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1、仪仪 器器 分分 析析INSTRUMENTAL ANALYSIS 教教 师：师： 谢谢 宝宝 平平电化学分析电化学分析紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法荧光分析法荧光分析法红外光谱法红外光谱法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法核磁共振波谱法核磁共振波谱法质谱法质谱法仪器分析方法仪器分析方法消除干扰消除干扰加入掩饰剂加入掩饰剂控制分析条件控制分析条件分离出待测物质分离出待测物质复杂组分分析复杂组分分析(1) (1) 将被测组分从复杂体系中分离后测定将被测组分从复杂体系中分离后测定(2) (2) 把对测定有干扰的组分分离除去把对测定有干扰的组分分离除去(3) (3) 将性质相近的组分相互分开将
2、性质相近的组分相互分开(4) (4) 把微量或痕量的待测组分分离富集把微量或痕量的待测组分分离富集 复杂组分分析复杂组分分析常用分离方法常用分离方法蒸馏分离法蒸馏分离法重结晶分离法重结晶分离法沉淀沉淀分离法分离法溶剂萃取分离法溶剂萃取分离法超临界萃取超临界萃取离子交换分离法离子交换分离法膜分离技术膜分离技术色谱分离方法色谱分离方法分离前的体系：均相；两组分分离前的体系：均相；两组分A A、B B的分离的分离分离体系总是两相：液分离体系总是两相：液- -液；液液；液- -固；气固；气- -液液图谱 An Introduction to Chromatography（chromatography）
3、色谱分析法概论色谱分析法概论色谱分析法色谱分析法M种化合物化合物1 化合物2 化合物3 化合物4 化合物M。分离高效能的物理分离高效能的物理分离检测手段检测手段检测检测+碳酸钙粉末（固定相）色素混合液石油醚 (流动相）色谱柱色谱色：颜色谱：图谱1906年，Tsweet发明的色谱法 装碳酸钙固体颗粒的玻璃管装碳酸钙固体颗粒的玻璃管 色谱柱（色谱柱（column）碳酸钙固体粉末碳酸钙固体粉末 固定相（固定相（stationary phase）洗涤用的石油醚洗涤用的石油醚 流动相（流动相（mobile phase） 或洗脱剂（或洗脱剂（eluent）几个概念几个概念年代发明者发明的色谱方法或重要应用
4、19061906TswettTswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。19311931Kuhn, LedererKuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离、和和-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。19381938IzmailovIzmailov, , ShraiberShraiber最先使用薄层色谱法。最先使用薄层色谱法。19381938Taylor, UrayTaylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941
5、1941Martin, SyngeMartin, Synge提出色谱塔板理论；发明液提出色谱塔板理论；发明液- -液分配色谱；预言了气体可作为流动相。液分配色谱；预言了气体可作为流动相。19441944ConsdenConsden等等发明了纸色谱。发明了纸色谱。19491949MaclleanMacllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。19521952Martin, JamesMartin, James从理论和实践方面完善了气从理论和实践方面完善了气- -液分配色谱法。液分配色谱法。19561956Van
6、DeemterVan Deemter等等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。19571957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。19581958GolayGolay发明毛细管柱气相色谱。发明毛细管柱气相色谱。19591959Porath, FlodinPorath, Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。发表凝胶过滤色谱的报告。19641964MooreMoore发明凝胶渗透色谱。发明凝胶渗透色谱。19651965GiddingsGiddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。发展了色谱理论，为色
