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1、关于蛋白质组学关于蛋白质组学(3)第1页，讲稿共45张，创作于星期三目录目录蛋白质组概念的提出蛋白质组概念的提出蛋白质组学的主要研究进展蛋白质组学的主要研究进展蛋白质组学的研究技术蛋白质组学的研究技术蛋白质组学的应用蛋白质组学的应用发展趋势发展趋势第2页，讲稿共45张，创作于星期三 从基因组学到蛋白质组学从基因组学到蛋白质组学 -人类迈入后基因组时代人类迈入后基因组时代20世纪生命科学的辉煌成就世纪生命科学的辉煌成就v20世纪上半叶，以遗传学为代表，以DNA双螺旋结构的提出而告捷；v20世纪下半叶，以分子生物学为代表，以“中心法则”的问世，DNA重组技术诞生而集大成；v20世纪90年代，“人类
2、基因组计划（humangenomeproject，HGP）”的提出。第3页，讲稿共45张，创作于星期三v基因组计划的局限：4060%的基因编码的蛋白质的功能是未知的。v常规功能基因组研究方法的局限性：常规大规模基因表达检测技术，无法精确反映蛋白质的质与量，组织中mRNA的丰度与蛋白质的丰度并不完全一样。因为基因到蛋白质存在三个层次的调控；蛋白质复杂的后修饰无法从mRNA水平来判断。第4页，讲稿共45张，创作于星期三1 蛋白质组概念的提出蛋白质组概念的提出蛋白质组蛋白质组(proteome)一词是澳大利亚Macquarie大学Wilkins和Williams在1994年首次提出，最早见于文献是在
3、1995年7月Electrophoresis杂志上，是指由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。蛋白质组学（蛋白质组学（Proteomics）是研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织基因组表达的全部蛋白质。Wilkins第5页，讲稿共45张，创作于星期三 基因组是确定的，组成某个体的所有细胞共同享有固定的基因组。基因组基因组 蛋白质组是一个空间和时间上动态变化着的整体。各个基因的表达调控及表达程度会根据时间，空间和环境条件发生显著的变化，所以，不同器官，组织或细胞内拥有不同的蛋白质组。蛋白质组蛋白质组蛋白质组与基因组的关系蛋白质组与基因组的关系第6页，讲稿共45张，创作于星期三蛋白质
4、组学研究势在必行！蛋白质组学研究势在必行！基因是遗传信息的源头，蛋白质是基因功能的执行者。传统的蛋白质研究只是针对生命活动中某一种或几种蛋白质，难以系统透彻地分析生命活动的基本机制。大规模，全方位的蛋白质组研究势在必行！第7页，讲稿共45张，创作于星期三2 蛋白质组学的主要研究进展蛋白质组学的主要研究进展 2.1 国际蛋白质组学的研究进展国际蛋白质组学的研究进展1996年，澳大利亚建立了世界上第一个第一个蛋白质组研究中心：AustraliaProteomeAnalysisFacility(APAF)。美国国立癌症研究所（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。独
5、立完成人类基因组测序的 Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据的工作。第8页，讲稿共45张，创作于星期三2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（HumanProteomeOrganization,HUPO），随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（HumanProteomeProject，HPP）。第9页，讲稿共45张，创作于星期三国际蛋白质组学会议*1997年 法国 第一届；*1998年 美国旧金山 第二届；*2004年10
6、月 中国北京 第三届；*2009年9月 加拿大多伦多 第八届*首届国际蛋白质组学高峰论坛贺福初院士贺福初院士成就奖成就奖第10页，讲稿共45张，创作于星期三2.2 我国蛋白质组学的研究进展我国蛋白质组学的研究进展我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO）。科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。第11页，讲稿共45张，创作于星期三中国蛋白质组学学术大会中国蛋白质组学学术大会2003年8月 长沙
7、 第一届学术大会；2004年8月 大连 第二届学术大会；2005年7月 长春 第三届学术大会；2006年8月 西安 第四届学术大会；2007年8月 广州 第五届学术大会；2009年7月 泰州 第六届学术大会。第12页，讲稿共45张，创作于星期三 挥向肝病的科技利剑挥向肝病的科技利剑-人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划据世界卫生组织统计，全球有3.5亿乙肝病毒携带者，其中中国占50%。全世界每年新增100万肝癌患者，一半发生在中国。肝炎已经成为中国第一大疾病，肝癌成为中国恶性肿瘤的一大杀手。2002年，北京蛋白质组研究中心主任贺福初院士领衔的中国科学家团队率先提出了“人类肝脏蛋白质组计划（
