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1、关于色谱分析法概论第1页，讲稿共65张，创作于星期三分析化学分析化学化学分析化学分析容量分析容量分析重量分析重量分析仪器分析仪器分析光学分析光学分析电化学分析电化学分析色谱分析色谱分析质谱分析质谱分析热分析等热分析等紫外紫外-可见吸收光谱法可见吸收光谱法原子吸收光谱法原子吸收光谱法原子发射光谱法原子发射光谱法原子荧光光谱法原子荧光光谱法红外吸收光谱法红外吸收光谱法核磁共振波谱法核磁共振波谱法有有机机波波谱谱分分析析第2页，讲稿共65张，创作于星期三classification of instrument analytical method仪器分析电化学分析法光分析法色谱分析法热分析法分析仪器联
2、用技术质谱分析法第3页，讲稿共65张，创作于星期三1 1、电化学分析方法的分类、电化学分析方法的分类classification of electrochemical analysis电化学分析法电位分析法电解分析法电泳分析法库仑分析法极谱与伏安分析法电导分析法第4页，讲稿共65张，创作于星期三光分析法原子吸收法红外法原子发射法核磁法荧光法紫外可见法分子光谱分子光谱原子光谱原子光谱2 2、光分析方法的分类、光分析方法的分类第5页，讲稿共65张，创作于星期三classification of chromatographic analysis色谱分析法气相色谱法薄层色谱法液相色谱法激光色谱法电色谱
3、法超临界色谱法3、色谱分析方法的分类、色谱分析方法的分类第6页，讲稿共65张，创作于星期三4 4、其他分析方法的分类、其他分析方法的分类其他分析法质谱分析法联用技术热分析法第7页，讲稿共65张，创作于星期三第8页，讲稿共65张，创作于星期三色谱过程图解色谱过程图解组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离第9页，讲稿共65张，创作于星期三色谱过程色谱过程实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。第10页，讲稿
4、共65张，创作于星期三第一节第一节 色谱法发展与分类色谱法发展与分类 一、什么是色谱法一、什么是色谱法 色谱分析法简称色谱法(chromatography)，是一种物理或物理化学分离分析方法。1906年，植物色素分离，色带 第11页，讲稿共65张，创作于星期三图示固定相固定相固定相固定相CaCOCaCO3 3颗粒颗粒颗粒颗粒流动相流动相流动相流动相石油醚石油醚石油醚石油醚 色带色带第12页，讲稿共65张，创作于星期三定义、实质和目的定义、实质和目的定义：利用物质的物理化学性质建立的分离、分析方法实质：分离目的：定性分析或定量分析第13页，讲稿共65张，创作于星期三一、色谱法的历史发展1.新型固
5、定相和检测器的研制2.色谱新方法的研究3.色谱联用技术4.色谱专家系统第14页，讲稿共65张，创作于星期三俄国植物学家Tswett于1901年发现：利用吸附原理分离植物色素1903年发表文章：On a new category of adsorption phenomena and their application to biochemical analysis1906年Tswett 创立“chromatography”“色谱法”新名词1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管（一）色谱分析法的历史（一）色谱分析法的历史第15页，讲稿共65张，创作于星期三1930年R.