7、谱学的发展奠定了理论基础。19751975SmallSmall发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。的新型离子色谱法。19811981JorgensonJorgenson等等创立了毛细管电泳法。创立了毛细管电泳法。色谱法的发展色谱法的发展色谱法的发展色谱法的发展n1948年，年，Tiselins，电泳和吸附分析，电泳和吸附分析n1952年，年，Martin和和Synge，分配色谱，分配色谱n2002年，年，John B. Fenn，Koichi Tanaka：生物：生物大分子的质谱分析法
8、大分子的质谱分析法 诺贝尔奖：诺贝尔奖：色谱法的发展色谱法的发展现在：现在： 固定相除了固体，还可以是液体 流动相液体或气体 色谱柱各种材质和尺寸 被分离组分不再仅局限于有色物质p色谱学是现代分离科学的基础；色谱学是现代分离科学的基础；p色谱法是目前分析复杂混合物不可色谱法是目前分析复杂混合物不可缺少的技术；缺少的技术；p色谱法色谱法在各个学科和领域有着广泛的在各个学科和领域有着广泛的应用应用。色谱法的发展色谱法的发展智能化、自动化、在线式智能化、自动化、在线式高效、联用技术高效、联用技术多维色谱多维色谱微分离微分离发展方向：发展方向：参考书：参考书：仪器分析仪器分析，叶宪曾，北京大学出版社，
9、第，叶宪曾，北京大学出版社，第2 2版版 色谱技术丛书色谱技术丛书气相色谱检测方法气相色谱检测方法，吴烈钧，吴烈钧气相色谱方法及应用气相色谱方法及应用， 刘虎威刘虎威液相色谱检测方法液相色谱检测方法，云自厚，云自厚高效液相色谱方法及应用高效液相色谱方法及应用，何丽一，何丽一离子色谱方法及应用离子色谱方法及应用，牟世芬，牟世芬毛细管电泳技术及应用毛细管电泳技术及应用，陈义，陈义色谱法色谱法(chromatography)： 以试样组分在以试样组分在固定相和流动相固定相和流动相间的间的作用的作用的差异差异为依据而建立起来的各种为依据而建立起来的各种分离分析分离分析方法。方法。流动相流动相 固定相固
10、定相 类型类型液相液相色谱色谱LCLC液体液体 固体固体 液液-固色谱固色谱LSCLSC液体液体 液体液体 液液-液色谱液色谱LLCLLC气体气体 固体固体 气气-固色谱固色谱GSCGSC气体气体 液体液体 气气-液色谱液色谱GLCGLC气相气相色谱色谱GCGC超临界流体超临界流体超临界流体超临界流体色谱色谱SFCSFCcapillary electrochromatography，CEC） 纸色谱 薄层色谱 薄膜色谱paper chromatographythin layer chromatographythin film chromatographyplane chromatography
11、液-固色谱气相色谱键合相色谱法键合相色谱法capillary electrochromatography） u 分析用色谱仪u 制备用色谱仪优点：优点：“三高三高”、“一快一快”、“一广一广”缺点：缺点：实现色谱分析的基本条件实现色谱分析的基本条件相对运动的两相相对运动的两相流动相、固定相流动相、固定相 l吸附色谱吸附色谱：吸附：吸附 解吸解吸再吸附再吸附 再解吸再解吸 多次洗脱多次洗脱 差速迁移差速迁移 分离分离检测器色谱柱样品室纵坐标：检测器的响应信号纵坐标：检测器的响应信号横坐标：时间、体积或距离。横坐标：时间、体积或距离。检测器输出的信号强度对流出时间或体积检测器输出的信号强度对流出时
12、间或体积等所绘曲线等所绘曲线 色谱柱仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。色谱柱仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。基线基线噪音噪音：各种未知的偶然因素引起的基线起伏漂移漂移：基线向某个方向稳定移动（仪器未稳定造成）基线向某个方向稳定移动（仪器未稳定造成）噪音噪音漂移漂移流出曲线上的突起部分，检测器对组分的响应信号流出曲线上的突起部分，检测器对组分的响应信号色谱峰色谱峰色谱峰的个数：组分的最小个数色谱峰的个数：组分的最小个数fs =0.951.05拖尾因子(tailing factor, fs)又叫对称因子AW0.05hfs2=ABA2+=正常峰（对称峰）色谱峰fs 1.05前沿峰拖尾峰非正常峰