8、HLPP）”，并得到了国际同行的广泛响应。2004年底正式启动的“中国人类肝脏蛋白质组计划”，得到了“863”计划、“973”项目、重大国际合作项目等的联合资助，资金超过8000万元。第13页，讲稿共45张，创作于星期三 贺福初，中国科学院院士，第三世界科学院院士。现任北京蛋白质组研究中心主任，军事医学科学院院长。兼任“人类肝脏蛋白质组计划“共同执行主席，国际人类蛋白质组组织理事，亚太人类蛋白质组组织副理事长，资深编辑，执行编辑，编委，中国人类蛋白质组组织主席，中国遗传学会副理事长，中国生物物理学会副理事长。贺福初院士贺福初院士第14页，讲稿共45张，创作于星期三在这次国际重大科研合作中，我国
9、作为发展中国家，将承担其中30%的工作量。而此前，中国曾参与过由美国领导的“人类基因组计划”，仅承担过其中1%的工作任务，是中中国国科科学学家家首首次次领领衔衔的的重重大大国国际际科科技技合合作作计计划划。领导“人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）”的中国科学家宣布，他们有望用一种与电脑连接的生物芯片，通过验血的方式，准确地找出各类肝炎及肝癌的致病原因，既减轻了病人的诊断痛苦，又能做到对症下药。第15页，讲稿共45张，创作于星期三人类肝脏蛋白质组计划人类肝脏蛋白质组计划取得阶段性新进展取得阶段性新进展几年来围绕人类肝脏蛋白质组的表达谱、修饰谱及其相互作用的连锁图等九大科研任务，测定出6788个高可
10、信度的中国成人肝脏蛋白质，系统构建了国际上第一张人类器官蛋白质组“蓝图”；发现了包含1000余个“蛋白质-蛋白质”相互作用的网络图；建立了2000余株蛋白质抗体。第16页，讲稿共45张，创作于星期三3 蛋白质组学的研究技术蛋白质组学的研究技术样品的制备样品的制备蛋白质分离技术蛋白质分离技术蛋白质鉴定技术蛋白质鉴定技术生物信息学分析生物信息学分析第17页，讲稿共45张，创作于星期三3.1样品的制备制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白)；防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀；防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）；完全去除样品中的核酸
11、和某些干扰蛋白；尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。第18页，讲稿共45张，创作于星期三3.1.1去除高丰度蛋白去除高丰度蛋白质后可以加大蛋白样品的上样量，使一些低丰度的蛋白质含量达到检测的灵敏度范围。以血清蛋白质组学为例，血清类样品中的白蛋白和其他10种高丰度蛋白质的含量占其总蛋白量的90%，像细胞因子一类的低丰度蛋白质含量仅为1-5pg/mL，所以去除血浆中高丰度蛋白质是研究其中的低丰度蛋白质的必要步骤。第19页，讲稿共45张，创作于星期三 由图可见未处理样品中高丰度的白蛋白会影响掩盖其他蛋白，除去白蛋白等高丰度蛋白则使得先前未能检测到的一些蛋白得到显示。第
12、20页，讲稿共45张，创作于星期三3.1.2增加样品溶解性变性剂变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，其典型代表是尿素和硫尿。还原剂还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。表面活性剂表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS。起载体作用的两性电解质起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其
13、处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。第21页，讲稿共45张，创作于星期三3.2 蛋白质分离技术蛋白质分离技术3.2.1 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)双向凝胶电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术，具有简便、快速、高分辨率等优点。1975年，意大利生化学家OFarrell发明了双向电泳技术，大大提高了蛋白质分离的分辨率而得以广泛应用，至今经历了30多年的发展，双向电泳技术已较为成熟。第22页，讲稿共45张，创作于星期三双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳的原理第一向电泳第一向电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳(Iso-E