6、Kuhn用色谱柱分离出胡萝卜素1935年Adams and Holmes 发明了苯酚-甲醛型离子交换树脂，进一步发明了离子色谱1938年Izmailov 发明薄层色谱1941年Martin&Synge 发明了液-液分配色谱1944年Consden,Gordon&Martin 发明纸色谱第16页，讲稿共65张，创作于星期三1952年Martin&Synge 发明气-液色谱1953年Janak发明气-固色谱1954年Ray发明热导检测器1957年Martin&Golay 发明毛细管色谱1959年Porath&Flodin 发明凝胶色谱1960年液相色谱技术完善70年代离子色谱与薄层扫描80年代超临
7、界流体、毛细管电泳第17页，讲稿共65张，创作于星期三二、分类：二、分类：1按两相分子的聚集状态分：按两相分子的聚集状态分：流动相流动相 固定相固定相 类型类型液相色谱液相色谱液体 固体 液-固色谱液体 液体 液-液色谱气体 固体 气-固色谱气体 液体 气-液色谱气相色谱气相色谱超临界流体色谱法第18页，讲稿共65张，创作于星期三续前 2按操作方式分：按操作方式分：平面色谱平面色谱 纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱柱色谱柱色谱 填充柱色谱 毛细管柱色谱 电泳法第19页，讲稿共65张，创作于星期三3 3按分离机制分：按分离机制分：按分离机制分：按分离机制分：分配色谱分配色谱：利用分配系数的不同
8、吸附色谱吸附色谱：利用物理吸附性能的差异 离子交换色谱离子交换色谱：利用离子交换原理 空间排阻色谱空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同第20页，讲稿共65张，创作于星期三n3按分离机制分：按分离机制分：亲合色谱法亲合色谱法 化学键合相色谱法化学键合相色谱法 毛细管电泳法毛细管电泳法第21页，讲稿共65张，创作于星期三 定性参数定量参数柱效参数分离参数相平衡参数第二节第二节 色谱原理色谱原理 第22页，讲稿共65张，创作于星期三 色谱分离过程色谱分离过程 第23页，讲稿共65张，创作于星期三第24页，讲稿共65张，创作于星期三n n由过程可知，色谱法是利用混合物中各组分在两相中吸附、分配、离子交换
9、、亲和力、分子尺寸等差异，使固定相对各个组分的保留作用不同，当两相做相对运动时，不同组分产生反复多次的差速迁移而进行分离分析的方法。第25页，讲稿共65张，创作于星期三第三节经典液相色谱法n n一、吸附柱色谱法是根据吸附剂对样品中各组分吸附能力不同，在两相作相对运动时，导致各组分在色谱柱中产生差速迁移，使各组分流出色谱柱的时间不同而分离第26页，讲稿共65张，创作于星期三1.吸附作用与吸附平衡n n吸附剂一般为较大比表面积的多孔性固体颗粒，其表面有许多吸附活性位点。n n组分分子、流动相分子与吸附剂表面吸附活性位点之间吸附和洗脱速度相等时即达到吸附平衡。第27页，讲稿共65张，创作于星期三 固
10、定相固定相吸附剂（硅胶或吸附剂（硅胶或ALAL2 2O O3 3）具表面活性吸附中心具表面活性吸附中心吸附系数吸附系数吸附系数吸附系数注：注：注：注：K Ka a与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质 及温度有关及温度有关吸附平衡吸附平衡 X Xmm+nY+nYa aXXa a+nY+nYmm 第28页，讲稿共65张，创作于星期三图示分离机制：分离机制：分离机制：分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附吸附解吸
11、解吸再吸附再吸附再解吸再解吸无数次洗脱无数次洗脱分开分开 第29页，讲稿共65张，创作于星期三Ka的意义n n若Ka值较小，则说明该组分在固定相保留作用较弱，不易被吸附，迁移速度快，先流出柱。第30页，讲稿共65张，创作于星期三2.吸附等温线n n一定温度下，组分在吸附剂表面被吸附达到平衡时，组分在两相中浓度相对关系的曲线，称为吸附等温线（adsorption isotherm）n n横坐标为组分在流动相的浓度，纵坐标为在固定相的浓度。n n一般分为直线型、凸型和凹型三种第31页，讲稿共65张，创作于星期三凸形等温线n n吸附剂表面有不同吸附力的吸附剂表面有不同吸附力的位点，组分分子优先占据高