13、拖拖尾尾峰峰保留时间、死时间、调整保留时间保留时间、死时间、调整保留时间保留体积、保留体积、死体积调整保留体积死体积调整保留体积相对保留值相对保留值保留时间保留时间: : t tR R 进样到某组分色谱峰顶点的时间间隔，进样到某组分色谱峰顶点的时间间隔，即即组分组分 在色谱柱中的停留时间在色谱柱中的停留时间或组分流经色谱柱所需要的时间。或组分流经色谱柱所需要的时间。死时间：死时间：t t0 0 分配系数为零的组分的保留时间，分配系数为零的组分的保留时间，即即组分在流组分在流 动相中的停留时间动相中的停留时间或流动相流经色谱柱所需要的时间或流动相流经色谱柱所需要的时间.调整保留时间：调整保留时间
14、：t tR R = = t tR R -t -t0 0，是是组份在固定相中的滞留时间组份在固定相中的滞留时间保留体积：保留体积：VR 通过色谱柱所需流动相体积通过色谱柱所需流动相体积 V VR R = = t tR R F FC C F FC C为流动相流速为流动相流速死体积：死体积： V0 由进样器至监测器的流路中未被固定相占有的由进样器至监测器的流路中未被固定相占有的空间空间。 V V0 0 = t = t0 0 F FC C调整保留体积：调整保留体积：V R = VR-V0，与，与F FC C无关。无关。 相对保留值：相对保留值：r（也用（也用表示表示, 又称选择因子又称选择因子 ） 组
15、份的调整保留值之比，色谱系统的组份的调整保留值之比，色谱系统的选择性指标选择性指标。12121,2RRRRVVttr=峰高：峰高：h h 色谱峰顶点与基线的距离。色谱峰顶点与基线的距离。峰面积：峰面积：A A 色谱曲线与基线间包围的面积色谱曲线与基线间包围的面积标准差：标准差： 正态分布曲线上两拐点间距离的一半正态分布曲线上两拐点间距离的一半 0.607倍峰宽处的一半倍峰宽处的一半半峰宽：半峰宽： 峰高一半处的峰宽峰高一半处的峰宽 W1/2=2.355峰峰 宽：宽： (W) W=4 或或 W=1.699W1/2 色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离2
16、121)(2 )(211212WWttWWttRrrrr+=+=（五）分离效能指标（五）分离效能指标分离度分离度n分离度分离度 R R ：相邻两组分色谱峰保留时间之差与两色：相邻两组分色谱峰保留时间之差与两色谱峰宽度均值之比谱峰宽度均值之比R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间保留时间 t, minR 越大，相邻组分分离越好。当越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离时，分离程度可达程度可达99.7%，R=1.5常用作是否分开的判据常用作是否分开的判据 色谱峰数色谱峰数样品中单组份的最少个数；样品中单组份的最少个数； 色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据； 色谱峰高或面积色谱峰
17、高或面积定量依据；定量依据； 区域宽度区域宽度衡量色谱柱效；衡量色谱柱效； 分离度分离度组分分离效能程度。组分分离效能程度。色谱流出曲线的意义色谱流出曲线的意义mscc=溶质在流动相中的浓度溶质在固定相中的浓度KK K 与组分，固定相、流动相性质及温度与组分，固定相、流动相性质及温度有关有关 与两相体积、柱管特性和所用仪器与两相体积、柱管特性和所用仪器无关无关（一）描述分配过程的参数（一）描述分配过程的参数三、分配系数与色谱分离三、分配系数与色谱分离1 1、分配系数、分配系数 (K)(K)：mmssVcVck=msmm组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量2.保留因子保留因子(k)：分配比、
18、质量分配系数、容量因子分配比、质量分配系数、容量因子其中其中Vm V0，为流动相的体积为流动相的体积；Vs为固定相体积为固定相体积3. K 与与 k 的关系：的关系：msmmssVVKVcVck=k k与温度、压力、两相体积与温度、压力、两相体积有关有关（一）描述分配过程的参数（一）描述分配过程的参数三、分配系数与色谱分离三、分配系数与色谱分离（二）（二） t tR R 与与 K K、k k 的关系的关系: :)1 ()1 ()1 (00ktVKVtVKVttmsmsmR+=+=000tttttkRR=三、分配系数与色谱分离三、分配系数与色谱分离组分后出柱组分不保留组分完全保留（三）（三）色谱
19、分离的前提色谱分离的前提色谱分离的前提色谱分离的前提组分在两相间分配系数组分在两相间分配系数 K K 不同或分配比不同或分配比 k k 不同不同)( )()1 ( )1 (0000BAmsBARRRmsBRmsARkktVVKKttttVVKttVVKttBABA=+=+=一、吸附色谱法一、吸附色谱法二、分配色谱法二、分配色谱法三、三、 离子交换色谱法离子交换色谱法 四、四、空间排阻色谱法空间排阻色谱法利用吸附剂对不同组分吸附能力差异实现分离利用吸附剂对不同组分吸附能力差异实现分离吸附吸附解吸解吸再吸附再吸附再解吸再解吸无数次洗脱无数次洗脱分开分开为流动相中溶质分子为吸附剂表面溶质分子maXX