14、lectricFocusing，IEF)，蛋白质因等电点不同而被分离；第二向电泳第二向电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白质因分子量的不同被分离开。第23页，讲稿共45张，创作于星期三双向凝胶电泳双向凝胶电泳双向凝胶电泳双向凝胶电泳第24页，讲稿共45张，创作于星期三20世纪80年代开始采用固相化pH梯度技术（immobilizedpHgradients，IPG），可以随意精确设定pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题，这是
15、双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突突破破。第25页，讲稿共45张，创作于星期三其他技术其他技术高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）基于样品分子在固定相(柱填料)和流动相(淋洗液)之间的特殊相互作用而实现样品的分离。常用于相对分子质量小于ll03的蛋白质、膜蛋白及低丰度蛋白质的分离。毛细管电泳技术毛细管电泳技术（CE）是在高电场强度作用下，对毛细管(内径5-10m)中的样品按分子质量、电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离。第26页，讲稿共45张，创作于星期三3.3 蛋白质鉴定技术蛋白质鉴定技术-质谱技术质谱技术(mass spectrometry，MS)蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定
16、电泳分离后的蛋白质。该技术是一种超灵敏的鉴定技术，从理论上说，仅需极少量的样品就可以获得错误率低于1/1000000的精确结果。可将现行的质谱仪简单地分为三个连续的组成部分，即离子源、离子分离区和检测器。第27页，讲稿共45张，创作于星期三 质谱分析法是通过对样品离子的质荷比和强度的测定来进行定性和定量分析的一种分析方法。质谱分析法的过程是：首先将样品气化为气态分子或原子，然后将其电离失去电子，成为带正电离子，再将离子按质荷比大小顺序排列起来，测量其强度，得到质谱图。横坐标为质荷比，纵坐标为每种带电离子的相对丰度。通过质荷比可以确定离子的质量，从而进行样品的定性分析和结构分析。通过每种离子的峰
17、高可以进行定量分析。第28页，讲稿共45张，创作于星期三目前最常用的是：基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorptionionizationtime-of-flightspectrometry，MALDI-TOF）电喷雾质谱（electrosprayionization，ESI-MS）第29页，讲稿共45张，创作于星期三3.4生物信息学分析生物信息学是蛋白质组学研究中不可缺少的组成部分，它为2D-PAGE图像的分析比较及蛋白质鉴定等提供了方便快捷的帮助和大量信息。蛋白质组生物信息学主要包括：蛋白质组数据库相关的工具软件第30页，讲稿共45张，创
18、作于星期三3.4.1 蛋白质组数据库蛋白质组数据库蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。包含所有鉴定的蛋白质信息，如蛋白质的顺序、核苷酸顺序、2D-PAGE、3D结构、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。标准的且可重复的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分析方法使得大规模的蛋白质组研究成为可能，再加上其它技术的辅助(如蛋白质免疫检测、微序列分析、质谱等)，可以获得大量的蛋白质表达的信息。这些信息可以贮存在蛋白质数据库中，并与其它数据库相联接。第31页，讲稿共45张，创作于星期三1.GELBANK网址：http:/gelb
19、ank.anl.gov简介：提供全基因组的二维凝胶电泳图谱，搜集了已知基因组信息生物的蛋白质组二维凝胶电泳图。可通过描述相对分子质量、等电点和蛋白质序列信息进行快速检索。2.SWISS-2DPAGE网址：http:/www.expasy.org/ch2d/简介：提供人类、小鼠、大肠杆菌、酿酒酵母、盘基网柄菌的2D-PAGE参考图。3.SysPIMP(SystematicalPlatformforIdentifyingMutatedProteins)网址：http:/pimp.starflr.info/简介：通过质谱技术建立的蛋白质突变数据库。当蛋白质某一氨基酸残基发生改变时，其质谱图也会发生改
20、变，通过蛋白质质谱图的改变，检测与疾病相关的突变。第32页，讲稿共45张，创作于星期三4.Sys-BodyFluid网址：http:/www.biosino.org/bodyfluid/简介：人体体液蛋白组研究数据库。提供人体各种体液的蛋白质组数据，包括血浆/血清、尿液、乳汁、泪、汗液、唾液、骨髓液、脑脊液、胃液等。5.BloodExpress网址：http:/hscl.cimr.cam.ac.uk/bloodexpress/简介：小鼠造血过程基因表达数据库第33页，讲稿共45张，创作于星期三6.CentrosomeDB(humancentrosomalproteinsdatabase)网址：