12、位点，组分分子优先占据高吸附力位点。在浓度较低时，吸附力位点。在浓度较低时，组分吸附牢靠较难洗脱，高组分吸附牢靠较难洗脱，高浓度时，吸附在低吸附位点浓度时，吸附在低吸附位点的组分分子吸附较为松散，的组分分子吸附较为松散，洗脱快，导致组分在浓度较洗脱快，导致组分在浓度较高区域迁移速度快于浓度较高区域迁移速度快于浓度较低区域，流出曲线为前缘陡低区域，流出曲线为前缘陡峭，后部托位的不对称峰形。峭，后部托位的不对称峰形。第32页，讲稿共65张，创作于星期三 柱色谱柱色谱色谱图色谱图 随时间随时间随时间随时间 t t 记录色谱流出曲线，即色谱图记录色谱流出曲线，即色谱图记录色谱流出曲线，即色谱图记录色谱
13、流出曲线，即色谱图I I I I t tR R WW t t0 0 t tR R h h WW h h/2/2 0.607 0.607h h o o WWb b t t 进样进样进样进样 空气空气空气空气 组分组分组分组分1 1 1 1 组分组分组分组分2 2 2 2 （惰性物质）（惰性物质）（惰性物质）（惰性物质）tR保留时间t0死时间第33页，讲稿共65张，创作于星期三（二）固定相与流动相n n1.固定相n n（1）基本要求：均匀、坚固颗粒，吸附力强且可逆，不发生化学反应及溶解。n n（2）常用吸附剂 硅胶、氧化铝第34页，讲稿共65张，创作于星期三2.流动相n n（1）基本要求：纯度合格
14、、溶解样品、粘度小，性质稳定，可挥发便于回收样品n n（2）选择n n从试样、吸附剂和流动相三个方面考虑。n n相似相溶、混合溶剂、梯度洗脱第35页，讲稿共65张，创作于星期三（二）分配柱色谱法（二）分配柱色谱法流动相流动相必须与固定相不为互溶必须与固定相不为互溶 载体载体惰性，性质稳定，惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应不与固定相和流动相发生化学反应 固定与流动相均为液体，液态固定相是固定液被涂渍在惰性材料载体上构成固定相第36页，讲稿共65张，创作于星期三（二）分配色谱法（二）分配色谱法分配系数分配系数分配系数分配系数注：注：K K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质与组分
15、的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关以及柱温有关 利用被分离的各个组分在互不相溶的固定相与流动相中的溶解度不同而使试样组分在两相间不断产生分配平衡。第37页，讲稿共65张，创作于星期三图示分离机制分离机制分离机制分离机制 利利利利用用用用组组组组分分分分在在在在流流流流动动动动相相相相和和和和固固固固定定定定相相相相间间间间溶溶溶溶解解解解度度度度差差差差别别别别实实实实现现现现分分分分离离离离连续萃取过程。分配系数大越易分离。连续萃取过程。分配系数大越易分离。第38页，讲稿共65张，创作于星期三（二）固定相和流动相n n1.固定相 将固定液涂渍在一定粒度的载体上构成。载体（又称担
16、体）仅起负载一定量固定液的作用。固定液是样品的良好溶剂，不溶或很难溶于流动相第39页，讲稿共65张，创作于星期三分配色谱法两种类型n n1.正相色谱法：用极性溶液作固定液，用非极性或弱极性溶液做流动相，分离极性化合物。n n2.反相色谱法：用非极性或弱极性溶液作固定液，用极性溶液做流动相，分离非极性或弱极性化合物。第40页，讲稿共65张，创作于星期三（三）离子交换色谱法（三）离子交换色谱法 网状立体结构的高分子聚合物，带有许多活性基团，一部分为与骨架相连的带负电荷的阴离子基团或带正电荷的阳离子基团等不可交换的离子基团，另一部分是这些离子基团上结合的与其电性相反的可交换的离子。第41页，讲稿共6
