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1、第八章电泳本讲稿第一页，共二十九页电泳电泳 第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 本讲稿第二页，共二十九页第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 电泳是指带电荷的粒子在直流电场中，向带符号相反的电极的移动，是一种电动现象。在离子移动的物理化学理论中，按照Debye-Hckel的理论，电泳决定于环绕每个离子的离子氛中的扩散双电层。当离子的尺寸越大，溶液的离子强度越高时，这种电泳现象就变得越明显。所以电泳现象中的表面电势和双电层等因素起着决定作用。而这些又与溶液性质及胶体的颗粒所带电荷有关。本讲稿第三页，共
2、二十九页第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 一、电泳的理论基础一、电泳的理论基础 1 1电荷的来源电荷的来源 固体和液体接触时，二者之间即有电位产生。固体表面带一种电荷、周围的液体带符号相反的电荷，这就叫做偶电层。胶体颗粒表面的电荷来源是：吸附液体中的某离子，因而带电，液体失去该离子而带相反的电荷。通常阴离子易被吸附而使固体表面带负电。阳离子因水化程度较高，不易被吸附。碳氢化物小滴和气泡也有吸附现象。作为胶体组成成分的相反符号的离子不等量的进入溶液，例如碘化银胶体在有过量碘离子的情况则带负电，在有过量银离子的情况则带正电。金属氧化物的胶体则受溶液中H+和OH的影响。固体表面吸附液体分子
3、，然后这些分子解离。本讲稿第四页，共二十九页第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 蛋白质或其他多电解质则由其本身所具有的功能团的解离而带电。蛋白质具有正负两类解离基，称为两性电解质。蛋白质在酸性介质中带正电，在碱性介质中则带负电。在某一pH值时，其正负电荷相等，此时的pH即称为该蛋白质的等电点。2电动现象电动现象 由于胶体粒子表面有偶电层、偶电层的固定层和可移动层之间形成电位，叫作电动电位或Zeta电位(电位)。电动电位的存在引起电动现象。本讲稿第五页，共二十九页第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 二、影响电泳迁移速率的因素二、影响电泳迁移速率的因素 推动粒子运动的力等于离子的净
4、电荷与电场强度的乘积，即：（8-1）式中 F运动的力，牛顿；Q离子的净电荷，库仑；E电场强度，伏特/米。本讲稿第六页，共二十九页第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 而粒子在运动时又受到定的阻力，对于球形粒子来说，此阻力服从stoke定律。(8-2)式中 阻力，牛顿；粒子半径，米；介质粘度，牛顿秒/米2；泳动速度，米/秒。当粒了以稳态运动时，电动力与阻力相等，即：。因此，(8-3)本讲稿第七页，共二十九页第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 电泳迁移率是指在单位电场强度(1伏特/米)时的泳动速度，即：，代入(8-3)式得 (8-4)影响电泳迁移率的因素很多，可以分为以下三大类：(1
5、)与被动离子(或粒子)本身的特性有关的因子，如电荷符号和大小、本身的大小和形状、水化程度、解离趋势、两性性质等。本讲稿第八页，共二十九页第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理 (2)环境因素，如缓冲液浓度、离子强度、介电性质、化学性质、pH、温度、粘度、有无极性分子存在(因为它可以影响粘度或介电性)等。在有支持物的情况下，影响因素更多，如支持物的吸附作用，不均一性、离子交换能力、电渗现象、虹吸作用、热和蒸发作用等。(3)所加电场的特性，如强度和纯度(是否杂有交流电)。这些因素在实验过程中要充分注意，尽量保持条件恒定不变，以便获得可重复的结果。本讲稿第九页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应
6、用电泳及其应用 一、电泳的分类一、电泳的分类 1 1按分离的原理区分按分离的原理区分 按分离的原理区分，电泳可分为区带电泳(zone EP.ZEP)、移界电泳、等速电泳和等电聚焦电泳。(1)区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。不同的离子成分在均一的缓冲液(或称载体电解质)系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出个个互相分离的峰，与洗脱色谱的图形相似，电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可以减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广
7、泛的电泳技术。本讲稿第十页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 (2)移界电泳 电场是加在大分子溶液和缓冲溶液之间的一个非常窄的界面上，带电分子的移动速率通过观察界面的移动来测定。如果大分子的离子溶液是不均一的，就能观察到多个移动的液面。缓冲液的选择是很重要的，它必须与大分子的离子溶液形成鲜明的界面。这种电泳只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形，和色谱法前向分析的图形相似，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。各界面可用光学方法显示，这就是Tisclius最早建立的电泳方法。(3)等速电泳 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移