20、mmaaaVXSXK =为流动相的体积为吸附剂表面面积maVS 保留时间与Ka和Sa的关系为maamaaRVSKkVSKtt=+= )1 (0maamaaRVSKkVSKtt=+= )1 (0n烷烃非极性，不被吸附；烷烃非极性，不被吸附；n不饱和化合物比饱和化合物的吸附能力强；不饱和化合物比饱和化合物的吸附能力强；n基本母核相同，取代基极性越强，吸附能力越强基本母核相同，取代基极性越强，吸附能力越强mmssmsVXVXCCK=为流动相的体积为固定相的体积msVV 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离 为流动相中溶质分子为固定相表面溶质分子ma
21、XXGLCGLC：气体，常为氢气或氮气气体，常为氢气或氮气LLCLLC：与固定相不为互溶的液体与固定相不为互溶的液体CtabCtba正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱极性：极性：atR或或ttR，cCmaxuc随随t向峰两侧对称下降，向峰两侧对称下降，t越大，色谱柱流出的色谱峰越扁平越大，色谱柱流出的色谱峰越扁平u越小，峰越尖锐越小，峰越尖锐 nLH =222/12)(16)(54. 5)(WtWttnrrR=理论塔板数理论塔板数理论塔板高度理论塔板高度（柱长为（柱长为L L）根据色谱流出曲线导出根据色谱流出曲线导出3.3.塔板数和塔板高度塔板数和塔板高度柱效能指标 在死时间内不参与分配在死时间
22、内不参与分配!扣除死时间的影响，扣除死时间的影响，引入引入neff和和Heff作为柱效指标。作为柱效指标。222/ 12)(16)(54. 5)(WtWttnrrreff=effeffnLH=有效有效塔板数塔板数有效塔板高度有效塔板高度p 柱长柱长L一定时，一定时，n或或neff越大，越大，H或或Heff越小越小组分组分的分配次数越大，色谱峰越窄，柱效能越大；的分配次数越大，色谱峰越窄，柱效能越大；p 同一色谱柱对不同组分的柱效能不同，同一色谱柱对不同组分的柱效能不同，用用neff或或Heff衡量柱效能时，应指明测定物质。衡量柱效能时，应指明测定物质。p 柱长柱长L一定时，一定时，H增大，增大
23、，N减小，导致减小，导致W增大，色增大，色谱峰扩展谱峰扩展2)(16bReffWtn=2)(16nbRWt=MRttk=effNkkN21 +=effnkk2)1(n+=effHkk2)1(H+=当当 k 很小时，很小时，n与与neff，H与与Heff相差很大相差很大当当k 很大时，很大时，n与与neff，H与与Heff趋于一致趋于一致用用n或或H比较柱效时，应说明溶质的比较柱效时，应说明溶质的k 值值75（1）导出的流出曲线方程较好地解释了色谱峰）导出的流出曲线方程较好地解释了色谱峰形的正态分布规律形的正态分布规律（2）提出了评价柱效能指标：）提出了评价柱效能指标：N和和H，Neff和和He
24、ff4、塔板理论的贡献：765、塔板理论的不足：（1 1）没有考虑动力学因素对色谱过程的影响，）没有考虑动力学因素对色谱过程的影响，不能解释载气流速不能解释载气流速u对理论塔板数对理论塔板数n n的影响的影响（2 2）不能回答色谱峰为什么发生变形）不能回答色谱峰为什么发生变形（3 3）不能说明塔板高度受什么因素影响）不能说明塔板高度受什么因素影响二、二、 速率理论速率理论影响柱效的因素影响柱效的因素速率理论速率理论（Rate theory） 1956年，荷兰化学工程师年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板谱过程动力学速率理论：吸收了塔
25、板理论中的板高高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了程，从而给出了van Deemter方程：方程：涡流扩散项涡流扩散项分子扩散项分子扩散项塔板高塔板高传质阻力项传质阻力项A A，B B，C C为常数为常数u为载气的平均线速度为载气的平均线速度CuuBAH+ + += =速率方程（速率方程（van van DeemterDeemter方程式）方程式）n 当当u u一定时，一定时，减小减小A A、B B、C C三项可提高柱效三项可提高柱效n 在在A A、B B、C C较小时，较小时，H H较小，柱效较高；较小，柱效较高；n 反之则柱效较低，
