-曼氏方程解释：曼氏方程解释：当当SSKmKm时，时，v v Vmax SVmax S/Km/Km，即即v v正比于正比于SS当当SSKmKm时，时，v Vmax,v Vmax,即即SS 而而v v不变不变本讲稿第七页，共十七页 Km值：值：当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是molL。Km值最小的底物称为该酶的最适底物也就是天然底物。Km+SVmax SV2Vmax=Km=S=本讲稿第八页，共十七页 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响 v vVmVmVmVm 2 20 S0 SSSSS与与与与v v v v关系：关系：关系：关系：当
4、当当当SSSS很低时，很低时，很低时，很低时，SSSS 与与与与v v v v 成比例成比例成比例成比例-一级反应一级反应一级反应一级反应当当当当SSSS较高时，较高时，较高时，较高时，SSSS 与与与与v v v v 不成比例不成比例不成比例不成比例当当当当SSSS很高时，很高时，很高时，很高时，SSSS ，v v v v不变不变不变不变-零级反应零级反应零级反应零级反应本讲稿第九页，共十七页KmKm值与值与 VmaxVmax值测定值测定双倒数作图法又称林双倒数作图法又称林-贝氏作图法（贝氏作图法（1934）1 =KmKm 1 1 +1 1 V Vmax S Vmax V Vmax S Vm
5、ax1/V1/V-1/Km 0 1/S-1/Km 0 1/S斜率斜率斜率斜率=Km/Vmax=Km/Vmax1/Vmax1/Vmax本讲稿第十页，共十七页酶促反应的原料酶促反应的原料底物（脲液）酶（脲酶液）酶促反应所需的缓冲液（PBS，蒸馏水等）酶促反应发生的环境（碱性条件，加入NaOH；温度，37）本讲稿第十一页，共十七页1.操作中每种试剂务必摇匀 2.煮沸脲液时注意试管口不能对人，变性脲酶液要煮沸变性彻底3.试管一定要清洗干净，防止其他残留液体对实验的影响4.各组试管加样注意一致性，防止人为加样造成的误差。重复测值，取平均数值 注意事项注意事项本讲稿第十二页，共十七页实验操作管号1234对
6、照脲液加入体积(mL)0.20.1340.10.080.081/15PB（mL）0.60.6660.70.7200.720脲酶液（mL）0.20.20.20.2-煮沸脲酶液（mL）-0.2 摇匀，37度水浴15min本讲稿第十三页，共十七页100g/L ZnSO40.50.50.50.50.5蒸馏水333330.5mol/L NaOH0.50.50.50.50.5滤液/mL11111蒸馏水/mL22222显色液/mL0.750.750.750.750.75充分摇匀，静置5min，过滤，分别在滤液中加入以下试剂本讲稿第十四页，共十七页迅速摇匀，用迅速摇匀，用721型分光光度计，型分光光度计，420nm，以对，以对照调零，测定各管照调零，测定各管A值值。1/A1/A-1/Km 0 1/C-1/Km 0 1/C斜率斜率斜率斜率=Km/Vmax=Km/Vmax1/Vmax1/Vmax（1/V1/V）本讲稿第十五页，共十七页讨论小结讨论小结酶促反应有什么特点？测定酶促反应特征常数Km值有意义？本讲稿第十六页，共十七页思考题：1、脲酶的特征常数的特点是什么？2、测定Km值有什么意义？3、Km值的测定与临床疾病有何联系？本讲稿第十七页，共十七页