8、动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。本讲稿第十一页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 (4)等电聚焦电泳 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。2 2按有无固体支持物区分按有无固体支持物区分 根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，又可以分为自由电泳和支持物电泳两大类。自由电泳又可分为：显微镜电泳(也称细胞电泳)，即在显微镜下直接观察细胞如红细胞或细菌等的电泳行为；移界电泳；柱电泳,用密度梯度保持分离区带不再混合，如果再配合以pH梯度则称为等
9、电聚焦；自由流动幕电泳，这是一种制备用的连续电泳装置，溶液自上流下形成一层薄的液膜。二个电极与液流方向垂直加在液层的左右两边，被分离的物质则经电泳分离后由下面分管收集；等速电泳。本讲稿第十二页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 有支持物的电泳(即区带电泳)是多种多样的。电泳过程可以是连续的或分批的，支持物可用滤纸、簿膜、粉末、凝胶微粒、海绵等。仪器可以用小的湿室、水平或直立的槽、柱、小管或毛细管；也可以用幕，如滤纸连续电泳所用的纸幕；此外还可配合免疫扩散、称为免疫电泳；使用多孔的凝胶,起分子筛作用，称为凝胶电泳；配合pH梯度的等电聚焦以及使用高压的高压电泳等。本讲稿第十三页，共
10、二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 二、几种典型的电泳技术二、几种典型的电泳技术 1 1琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是由琼脂经过反复洗涤除去含硫酸根的多糖之后制成的，将它加入定缓冲液中，加热溶解，冷却后则成胶，叫琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶电泳法，主要用于分离、鉴定和纯化DNA片段。用溴化乙锭(称EB)染色，在紫外灯下，凝胶中1ng的DNA即能直接观察到。该方法操作简便，条件易于实现，它的分离效果一般比超速离心等其他方法好，大小分子均可很好地分离。DNA、RNA结构分析的巨大进展，也主要依赖于琼脂糖凝胶电泳的高度分辨能力。琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依赖它们的分子量及分子构
11、型。而凝胶的类型及其浓度对被分离核酸的分子大小关系重大。本讲稿第十四页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 (1)核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 DNA的分子大小 DNA分子通过琼脂糖凝胶的速率(电泳迁移率)与其分子量的常用对数成反比。琼脂糖的浓度 一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中电泳迁移率不相同。要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要。研究了琼脂糖凝胶电泳分离大分子DNA的条件，发现以低浓度、低电压分离效果较好，胶的浓度越低，适用于分离的DNA越大，这是一个总的规律。不过浓度太低，制胶有困难，电泳结束后将胶取出来也有困难。在低电压情况下
12、，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。但是如果电压增高，电泳分辨力反而下降，因为电压高了，样品流动速度增快，大分子在高速流动时，分子伸展开了，摩擦力也增加，分子量与移动速度就不一定呈线性关系。本讲稿第十五页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 (2)核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 在分子量相当的情况下，DNA的电泳速度次序如下：共价闭环cccDNA直线DNA开环的双链环状DNA。但当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)可以按长轴方向前进，由此可见，构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。用琼脂糖凝
13、胶电泳相差一个超螺旋的DNA也可以分开，说明此法对DNA构型的高度分辨能力。除DNA外，RNA同样也如此。2 2醋酸纤维素膜电泳醋酸纤维素膜电泳 醋酸纤维素膜电泳是区带电泳的一个重要分支，它以醋酸纤维素膜为支持介质，其电泳原理与纸电泳基本相同。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜，早期曾用作细菌滤膜，后来用作区带电泳的支持介质。本讲稿第十六页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 醋酸纤维素膜电泳与纸电泳相比，具有很多优点。第一，醋酸纤维素膜对蛋白质样品的吸附作用极小，几乎完全消除纸电泳中经常出现的