26、色谱峰将展宽。反之则柱效较低，色谱峰将展宽。填充物颗粒大小及填充的不均匀性填充物颗粒大小及填充的不均匀性同一组分运行路线长短不同同一组分运行路线长短不同流出时间不同流出时间不同，峰形展宽峰形展宽1）涡流扩散项）涡流扩散项 (A)1）涡流扩散项）涡流扩散项 (A)使用细粒固定相并填充均匀可减小使用细粒固定相并填充均匀可减小A，提高柱效，提高柱效对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。展宽程度以展宽程度以A A表示：表示： A=2A=2 d dp p其中其中d dp p填充物平均直径；填充物平均直径； 填充不规则因子。填充不规则因子。2）分子扩散项）分子扩散项 (B
27、/u) 称为弯曲因子，固定相对分子扩散阻碍情况称为弯曲因子，固定相对分子扩散阻碍情况D D组分在流动相中的扩散系数组分在流动相中的扩散系数由于浓度梯度引起的由于浓度梯度引起的B = 2B = 2 D Dp 球状颗粒；球状颗粒；p 大分子量流动相；大分子量流动相；p 适当增加流速；适当增加流速；讨论：讨论： 分子量大的组分，分子量大的组分，Dg小，即小，即B小小 Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；随柱温升高而增加，随柱压降低而减小； 流动相分子量大，流动相分子量大，Dg 小，即小，即 B 小；小； u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小；增加，组份停留时间短，纵向扩散小； 对于液相色谱，因
28、对于液相色谱，因Dm 较小，较小，B 项可勿略。项可勿略。B=2 Dp 短柱；短柱；p 低温。低温。2）分子扩散项）分子扩散项 (B/u)3）传质阻力项）传质阻力项 (Cu)传质阻力的存在，使分配不能传质阻力的存在，使分配不能“瞬间瞬间”达至平衡，因达至平衡，因此产生峰形展宽。此产生峰形展宽。a）气液色谱：气体为流动相，）气液色谱：气体为流动相，C 包括气相传质包括气相传质阻力系数阻力系数 Cs 和液相传质阻力系数和液相传质阻力系数 Cl 。流动相流动相固液界面固液界面固定液固定液组分分子组分分子ClCg3）传质阻力项）传质阻力项 (Cu)降低传质阻力方法：降低传质阻力方法：减小担体粒度，选择
29、减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气。小分子量的气体作载气。)1 (32)1 (01. 022222lfgplgDdkkDdkkCCC+=+=k k为分配比；为分配比； D Dg g 、D DL L为扩散系数；为扩散系数；d dp p为为填充填充物大小；物大小； d df f液膜厚度液膜厚度a）气液色谱：）气液色谱：3）传质阻力项）传质阻力项 (Cu) smb）液液色谱：）液液色谱：液体为流动相，液体为流动相，传质阻力项传质阻力项 C 包括流动相传质阻力系数包括流动相传质阻力系数 Cm 和固定相传质阻和固定相传质阻力系数力系数 Cs 。3）传质阻力项）传质阻力项 (Cu)sfsmpsmmsD
30、dDdCCC22m)(+=+=降低降低C C的方法：的方法：细颗粒固定相、增加组分在细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数固定相和流动相中的扩散系数D等等K K：分配比分配比 D Dm m 、D Ds s：扩散系数：扩散系数D Dp p：填充物大小填充物大小 d df f：液膜厚度液膜厚度3）传质阻力项）传质阻力项 (Cu)4 4）流速）流速u uH = A + B/u + Cul涡流扩散项涡流扩散项A与流速与流速u无关；无关；l低流速区低流速区，分子扩散项分子扩散项 (B/u)(B/u) 大大 分子量大气体如分子量大气体如N2和和Ar为载气提高柱效为载气提高柱效l高流速区，高流速
31、区，传质阻力项传质阻力项 (Cu)(Cu)大大 分子量小气体如分子量小气体如H2和和He为载气提高柱效为载气提高柱效l曲线最低点对应最佳线速曲线最低点对应最佳线速uopt下最小板高下最小板高Hminl采用较采用较u uoptopt略高的线速度缩短分析时间略高的线速度缩短分析时间板高，板高，H(cm)HminA+B/u+CuCsuAB/uH-u曲线曲线min2()smHAB CC=+（1 1）阐述了色谱因素（）阐述了色谱因素（柱温、色谱柱填充的均匀程柱温、色谱柱填充的均匀程度、填料颗粒的大小、流动相的种类、流动相的流度、填料颗粒的大小、流动相的种类、流动相的流速、固定相的液膜厚度等速、固定相的液膜厚度等）对柱效能的影响情况）对柱效能的影响情况 Van Deemter Van Deemter 方程的贡献方程的贡献（3 3）为色谱分析工作选择最佳分离条件提供理论依据）为色谱分析工作选择最佳分离条件提供理论依据（2 2）较好地解释了色谱峰扩展的原因）较好地解释了色谱峰扩展的原因二、二、 速率理论速率理论影响柱效的因素影响柱效的因素