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1、第十章物理作图本讲稿第一页，共二十九页物理作图的方法物理作图的方法 o 限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)(Restriction Mapping)o 依靠克隆的基因组作图依靠克隆的基因组作图(clone-based mapping)(clone-based mapping)o 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ hybridization)(Fish,Fluorescent in situ hybridization)o 序标位作图序标位作图(STS(STS，Sequence taged site)Sequence tage
2、d site)本讲稿第二页，共二十九页1.1.限制性作图限制性作图 它是将限制性酶切位点标定在它是将限制性酶切位点标定在DNADNA分子的相对位置分子的相对位置.其只能应用于较小的其只能应用于较小的DNADNA分子分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.通常采用的通常采用的6 6碱基对识别顺序的限制酶仅适合碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb50Kb以下DNA分子的精确作图分子的精确作图.本讲稿第三页，共二十九页1.1 限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理基本原理1Kb EcoR I待检的待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH
3、H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5KbBH 本讲稿第四页，共二十九页本讲稿第五页，共二十九页方法：n n用两种限制酶中的种对种对DNADNA分子进行消化，产生分子进行消化，产生片段的大小通过琼脂糖凝放电泳来检测。片段的大小通过琼脂糖凝放电泳来检测。n n第二种酶消化第二种酶消化DNA分子，再用琼脂糖凝胶电泳检测分子，再用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。这些结果可以使我们弄清每种酶的限制位点片段大小。这些结果可以使我们弄清每种酶的限制位点数目，但切点之间的相对位置还不能确定。数目，但切点之间的相对位置还不能确定。n n将将DNADNA分子用两种酶同时进行切割可以获得更多的信息
4、。n n作部分限制性酶解。这样会产生作部分限制性酶解。这样会产生套更复杂的产物，除了完全消化的，还含部分消化产物。通过测定一个不完全消化片段的大小，构造出正n n确的图谱。确的图谱。本讲稿第六页，共二十九页n n缺点缺点 通常，部分限制酶消化为构建完整的图谱提供了通常，部分限制酶消化为构建完整的图谱提供了必需的信息。如果有多个限制位点集中、这种分析方必需的信息。如果有多个限制位点集中、这种分析方法就显得笨拙，因为要考虑的不同片段太多。法就显得笨拙，因为要考虑的不同片段太多。改进方法：改进方法：在部分消化前将放射性或其他类型的标记物加到要在部分消化前将放射性或其他类型的标记物加到要分析的分析的D
5、NADNA分子两端，结果很多部分限制酶消化产物成为不可见的，因为它们不含有末端片段，因此在琼脂糖凝胶上对标记物进行筛选时不会显现。我们可以利用“可见的可见的”部分限制片段的大小，确定出那些未定位的切点与DNADNA分子末端的相对位置。本讲稿第七页，共二十九页限制因素n n1.酶切位点的数目n n2.限制酶作图的规模受限于限制片段的大小 50KB本讲稿第八页，共二十九页1.2 1.2 限制酶作图的改进限制酶作图的改进n n脉冲凝胶电泳脉冲凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis)(pulsed-field gel electrophoresis)n n稀有切点限
6、制图绘制稀有切点限制图绘制 具有具有7 7个或个或8 8个核等酸识别序列的酶个核等酸识别序列的酶4096bp4096bp，16384BP16384BP，65536bp65536bpn n 识别序列包含靶识别序列包含靶DNADNA中稀少基序的酶中稀少基序的酶基因组明显缺少某些基序：例如，人类基因组中基因组明显缺少某些基序：例如，人类基因组中5 5 GC3GC3 序列很稀少，这是因为序列很稀少，这是因为人类细胞中含有一种酶，能够向这一序列中的胞嘧啶核苷的人类细胞中含有一种酶，能够向这一序列中的胞嘧啶核苷的5 5位碳原于添加甲基基团，位碳原于添加甲基基团，产生的产生的5 5甲基胞嘧啶不稳定容易脱氨基
7、产生胸腺嘧啶。甲基胞嘧啶不稳定容易脱氨基产生胸腺嘧啶。n nSma I 5CCCGGG 78Sma I 5CCCGGG 78n n：5 GCGCGC5 GCGCGC3 3：390 kb390 kb频频n n：5GCCCGGCCGC35GCCCGGCCGC3平均约每平均约每10Mb10Mb才有一个位点。才有一个位点。本讲稿第九页，共二十九页稀有切点限制图绘制注意事项稀有切点限制图绘制注意事项稀有切点限制图绘制注意事项稀有切点限制图绘制注意事项:识别顺序越长产生的片段越大识别顺序越长产生的片段越大;识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;如人类基因组如人类基因
8、组A/TA/T比例接近比例接近60/%,60/%,选用高比例选用高比例A/TA/T位点限制酶位点限制酶,产生产生的片段多于高比例的片段多于高比例G/CG/C识别位点酶识别位点酶 有些限制酶识别位点较长有些限制酶识别位点较长 如酵母的如酵母的-SceSce识别顺序为识别顺序为18bp,18bp,如果高等真核生物基因组中无此序列如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中导的方法将其引入代测基因组中.基因组基因组DNA DNA 的甲基化状态的甲基化状态 如人类活细胞基因组中大量如人类活细胞基因组中大量5 5-CG-3-CG-3