14、“拖尾观象，染色后背景清晰，分离带狭窄清楚，因而提高了定量测定的精确性。第二，由于醋酸纤维素膜的亲水性比纸小，它所容纳的缓冲液也较少，电泳时电流的大部分是由样品传导的，所以分离速度快、电泳时间短。第三，样品用量少、灵敏度高。加样体积少至0.1L，即使是5L的蛋白质样品仍可得到非常清楚的分离区带，这一特点尤其适用于检测那些病理情况下微量的异常蛋白。第四，某些用纸电泳不易分离的蛋白质，例如溶菌酶、胰岛素、组蛋白等，经醋酸纤维素膜电泳后能得到很好地分离。第五，醋酸纤维素膜的电泳图谱经过冰醋酸乙醇溶液或其他透明液处理后可使膜质透明化，从而有利于光吸收扫描测定和膜的长期保存。本讲稿第十七页，共二十九页第
15、二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 3 3聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 这是一种利用人工合成的凝胶作支持介质的区带电泳方法。在此以前使用的区带电泳方法主要是纸上电泳、纸仅仅作为一种支持物而起抗对流的作用，而对样品的分离过程本身，不起什么积极的作用。而聚丙烯酰胺凝胶不同，它不仅有上述两种作用，而且还能主动参与样品的分离过程。因为聚丙烯酰胺凝胶有一定的网状结构它是由丙烯酰胺和N，N亚甲基双丙烯酰胺。简称Bis或亚甲基双丙烯酰胺聚合交联而成的。前者称单体(monomer)，后者称共聚单体(comonomer)或交联剂(crosslinher)，形成凝胶是种化学聚合过程，可以人为控制聚合成具
16、有一定大小孔径的凝胶，因此可以制成不同的交联度。如果形成的孔径大小接近于所分离样品分子的平均半径，那么在电泳过程中，样品分子在通过凝胶孔洞时，所受到的阻力就会和样品分子的大小及形状密切相关。这样，就为净电荷很相近的物质的分离又提供了一种可变的分离因素。通常我们称这种有利因素为分子筛作用。本讲稿第十八页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 用聚丙烯酰胺凝胶作区带电泳的支持物，有许多优点：佯品不易扩散；可随意控制凝胶浓度，按照需要制成不同孔径的凝胶；把分子筛效应和电荷效应结合在同一方法中，能够达到更高的分辨能力；它是由C-C-C结合的一种酰胺多聚物，侧链上具有不活泼的酰胺基，没有带电
17、的其他离子基，所以电泳时不产生电渗，化学上惰性较强；只要合成用的原料(单体)纯净，制成的多聚物的再现性高，因此样品分离的重复性也比较高；任一浓度范围内透明性好，机械强度好，有弹性；能按照需要把带有一定电荷的基团作为共聚体渗入其中；需要样品量少，1100g已足够；需要设备简单，时间短；用途广泛，对蛋白质、核酸等生物高分子可进行分离、定性、定量、小量制备、分子量测定等等。本讲稿第十九页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 4 4SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质混合样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳以后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，这种差异主要是由各蛋
18、白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状等因素造成的。1967年Shapiro等人首先发现，Weber和Osborn又进一步证实，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在15000200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系。本讲稿第二十页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 由此可见，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶系统做单向电泳，不仅可以根据分子量大小对蛋白质进行分离，而且可以根据电泳迁移率大小测定蛋白质的分子量。SDS是一种阴离子去污
19、剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，特别是在有强还原剂(例如巯基乙醇)存在的情况下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再被氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。实验证明，与蛋白质结合的是SDS单体，单体浓度与SDS总浓度、温度以及离子强度有关；本讲稿第二十一页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 当SDS单体浓度大于1mmo1L时，对于多数蛋白质来说，平均每克蛋白质可结合1.4gSDS。蛋白质分子与SDS充分结合后，所带