17、5张，创作于星期三（三）离子交换色谱法（三）离子交换色谱法 固定相固定相离子交换树脂离子交换树脂流动相流动相水为溶剂的缓冲溶液水为溶剂的缓冲溶液被分离组分被分离组分离子型的有机物或无机离子型的有机物或无机阳离子交换树脂阴离子交换树脂强酸性弱酸性强碱性弱碱性第42页，讲稿共65张，创作于星期三图示分离机制：分离机制：分离机制：分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离不同而实现分离不同而实现分离不同而实现分离第43页，讲稿共65张，创作于星期三（三
18、）离子交换色谱法（三）离子交换色谱法选择性系数选择性系数选择性系数选择性系数 阳离子交换树脂阳离子交换树脂 RSORSO3 3-H H+X+X+RSO RSO3 3-X X+H+H+注：注：K Ks s与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关离子交换树脂性质以及温度有关固定离子固定离子固定离子固定离子可交换离子可交换离子可交换离子可交换离子待测离子待测离子待测离子待测离子第44页，讲稿共65张，创作于星期三离子交换树脂的主要性能n n1.交联度：X7，交联度大，树脂网眼小，大离子难进入，交换速度慢，选择性好。n n2.交换
19、容量：即能参加交换反应含有的活性基团数，一般为110mmol/g。n n3.粒度：以溶胀后能通过的筛孔目数表示。第45页，讲稿共65张，创作于星期三离子交换色谱法的流动相n n组分离子的保留值可通过调节流动相的pH值或离子强度来控制。n n多采用各种缓冲液来控制流动相的pH值第46页，讲稿共65张，创作于星期三四、尺寸排阻色谱法n n凝胶色谱法；空间排阻色谱法n n以多孔凝胶为固定相，按照分子大小顺序对试样中组分进行分离。流动相流动相水水凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱 流动相流动相有机溶剂有机溶剂凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱 第47页，讲稿共65张，创作于星期三分离机制分离机制分离机制分离机制：利用被测
20、组分分子大小不同、在固定相上选择性利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离渗透实现分离渗透实现分离渗透实现分离第48页，讲稿共65张，创作于星期三n n聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶亲水性凝胶等作固定相n n以水或水溶液做流动相第49页，讲稿共65张，创作于星期三 小结：小结：n n四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡 K K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系分别为吸附系数，狭
21、义分配系数，选择性系数和数和 渗透系数渗透系数n n除除了了凝凝胶胶色色谱谱法法中中的的K K仅仅与与待待测测分分子子大大小小尺尺寸寸、凝凝胶胶孔孔径径大大小小有有关关外外，其其他他三三种种K K值值都都受受组组分分的的性性质质、流流动动相相的的性性质质、固固定定相相的的性性质质以以及及柱柱温温的的影响影响第50页，讲稿共65张，创作于星期三图示第51页，讲稿共65张，创作于星期三第四节 平面色谱法n n是将固定相涂铺成平面层状，色谱分离在此平面上进行，为开放式的离线操作。n n薄层色谱法、纸色谱法、薄层电泳法第52页，讲稿共65张，创作于星期三一、薄层色谱法n n按原理可分为吸附、分配、离子
22、交换和尺寸排阻法第53页，讲稿共65张，创作于星期三（一）基本原理n n将固定相（吸附剂）均匀地涂抹在光洁表面上，将待将固定相（吸附剂）均匀地涂抹在光洁表面上，将待测试样点在一端的起始线上，再把点样后的薄层板放测试样点在一端的起始线上，再把点样后的薄层板放进密闭容器中，使薄层板的底端浸入适当的溶剂进行进密闭容器中，使薄层板的底端浸入适当的溶剂进行展开。展开。n n借助薄层板上吸附剂的毛细管作用，溶剂会载带分借助薄层板上吸附剂的毛细管作用，溶剂会载带分离组分向前移动展开，因各组分吸附能力不同，所离组分向前移动展开，因各组分吸附能力不同，所以组分移动速率不同，一定时间后各组分彼此分离，以组分移动速