21、http:/centrosome.dacya.ucm.es简介：人体中心体蛋白数据库7.ConsensusPathDB网址：http:/cpdb.molgen.mpg.de简介：人类功能作用网络数据库，与多个数据库有交叉应用，提供蛋白质互作、生化反应、基因调控等作用网数据。8.ProteomeAnalysisDatabase网址：http:/www.ebiac.uk.proteome/简介：蛋白质组分析数据库第34页，讲稿共45张，创作于星期三10.HPRD(HumanProteinReferenceDatabase)网址：http:/www.hprd.org/简介：人体蛋白文献数据库11.N
22、OPdb网址：http:/ 研究蛋白质间相互作用的技术研究蛋白质间相互作用的技术免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation）酵母双杂交技术酵母双杂交技术（Yeast two-hybird system）第37页，讲稿共45张，创作于星期三免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法；是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那
23、么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭 档。第38页，讲稿共45张，创作于星期三 酵母双杂交技术酵母双杂交技术（Yeast two-hybird system）酵母的转录激活因子GAL4：N端有一个DNA结合域(DNAbindingdomain，BD)，C端有一个转录激活域(transcriptionactivationdomain，AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单
24、独的DNA结合域或转录激活域不能激活基因转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。第39页，讲稿共45张，创作于星期三酵母双杂交技术酵母双杂交技术第40页，讲稿共45张，创作于星期三4 蛋白质组学的应用蛋白质组学的应用4.1蛋白质组学在心血管疾病中的应用扩张型心肌病扩张型心肌病已有研究发现，人类扩张型心肌病患者心脏中约有100种蛋白质表达异常，其中88种蛋白质丰度显著降低。经蛋白质鉴定大致可分为细胞骨架及肌纤维蛋白、与线粒体及能量产生相关蛋白以及与应激反应相关蛋白三类。这些蛋白质的表达下调可能与心肌收缩功能障碍、心力衰竭的发生有一定关联。缺血性心脏病缺血性心脏病H
25、uang*等对动脉粥样硬化大鼠左心室作了双向电泳分析，并与健康对照组比较，共检测到38个蛋白质点发生变化，并鉴定出12种蛋白质，分别归属于肌凝蛋白、酶、细胞信号转导蛋白、转运蛋白以及其他类型。HuangZY，YangPY，AlmoftiMR，eta1ComparativeanalysisoftheproteomeofleftventricularheartofarteriosclerosisinratsJLifeSci，2004，75(26)：31033115第41页，讲稿共45张，创作于星期三胃癌胃癌蛋白质组学研究发现，健康人胃液中主要检测到的蛋白为胃蛋白酶A、B及胃脂酶，而60的胃癌及大多
26、数慢性萎缩性胃炎患者的胃液中却不能检测到。相反，胃癌患者的-12抗胰蛋白酶明显升高。肝癌肝癌Seow*等对肝细胞癌的几个亚型HepG2、Huh7、Sk-Hepl、Hep3B等与正常组织作比较，创建了一个全面的蛋白质组分析数据库，为肝癌的诊治提供了更完善可靠的依据。ScowTK，LiangRC，LeowCK，eta1Hepatocellularcardnoma：frombedsidetoproteomicsJProteomics，2001，1(10)：1249-12634.2 蛋白质组学在癌症中的应用第42页，讲稿共45张，创作于星期三近几年来，蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞
27、生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。基础研究方面基础研究方面 蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面，蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。应用研究方面应用研究方面5 发展趋势发展趋势技术发展方面技术发展方面 蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以像基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。第43页，讲稿共45张，创作于星期三第44页，讲稿共45张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第45页，讲稿共45张，创作于星期三