20、上的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而也就掩盖或消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质SDS复合物，其椭圆棒的短轴长度是恒定的，约为18埃，而长袖的长度则与蛋白质分子量的大小成正比例地变化。这样的蛋白质SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质分子量大小这因素。本讲稿第二十二页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 5 5等速电泳等速电泳 等速电泳是一种不连续介质电泳技术。在早期它被
21、称为置换电泳、离子移动法或恒电泳等。到70年代，Everaerts考虑到此技术的特点，即在电泳稳态时各组分区带具有相同的泳动速度，将其取名为“isotachophoresis”。其中，iso意为相等、tacho意为速度、phoresis意为泳动，所以中文就叫等速电泳，简称ITP。1976年，Evernerts出版了等速电泳专著，使这一名称被广泛接受。70年代后商品仪器问世，使等速电泳研究应用得以广泛展开。等速电泳有分析与制备两种类型。其中的原理也适用于制备型等速电泳。本讲稿第二十三页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 6 6等电聚焦等电聚焦 带有电荷的蛋白质分子可在电场中泳动，
22、其泳动率随其所带电荷的不同而彼此不同。等电聚焦就是在电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH值梯度。当把两性大分子放入此体系中时，不同的大分子即移动并聚焦于相当其等电点pH的位置，从而就可以达到以下两个目的：(1)依等电点的不同将两性大分子彼此分离，从而可以高分辨率地用于分析和制备。(2)测定等电点，以鉴定蛋白质。在等电聚焦后测定蛋白质最高浓度部位的pH，即其等电点(PI)。本讲稿第二十四页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 它具有分辨率高(0.01pH单位)、抵消扩散作用、可使很稀的样品达到高度浓缩等优点；并且可在一次实验中测出等电点，
23、其精确度和重复性为0.01pH单位。而用自由界面电泳测等电点，则需要在4种离子强度、2个高于其等电点和2个低于其等电点的pH条件下，做16个实验才能确定。这种方法要求有稳定的pH梯度，所以要求有一种防止对流和防止已分离区带再混合的措施。现有2种办法：密度梯度，这是一种最常用的经典办法；凝胶介质，包括聚丙烯酰胺凝胶和球形sephadex凝胶等。操作简单，可进行微量检验，便于进行分析比较研究，可同时做多份样品。此法的重要性正日益增加，区带对流，是在蛇形管道中进行，但由于难达到有效的冷却，所以使其迟迟得不到推广。本讲稿第二十五页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 三、电泳的应用三、电
24、泳的应用 许多生物胶体，如蛋白质、酶、核酸等有特征的电泳迁移率，此迁移率在很大程度上取决于溶液的pH。因此，利用电泳这种特征可分析鉴定物质。另外，由于电泳性质的高度特异性及方法本身的温和性，可对不稳定的生物大分子的进行分离纯化，有时这种方法比其他分离技术如沉淀、离心、层析等更为方便可靠。利用电泳技术甚至可作为具有一定规模产品的制备方法。四、四、电电泳泳应应用用实实例例 下面介绍利用电泳技术分离核酸的操作。利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA主要包括制胶、加样、电泳、染色和检出五个步骤。本讲稿第二十六页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 1 1制胶制胶 称取琼脂糖粉末，以pH8.0的乙酸
25、钠-Tris缓冲液（0.4 mol/L Tris、0.2 mol/L乙酸钠溶液、0.01 mol/L EDTA，用冰乙酸调到pH8.0）配成1%溶液。琼脂糖难溶，应于沸水浴中煮溶，或于高压锅中煮溶。将制胶模具垂直放置，周围用硅油（或其他密封物质）密封，或用夹子夹紧，以免胶液泄漏。溶液从顶部灌注。灌胶完成后从顶部插入梳子，以形成加样孔。梳子宽度取决于玻璃板的宽度，梳子的厚度和凝胶的厚度取决于隔板的厚度。室温下放置12小时，待胶柱呈灰白色半透明状态则表明已聚合完毕。本讲稿第二十七页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 2加样加样 加样前轻轻将梳子倾斜拔出，防止气泡陷入，用电极缓冲液淋
26、洗加样孔，吸出，再加适量电极缓冲液。取0.5g左右的样品，如为质粒DNA或它的EcoRI的酶解液，体积为50L左右，加入1/4体积的溴酚蓝-甘油指示剂混合后，用微量注射器小心地将样品加成一细窄带，否则影响电泳分辨率。如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近带的扩展。本讲稿第二十八页，共二十九页第二节第二节 电泳及其应用电泳及其应用 3电泳电泳 按说明书先在电泳槽的下槽中装入电极缓冲液。将聚合后的凝胶连同模具一起移入电泳槽中，在上槽中注入电极缓冲液，打开冷却循环系统，连接电源。一般起始电压约为7080V，然后不断升高。起始电流可设置为2030mA，取决于凝胶厚度、大小和样品数。待溴酚蓝前沿到达电泳槽底部（阳极时），切断电源，关掉冷却系统，取出凝胶，准备染色。4.染色染色 用菲啶溴红染色液浸泡凝胶10分钟，然后倒出染色液，将凝胶移到磨砂玻璃上。5检出检出 将凝胶板置于紫外灯下，约3分钟后可见到胶板中呈现具有红色荧光的条带，该条带标志着DNA所在位置。本讲稿第二十九页，共二十九页