23、率不同，一定时间后各组分彼此分离，在板上形成不同距离的斑点在板上形成不同距离的斑点第54页，讲稿共65张，创作于星期三（二）固定相与流动相n n1.固定相n n常用氧化铝和硅胶，也可选用硅藻土、聚酰胺和纤维素等第55页，讲稿共65张，创作于星期三2.流动相n n也称展开剂第56页，讲稿共65张，创作于星期三 薄层色谱薄层色谱薄层色谱薄层色谱 0.25mm 0.25mm 厚厚厚厚 纤维素，硅胶纤维素，硅胶纤维素，硅胶纤维素，硅胶 玻板玻板玻板玻板 纸色谱法纸色谱法纸色谱法纸色谱法 滤纸，又称纸层析法，以纸为载体的色谱法。滤纸，又称纸层析法，以纸为载体的色谱法。滤纸，又称纸层析法，以纸为载体的色谱
24、法。滤纸，又称纸层析法，以纸为载体的色谱法。第57页，讲稿共65张，创作于星期三薄层色谱的操作步骤薄层色谱的操作步骤n n1 1薄层板的制备薄层板的制备薄层板的制备薄层板的制备 使表面均匀光滑且厚度为使表面均匀光滑且厚度为使表面均匀光滑且厚度为使表面均匀光滑且厚度为0.2mm0.2mm1mm1mm，在在在在110110下活化下活化下活化下活化30min30min，冷后，备用。，冷后，备用。，冷后，备用。，冷后，备用。2 2点样点样点样点样 每个斑点直径不超过每个斑点直径不超过每个斑点直径不超过每个斑点直径不超过0.3cm0.3cm，间距为，间距为，间距为，间距为1cm1cm1.5cm1.5cm
25、为宜。为宜。为宜。为宜。3 3展开展开展开展开 注意：点样斑点必须保持在展开剂液面之上。展开剂注意：点样斑点必须保持在展开剂液面之上。展开剂注意：点样斑点必须保持在展开剂液面之上。展开剂注意：点样斑点必须保持在展开剂液面之上。展开剂升到距离顶端升到距离顶端升到距离顶端升到距离顶端1cm1cm1.5cm1.5cm）或各组分已分开时，取出，标）或各组分已分开时，取出，标）或各组分已分开时，取出，标）或各组分已分开时，取出，标出前沿位置。出前沿位置。出前沿位置。出前沿位置。第58页，讲稿共65张，创作于星期三n n4 4显色显色显色显色 (1)(1)紫外灯照射法紫外灯照射法紫外灯照射法紫外灯照射法
26、(2)(2)碘蒸气法：碘蒸气法：碘蒸气法：碘蒸气法：(3)(3)碳化法：碳化法：碳化法：碳化法：(4)(4)专属显色剂显色法：专属显色剂显色法：专属显色剂显色法：专属显色剂显色法：n n5 5R Rf f值的计算值的计算值的计算值的计算第59页，讲稿共65张，创作于星期三 仪器和试剂仪器和试剂n n载玻片，烘箱，烧杯，点样毛细管，层析缸，铅笔载玻片，烘箱，烧杯，点样毛细管，层析缸，铅笔载玻片，烘箱，烧杯，点样毛细管，层析缸，铅笔载玻片，烘箱，烧杯，点样毛细管，层析缸，铅笔n n硅胶硅胶硅胶硅胶GG，1%1%偶氮苯对照品溶液，偶氮苯对照品溶液，偶氮苯对照品溶液，偶氮苯对照品溶液，0.01%0.0
27、1%对对对对-二甲氨基偶氮苯对二甲氨基偶氮苯对二甲氨基偶氮苯对二甲氨基偶氮苯对照品溶液，偶氮苯和对照品溶液，偶氮苯和对照品溶液，偶氮苯和对照品溶液，偶氮苯和对-二甲氨基偶氮苯样品溶液二甲氨基偶氮苯样品溶液二甲氨基偶氮苯样品溶液二甲氨基偶氮苯样品溶液n n展开剂（四氯化碳：氯仿展开剂（四氯化碳：氯仿展开剂（四氯化碳：氯仿展开剂（四氯化碳：氯仿=7=7：3 3）第60页，讲稿共65张，创作于星期三n n【实验装置】前沿线色斑起始线图3-6 薄层色谱示意图第61页，讲稿共65张，创作于星期三定性分析与定量分析n n斑点Rf f值定性n n斑点原位薄层扫描定性n n洗脱定量第62页，讲稿共65张，创作于星期三薄层色谱法n n纸色谱法（纸层析法）第63页，讲稿共65张，创作于星期三纸色谱法（纸层析法）第64页，讲稿共65张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第65页，讲稿共65张，创作于星期三