9、顺序的胞嘧啶被甲基化顺序的胞嘧啶被甲基化,使许使许多含有多含有5 5-CG-3-CG-3 顺序的内切酶很少找到可切位点顺序的内切酶很少找到可切位点.本讲稿第十页，共二十九页本讲稿第十一页，共二十九页本讲稿第十二页，共二十九页2.1 大片段大片段DNA的克隆载体的克隆载体v YAC:YAC:酵母人工染色体酵母人工染色体 230-1700Kb 230-1700Kbv BAC:BAC:细菌人工染色体细菌人工染色体 300Kb 300Kbv PAC:P1 PAC:P1人工染色体人工染色体 300Kb 300Kb v Fosmids:30Kb Fosmids:30Kb2.基于克隆的基因组作图本讲稿第十三
10、页，共二十九页2.2 重叠群组建n n重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图.n n重叠群的组建方法 染色体步移法本讲稿第十四页，共二十九页 指纹作图法指纹作图法指纹作图法指纹作图法 指纹指纹:系指确定系指确定DNADNA样品所具有的样品所具有的DNADNA片段片段;一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.常用的指纹分析方法:A A 限制性带型(restriction patterns)(restriction patterns)指纹指纹 B B 重复顺序重复顺序DNA指纹指纹(repetitive DNA fingerprints)
11、(repetitive DNA fingerprints)C STS C STS目录作图目录作图(STS content mapping)(STS content mapping)D 重复重复DNA PCR(repetitive DNA PCR)DNA PCR(repetitive DNA PCR)或分散重或分散重 复顺复顺序序PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)指纹指纹本讲稿第十五页，共二十九页本讲稿第十六页，共二十九页3.荧光原位杂交荧光原位杂交(Fi
12、sh,Fluorescent in situ hybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。处的位置，将探针标定在连锁图上。本讲稿第十七页，共二十九页染色体上的杂交位点提供DNA探针序列的定位信息。应用该方法时，须打开维持染色体DNA螺旋结构。只有这样染色体DNA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理。因为放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂文成功的必要条件。因此，相隔1M
13、b才能作为分开的杂文信号被分辨出来机械伸展的染色体通过改变从中期细胞核中分离染色体的方法而获得离心产生的离心力可将将染色体伸展到正常长度的20倍。每条染色体仍能识别。这样，相隔200300KB的标记非中期染色体:间期本讲稿第十八页，共二十九页本讲稿第十九页，共二十九页 4.序标位作图序标位作图(STS,Sequence Taged Site)长度长度:100-500 bp序列已知序列已知,可以设计可以设计PCR反应反应单拷贝单拷贝,在染色体上的位置是唯一的在染色体上的位置是唯一的EST(Expressed sequence tag)大部分可以作大部分可以作STS本讲稿第二十页，共二十九页4.1
14、 STS作图原理本讲稿第二十一页，共二十九页条件n n独一的STSn nDNA片段群本讲稿第二十二页，共二十九页4.2 寻找STS的方法:n n表达顺序标签(expressed sequence tag，EST)从从cDNAcDNA中找到的小段顺序中找到的小段顺序,但基因家族成但基因家族成员间共有的序列不能用于员间共有的序列不能用于STSSTS。n nSSLP（simple sequence length polymorphisrns，SSLPs）n n随机基因组顺序本讲稿第二十三页，共二十九页EST1990年，Brenneer等首先提出人类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采
15、纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为。EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的端和端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。由于大多数的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式。本讲稿第二十四页，共二十九页n n STS作图过程中所必需的第一个要素是可能获得研究的染色体或基因组的
16、DNA片段群，这样的片段群有时也称为作图试剂n n方法：放射杂交体和克隆文库放射杂交体是指合有其他生物体染色体片段的啮齿类动物细胞4.3用于STS作图的DNA片段本讲稿第二十五页，共二十九页不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞本讲稿第二十六页，共二十九页4.3 STS的物理图定位n n辐射杂种不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤辐射杂种群PCR检测STS标记，根据STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度本讲稿第二十七页，共二十九页n n克隆作图构建全基因组DNA基因文库构建指定单一染色体的基因文库PCR检测STS分子标记根据重叠STS标记绘制克隆连锁图提取基因组DNA流式细胞仪分离染色体打断打断本讲稿第二十八页，共二十九页本章主要内容：n n物理作图法n n常用物理作图法有那几种n n常用的指纹分析方法有哪些，它们的分析机理是什么n n序标位作图如何作图序标位作图如何作图本讲稿第二十九页，共二十九页